液滴數(shù)字PCR在乳腺癌精準(zhǔn)治療中的應(yīng)用

張博誠(chéng) 張顯玉 孫根 綜述 龐達(dá) 審校

·綜 述·

液滴數(shù)字PCR在乳腺癌精準(zhǔn)治療中的應(yīng)用

張博誠(chéng)①?gòu)堬@玉①孫根②綜述 龐達(dá)①審校

在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)大背景下，分子分型指導(dǎo)下的乳腺癌個(gè)體化治療雖已成為常態(tài)，但仍需不斷尋求更加優(yōu)質(zhì)高效的精準(zhǔn)治療方案。液滴數(shù)字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）在稀有基因突變檢測(cè)、拷貝數(shù)變異檢測(cè)以及與下一代測(cè)序技術(shù)相整合等方面，較傳統(tǒng)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢(shì)。本文針對(duì)ddPCR平臺(tái)在不同乳腺癌亞型中的應(yīng)用，以及對(duì)ddPCR技術(shù)助力下的乳腺癌的研究進(jìn)行綜述。

液滴數(shù)字PCR 乳腺癌 精準(zhǔn)治療 基因突變 基因檢測(cè)

精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)是指根據(jù)個(gè)體的分子變異指導(dǎo)疾病的預(yù)防和治療。腫瘤的精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)研究是整合臨床信息和分子生物學(xué)技術(shù)，鑒定與腫瘤生物學(xué)行為和治療應(yīng)答密切相關(guān)的分子標(biāo)志物，并在設(shè)計(jì)合理的臨床試驗(yàn)中用于驗(yàn)證，指導(dǎo)腫瘤的精準(zhǔn)分型和治療。乳腺癌是一種高度異質(zhì)性的腫瘤，由分子分型指導(dǎo)的治療近年來(lái)已取得初步成效，但乳腺癌的耐藥和異質(zhì)性問(wèn)題目前仍是其基礎(chǔ)和臨床研究面臨的巨大挑戰(zhàn)。第二代實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）最大的技術(shù)瓶頸依然是依賴(lài)Ct值、PCR擴(kuò)增效率以及標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，所謂的“定量”也只是相對(duì)、間接的，而且在目標(biāo)核酸分子豐度低、樣本間模板濃度差異細(xì)微的情況下，qPCR的檢測(cè)靈敏度、精確度都受到了限制，已不能滿(mǎn)足生命科學(xué)研究應(yīng)用發(fā)展的需求。在這樣的背景下，液滴數(shù)字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。本文就對(duì)不同乳腺癌亞型中ddPCR的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 ddPCR原理及優(yōu)勢(shì)

ddPCR是一種檢測(cè)核酸分子的絕對(duì)定量技術(shù)，ddPCR微滴發(fā)生器可將含有核酸分子的熒光PCR反應(yīng)體系“分割”成數(shù)萬(wàn)個(gè)納升級(jí)的微滴，核酸分子在各微滴中隨機(jī)分裝，每個(gè)微滴或不含、或含有至少一個(gè)目標(biāo)核酸分子，每個(gè)微滴都是一個(gè)獨(dú)立的PCR反應(yīng)器（圖1）。經(jīng)PCR擴(kuò)增后，微滴分析儀逐個(gè)對(duì)每個(gè)微滴進(jìn)行檢測(cè)，有熒光信號(hào)的微滴判讀為“1”，無(wú)熒光信號(hào)的微滴判讀為“0”，從而將熒光模擬信號(hào)數(shù)字化；最終根據(jù)泊松分布原理以及陽(yáng)性微滴的比例，通過(guò)分析軟件可直接給出目標(biāo)核酸分子的拷貝數(shù)濃度，因此不需要檢測(cè)熒光信號(hào)與設(shè)定閾值線(xiàn)的交點(diǎn)，完全不依賴(lài)于Ct值的鑒定，所以ddPCR受擴(kuò)增效率的影響大幅度降低，對(duì)PCR反應(yīng)抑制物的耐受能力大幅度提高［1］。

