重組溶瘤單純皰疹病毒oHSV2治療結(jié)直腸癌的實(shí)驗(yàn)研究*

尹磊 孫燕來(lái) 趙春紅 李增軍 甄亞男 肖瑞雪 徐忠法

·基礎(chǔ)研究·

重組溶瘤單純皰疹病毒oHSV2治療結(jié)直腸癌的實(shí)驗(yàn)研究*

尹磊①②③孫燕來(lái)②趙春紅③李增軍②甄亞男③肖瑞雪③徐忠法③

目的：評(píng)估重組溶瘤單純皰疹病毒oHSV2在CT26結(jié)腸癌荷瘤小鼠中的抗腫瘤效果，初步探討其治療機(jī)制。方法：構(gòu)建CT26細(xì)胞荷瘤小鼠腫瘤模型。1）小鼠瘤內(nèi)注射oHSV2，ELISA法測(cè)定血清中粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte-macro?phage colony-stimulating factor，GM-CSF）濃度；2）荷瘤小鼠分為oHSV2組、5-氟尿嘧啶（5-FU）組（陽(yáng)性對(duì)照組）、磷酸鹽緩沖液（PBS）組（陰性對(duì)照組）。給藥后，記錄小鼠體質(zhì)量、腫瘤體積、生存期及生活狀態(tài)等變化，評(píng)估病毒抗腫瘤效果；3）流式細(xì)胞術(shù)定量檢測(cè)腫瘤引流淋巴結(jié)（tumor-draining lymphnode，TDLN）內(nèi)樹(shù)突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）及瘤體內(nèi)CD4+T與CD8+T的比例。結(jié)果：1）瘤內(nèi)注射oHSV2后，血清中的GM-CSF濃度不斷升高。首次給藥后第8天出現(xiàn)高峰（3150±327.1）pg/mL，后緩慢下降；2）相比PBS組，oHSV2和5-FU組均表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤效果，小鼠生存期顯著延長(zhǎng)（50 d vs.36 d，P＜0.01；51 d vs.36 d，P＜0.01），但oHSV2治療未引起小鼠體質(zhì)量下降。治療起始第28天，5-FU組平均體質(zhì)量較PBS組有顯著性差異（16.61 g vs.22.07 g，P＜0.01），oHSV2組與PBS組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），且小鼠病毒注射區(qū)皮膚無(wú)壞死、潰瘍；3）流式分析結(jié)果顯示相比PBS組，oHSV2治療組的DC（6.49%vs.3.73%，P＜0.01），CD4+T（15%vs.8.57%，P＜0.01）與CD8+T（8.19%vs.5.15%，P＜0.01）比例升高。而5-FU組各細(xì)胞比例較PBS組明顯降低（P＜0.05）。結(jié)論：瘤內(nèi)注射oHSV2有效抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)，病毒治療與化療藥物相比不伴有明顯的毒副反應(yīng)。病毒在荷瘤小鼠體內(nèi)復(fù)制產(chǎn)生具有生物活性的GM-CSF，可增強(qiáng)抗腫瘤免疫。

結(jié)直腸癌 溶瘤病毒 粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子 免疫治療

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是常見(jiàn)消化道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率不斷上升［1］。結(jié)直腸癌患者有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者5年生存率僅12%［2］，且超過(guò)20%的患者在確診時(shí)已經(jīng)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［3］，死亡率居所有腫瘤的第4位［4］。目前，結(jié)直腸癌的治療策略主要包括手術(shù)、放化療及靶向治療，但治療效果均一般［5-6］。因此，結(jié)直腸癌治療策略需要開(kāi)展新的方案。

近年來(lái)，腫瘤生物療法不斷發(fā)展成熟。2015年10月，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）正式批準(zhǔn)溶瘤Ⅰ型單純皰疹病毒T-VEC治療黑色素瘤［7］。與傳統(tǒng)腫瘤治療方法不同，溶瘤病毒（oncolytic viruses，OVs）是天然或經(jīng)人工改造的能特異殺傷腫瘤細(xì)胞的一類(lèi)病毒。目前研究表明，Ⅱ型單純皰疹病毒其優(yōu)勢(shì)為：1）病毒基因內(nèi)有一區(qū)域可活化Ras/MEK/MAPK通路，為病毒有效復(fù)制所必需的［8］；2）病毒分泌G糖蛋白和病毒宿主關(guān)閉蛋白，參與逃避宿主免疫，提高病毒的復(fù)制效率［9］；3）病毒可使被感染的腫瘤細(xì)胞形成合胞體（syncytia），增強(qiáng)抗腫瘤免疫［10］；4）被改造的Ⅱ型溶瘤單純皰疹病毒FusOn-H2可感染殺傷多種腫瘤細(xì)胞并能誘導(dǎo)產(chǎn)生腫瘤特異性的細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）［11］；5）較Ⅰ型單純皰疹溶瘤病毒，Ⅱ型可在很低的感染復(fù)數(shù)下殺傷癌細(xì)胞，使病毒治療更為安全。

oHSV2刪除HSV-2中的ICP34.5和ICP47基因，并插入粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（granulocytemacrophage colony-stimulating factor，GM-CSF）基因。刪除ICP34.5基因使病毒選擇性地在腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和消除病毒的致病性［12］。刪除ICP47基因可促進(jìn)腫瘤抗原遞呈和提高病毒的選擇性殺傷作用［13］。GM-CSF能招募和活化抗原提呈細(xì)胞（antigen presenting cell，APC）［14］，誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性的CTL殺傷腫瘤細(xì)胞。本研究首次評(píng)估oHSV2在結(jié)直腸癌荷瘤小鼠中的抗腫瘤效果，并探討可能涉及的抑瘤機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 構(gòu)建重組Ⅱ型單純皰疹溶瘤病毒 oHSV2由湖北科技學(xué)院劉濱磊教授構(gòu)建［15］，由武漢濱會(huì)生物科技股份有限公司生產(chǎn)提供。