ddPCR微滴化的過(guò)程可降低與具有競(jìng)爭(zhēng)性作用的目標(biāo)序列的濃度，實(shí)現(xiàn)稀有序列的富集以及痕量核酸檢測(cè)。由于ddPCR采取終點(diǎn)判讀的方法，在引物設(shè)計(jì)過(guò)程中可減少因擴(kuò)增效率不合要求而造成的浪費(fèi)（時(shí)間、樣品、耗材等）?？截悢?shù)變異（copy num?ber various，CNVs）研究需要極高的精度以區(qū)別不同拷貝數(shù)之間的微小差異，ddPCR通過(guò)直接計(jì)數(shù)目標(biāo)基因與參照基因（已知拷貝數(shù)）的數(shù)目并計(jì)算比值，即可得到目標(biāo)基因的拷貝數(shù)［2］。目前對(duì)于檢測(cè)血漿游離DNA（cell-free DNA，cfDNA）技術(shù)上可分為下一代測(cè)序（next-generation sequencing，NGS）和ddPCR兩種平臺(tái)。近年來(lái)NGS技術(shù)飛速發(fā)展，為進(jìn)一步發(fā)揮NGS技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，ddPCR可有效驗(yàn)證NGS技術(shù)捕獲的基因突變，并且可較好地整合實(shí)驗(yàn)流程（圖2），建立目標(biāo)測(cè)序、個(gè)體生物標(biāo)志物開(kāi)發(fā)、化療后外周血檢測(cè)的完整研究路線(xiàn)［3］。

圖1 ddPCR基本原理Figure 1 Basic principles of ddPCR

圖2 ddPCR與NGS技術(shù)相互整合Figure 2 Integration of ddPCR and NGS technology

2 ddPCR在不同乳腺癌亞型中的應(yīng)用

2.1 激素受體陽(yáng)性乳腺癌

目前，約2/3的浸潤(rùn)性乳腺癌為L(zhǎng)uminal A或B型，即激素受體（hormone receptor，HR）陽(yáng)性乳腺癌，ddPCR在這兩型乳腺癌中的研究主要是圍繞內(nèi)分泌治療（endocrine therapy，ET）的耐藥問(wèn)題，缺乏獨(dú)立分型研究，故本文以HR陽(yáng)性乳腺癌進(jìn)行論述。在HR陽(yáng)性轉(zhuǎn)移性乳腺癌中，雖然ET為一線(xiàn)治療［4］，但是在反復(fù)的ET中腫瘤均產(chǎn)生了對(duì)雌激素的抵抗力，變成非激素依賴(lài)型。近年來(lái)，雌激素受體1（estrogen re?ceptor 1，ESR1）激活突變是研究的熱點(diǎn)。通過(guò)NGS技術(shù)，發(fā)現(xiàn)ESR1突變的富集區(qū)在537號(hào)酪氨酸和538號(hào)天冬氨酸，即ESR1 Y537S、Y537N、Y537C、D538G，涵蓋80%以上ESR1突變，并與ET抵抗相關(guān)［5-7］。為將這些發(fā)現(xiàn)的突變位點(diǎn)作為一種ET抵抗的生物標(biāo)志物，應(yīng)在疾病進(jìn)展時(shí)同步進(jìn)行ESR1基因型分析，cfD?NA分析就是為克服組織活檢不便而建立的方法。為了在極少量的cfDNA中獲取ESR1突變頻率并證明其臨床作用價(jià)值，在10%～30%ET耐藥的HR陽(yáng)性轉(zhuǎn)移性乳腺癌中，應(yīng)用NGS技術(shù)確認(rèn)ESR1-LBD基因出現(xiàn)突變富集［5-6］，在原發(fā)性乳腺腫瘤（primary breast tumor，PBT）中普遍認(rèn)為ESR1突變頻率非常低（＜1%）或檢測(cè)不到。Wang等［8］采用ddPCR技術(shù)，在43例PBT中發(fā)現(xiàn)ESR1 Y537S、Y537C、D538G也存在7%（3/43）的等位基因突變。同樣，Takeshita等［9］在270例PBT中發(fā)現(xiàn)ESR1突變頻率為2.6%（7/270）。這兩項(xiàng)研究結(jié)果表明，ESR1突變頻率在PBT中或NGS技術(shù)檢測(cè)的閾值之下，也充分證明了ddPCR進(jìn)行痕量檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)，以及選擇不同的cut-off值可能會(huì)帶來(lái)不同的分析結(jié)果。另外，Wang等［8］對(duì)4例患者cfDNA中ESR1突變頻率進(jìn)行了持續(xù)的監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)在治療的過(guò)程中ESR1等位基因突變頻率發(fā)生改變，揭示了ddPCR監(jiān)測(cè)腫瘤負(fù)荷的潛能，可及時(shí)調(diào)整ET方案。

目前，在輔助治療階段因缺乏系統(tǒng)的基因組跟蹤隨訪(fǎng)，輔助治療中或治療后HR陽(yáng)性乳腺癌患者擔(dān)心復(fù)發(fā)。Gu等［10］提出這樣一種治療方式，即在基線(xiàn)期采集HR陽(yáng)性乳腺癌患者的腫瘤組織及血液樣本，應(yīng)用NGS技術(shù)檢測(cè)相關(guān)腫瘤基因突變；新輔助治療后，應(yīng)用ddPCR檢測(cè)相應(yīng)的腫瘤組織和血液樣本，同時(shí)與相匹配的基線(xiàn)期樣本進(jìn)行基因突變頻率比較；術(shù)后則通過(guò)cfDNA進(jìn)行基因突變狀態(tài)監(jiān)測(cè)。ESR1突變可采用ddPCR評(píng)估，其他新出現(xiàn)的驅(qū)動(dòng)基因突變或亞克隆衍變可采用NGS技術(shù)捕獲。若ESR1等位基因突變頻率增加，ET方案則相應(yīng)調(diào)整，這種治療方式或更符合精準(zhǔn)醫(yī)療的理念。

2.2 HER-2陽(yáng)性乳腺癌

人表皮生長(zhǎng)因子-2（human epidermal growth fac?tor receptor-2，HER-2），又稱(chēng)c-erbB-2基因，定位于染色體17q12-21.32上，HER-2過(guò)表達(dá)可激活表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor receptor，EGFR）的信號(hào)通路并促進(jìn)EGFR介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化和腫瘤的發(fā)生。隨著靶向治療在臨床中的成功應(yīng)用，HER-2狀態(tài)的精準(zhǔn)檢測(cè)顯得尤為重要。目前，免疫組織化學(xué)（IHC）與熒光原位雜交（FISH）法作為HER-2過(guò)表達(dá)診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，仍在臨床檢測(cè)中存在一些技術(shù)問(wèn)題。IHC的結(jié)果判定易受檢驗(yàn)者主觀(guān)因素的影響，而FISH存在操作繁瑣耗時(shí)、價(jià)格昂貴、參比位點(diǎn)17號(hào)染色體著絲粒（CEP17）狀態(tài)并不等同于17號(hào)染色體的狀態(tài)等問(wèn)題，另外由于方法學(xué)本身的局限性，IHC和FISH的檢測(cè)結(jié)果均有不確定性。因此，需要更精準(zhǔn)、客觀(guān)、高效的HER-2檢測(cè)平臺(tái)。ddPCR對(duì)石蠟包埋組織（for?malin-fixed and paraffin-embedded tissues，F(xiàn)FPET）進(jìn)行HER-2基因轉(zhuǎn)錄水平［11］及CNVs［12］精準(zhǔn)檢測(cè)的臨床應(yīng)用潛力已得到證實(shí)。Belgrader等［12］應(yīng)用ddPCR對(duì)39例DNA已高度降解的FFPET進(jìn)行HER-2檢測(cè)，結(jié)果顯示10例樣本中HER-2陽(yáng)性，29例樣本中HER-2陰性，這與FISH及IHC結(jié)果完全一致。

ddPCR同樣適用于在cfDNA中檢測(cè)HER-2的CNVs。Gevensleben等［13］選擇1.25作為cut-off值，結(jié)果顯示在11例FISH及IHC確認(rèn)的HER-2陽(yáng)性樣本中，ddPCR檢出的HER-2陽(yáng)性率為64%（7/11），在47例FISH及IHC確認(rèn)的HER-2陰性樣本中，ddPCR檢出的HER-2陰性率為94%（44/47）。其中FISH及IHC檢測(cè)的組織均源于PBT，3個(gè)假陽(yáng)性結(jié)果的分析顯示可能是因參照基因少量的丟失，或這些患者腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移后真的獲得了HER-2的擴(kuò)增；3個(gè)假陰性結(jié)果的分析表明這種不一致性可能反映了基因組HER-2狀態(tài)的改變，因所有假陰性結(jié)果的患者在腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移后均接受過(guò)抗HER-2治療，可能導(dǎo)致腫瘤內(nèi)部異質(zhì)性的選擇而變成非HER-2擴(kuò)增型。Gar?cia-Murillas等［14］選擇2.0為cut-off值，結(jié)果顯示在18例FISH及IHC確認(rèn)的HER-2陽(yáng)性樣本中，ddPCR檢出的HER-2陽(yáng)性率為100%（18/18），在58例FISH及IHC確認(rèn)的HER-2陰性樣本中，ddPCR檢出的HER-2陰性率為98%（57/58），敏感性和特異性分別為100%和98%。應(yīng)用ddPCR對(duì)HER-2的CNVs開(kāi)展精準(zhǔn)檢測(cè)，理論依據(jù)充分，為下一步臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

近期一項(xiàng)關(guān)于胃癌的HER-2研究中［15］，采用ddPCR對(duì)cfDNA中HER-2狀態(tài)進(jìn)行持續(xù)監(jiān)測(cè)，揭示術(shù)前、術(shù)后或復(fù)發(fā)時(shí)HER-2狀態(tài)的變化。提示曲妥珠單抗的治療或具有時(shí)間和空間異質(zhì)性，在治療的過(guò)程中或因遺傳分化伴隨著腫瘤衍變，亦或化療引起腫瘤內(nèi)部異質(zhì)性的選擇，造成HER-2狀態(tài)的改變，從而影響臨床治療決策。應(yīng)用ddPCR對(duì)乳腺癌圍手術(shù)期、化療或轉(zhuǎn)移前后HER-2狀態(tài)進(jìn)行持續(xù)監(jiān)測(cè)值得借鑒。

2.3 三陰性乳腺癌

三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TN?BC）是一種雌激素受體、孕激素受體和HER-2均不表達(dá)的乳腺癌亞型，因此不能從現(xiàn)有的ET及靶向治療中獲益?，F(xiàn)階段，化療是TNBC的標(biāo)準(zhǔn)治療，但其復(fù)發(fā)率及病死率仍較高［16］。TNBC是一種高度異質(zhì)性的腫瘤，目前分子病理和基因表達(dá)譜是識(shí)別TNBC亞型、尋找新的治療靶點(diǎn)以及發(fā)現(xiàn)體細(xì)胞基因突變的公認(rèn)方式［17］。

PIK3CA是近年來(lái)致癌基因的研究熱點(diǎn)，編碼磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3 kinases，PI3Ks）信號(hào)通路中的p110復(fù)合物。在乳腺癌中PIK3CA突變占20%～40%［18］，是繼TP53基因之后第二常見(jiàn)的突變基因。一項(xiàng)Meta分析表明，PIK3CA突變的臨床意義依據(jù)不同的乳腺癌表面受體類(lèi)型而不同［19］。臨床上已證實(shí)，PIK3CA突變本身對(duì)于HR陽(yáng)性乳腺癌患者預(yù)后價(jià)值有限［20］，但在TNBC中關(guān)于PIK3CA突變的臨床意義鮮有報(bào)道。

現(xiàn)已證實(shí)在TNBC中雄激素受體（AR）與PI3Ks信號(hào)通路相關(guān)，包括PIK3CA突變［21］，但AR表達(dá)與TNBC預(yù)后關(guān)系尚存爭(zhēng)議。因此，在TNBC中檢測(cè)PIK3CA突變對(duì)其預(yù)后以及對(duì)AR信號(hào)通路的影響具有重要意義。Takeshita等［22］應(yīng)用ddPCR首先對(duì)49例血液樣本及42例相對(duì)應(yīng)的腫瘤組織樣本中PIK3CA突變頻率進(jìn)行分析，結(jié)果顯示二者之間并不相關(guān)，但這并不有損ddPCR的準(zhǔn)確性。原因?yàn)椋?）每個(gè)樣本中的PIK3CA突變陽(yáng)性及陰性已均由ddPCR系統(tǒng)Bio?Mark［23］證實(shí)；2）研究結(jié)果反映日益凸顯的腫瘤異質(zhì)性問(wèn)題，ESR1突變頻率在cfDNA中與腫瘤組織中的檢測(cè)結(jié)果不同，可能是由腫瘤異質(zhì)性所引起［24］；3）采取Cox多元風(fēng)險(xiǎn)模型分析患者的生存情況，結(jié)果顯示在cfDNA中PIK3CA突變組較野生組可顯著延長(zhǎng)無(wú)復(fù)發(fā)生存時(shí)間［22］。在cfDNA中PIK3CA有望作為一種腫瘤標(biāo)記物，用于評(píng)估TNBC輔助治療的療效。

3 結(jié)語(yǔ)

乳腺癌是高度異質(zhì)性的腫瘤，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，更多的乳腺癌易感基因及驅(qū)動(dòng)基因逐漸被發(fā)現(xiàn)。ddPCR技術(shù)帶來(lái)了全新的技術(shù)思路和研究手段，相比qPCR具有更出色的靈敏度、特異性和精確性，并且可與NGS技術(shù)相互補(bǔ)充整合。目前，已普遍認(rèn)可ddPCR技術(shù)在痕量核酸檢測(cè)、稀有基因突變檢測(cè)及CNVs研究方面的技術(shù)優(yōu)勢(shì)。通過(guò)ddPCR平臺(tái)，持續(xù)監(jiān)測(cè)HR陽(yáng)性乳腺癌患者的ET耐藥的驅(qū)動(dòng)基因，精準(zhǔn)檢測(cè)HER-2陽(yáng)性乳腺癌患者中的CNVs，及與NGS技術(shù)協(xié)同發(fā)現(xiàn)并確認(rèn)TNBC治療的新靶點(diǎn)等方面都具有重要意義，并有助于進(jìn)行更高層次的乳腺癌分子生物學(xué)研究。

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（2016-11-10收稿）

（2017-01-19修回）

Application of droplet digital PCR in the precision treatment of breast cancer

Bocheng ZHANG,Xianyu ZHANG,Gen SUN,Da PANG

Da PANG;E-mail:pangdasir@163.com

In the context of precision medicine,although individual treatment of breast cancer under the guidance of molecular classification has become the norm,a precision treatment program with increased efficiency and quality is still required.Compared with the traditional real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction(PCR),the droplet digital PCR(ddPCR)has obvious advantages in the detection of rare mutations and copy number variations,as well as the integration with the second-generation-sequencing technology.This paper reviews the application of a ddPCR platform in different breast cancer subtypes and explores new horizons of breast cancer research through the ddPCR technology.

droplet digital PCR,breast cancer,precision treatment,gene mutation,gene detection

10.3969/j.issn.1000-8179.2017.03.300

①哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院乳腺外科（哈爾濱市150081）；②肇東市人民醫(yī)院外科

龐達(dá) pangdasir@163.com

Department of Breast Cancer Surgery,Harbin Medical University Cancer Hospital,Harbin 150081,China

張博誠(chéng) 專(zhuān)業(yè)方向?yàn)槿橄倌[瘤相關(guān)臨床及基礎(chǔ)研究。

E-mail：hmubocheng@163.com