1.1.2 細(xì)胞和試劑 BALB/c小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞系CT26購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。RPM 1640培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；小牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程科技有限公司；二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；5氟尿嘧啶（5-FU）購(gòu)自Medchem Express?公司；GM-CSF ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)R＆amp;D System公司；脫氧核糖核酸酶Ⅰ（DnaseⅠ）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，Ⅰ型膠原酶（Collagenase，type 1）購(gòu)自上海Cisbio公司；各種流式用熒光素標(biāo)記的小鼠單抗CD3-PE-cy5、CD4-FITC、CD8-PE、CD11c-FITC、CD86-PE及其同型對(duì)照均購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司。

1.1.3 細(xì)胞培養(yǎng) CT26細(xì)胞用含有10%小牛血清的RPM 1640培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)液中加1%青鏈雙抗，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及模型建立 5周齡雌性BALB/c小鼠（SPF級(jí)）購(gòu)自山東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK20140007）。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合山東大學(xué)附屬山東省腫瘤醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)章程并獲得委員會(huì)批準(zhǔn)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期CT26細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA消化制備成單細(xì)胞懸液，無(wú)血清RPM 1640調(diào)整細(xì)胞密度5×106/mL，取100 μL注射于小鼠右側(cè)背部皮下，觀察腫瘤的生長(zhǎng)情況。約1周后腫瘤直徑達(dá)5～6 mm時(shí)，即可將荷瘤小鼠隨機(jī)分組。

1.2.2 oHSV2在小鼠模型中表達(dá)GM-CSF的檢測(cè) 12只BALB/c小鼠按上述方法荷瘤后，隨機(jī)分為oHSV2組（6只）和磷酸鹽緩沖液（PBS）組（陰性對(duì)照組6只）。oHSV2瘤內(nèi)注射（通過(guò)一個(gè)注射點(diǎn)多部位給藥），每次劑量為1×106pfu/100 μL，于第0、2、4、6天給藥（以分組及第一次治療為起始）。陰性對(duì)照組瘤內(nèi)注射PBS，劑量100 μL，注射次數(shù)與oHSV2相同。首次給藥后的第2、4、6、8、10、15、20天行小鼠眶靜脈采血，血樣本以4 000 r/min、離心5 min，取血清，用GM-CSF ELISA檢測(cè)試劑盒測(cè)定血清中GM-CSF含量（pg/mL）。

1.2.3 oHSV2治療荷瘤小鼠的療效觀察 45只BALB/c小鼠按上述方法荷瘤后，隨機(jī)分為oHSV2組（15只）、5-FU組（15只）、PBS組（15只）。oHSV2、PBS注射方法及劑量同上。5-FU劑量75 mg/kg，腹腔注射，于第0、6天給藥。每隔4 d測(cè)量小鼠腫瘤體積及小鼠體質(zhì)量。觀察小鼠生活狀態(tài)及注射部位皮膚有無(wú)壞死。腫瘤體積（mm3）=（長(zhǎng)×寬2）/2。小鼠生存期觀察至首次給藥后第60天。

1.2.4 oHSV2治療對(duì)荷瘤小鼠免疫影響 在首次給藥后第10天，從上述3組小鼠中隨機(jī)抽出9只荷瘤小鼠（每組3只）行腫瘤引流淋巴結(jié)（tumor-draining lym?phnode，TDLN）內(nèi)樹(shù)突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）和瘤體內(nèi)CD4+T與CD8+T比例檢測(cè)。各組荷瘤小鼠處死后，分離TDLN，用300目篩網(wǎng)分組研磨制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/mL，各取100 μL加入流式管，然后加入熒光素標(biāo)記抗體CD11c-FITC、CD86-PE室溫避光孵育30 min，細(xì)胞染色緩沖液洗滌2次，BD流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)［16］。調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/mL，各取100 μL加入流式管，然后加入熒光素標(biāo)記抗體CD3-PE-cy5、CD4-FITC、CD8-PE，室溫避光孵育30 min，細(xì)胞染色緩沖液洗滌2次，BD流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。每種抗體均設(shè)有同型對(duì)照以消除抗體非特異性結(jié)合。所有樣本結(jié)果用FlowJo軟件分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。定量數(shù)據(jù)結(jié)果均以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析。采用Kaplan-Meier法及Log rank檢驗(yàn)比較不同治療組荷瘤鼠之間的生存時(shí)間。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GM-CSF在荷瘤小鼠體內(nèi)表達(dá)檢測(cè)

oHSV2給藥后第2天檢測(cè)到GM-CSF的表達(dá)，血清中的含量為（170±35.78）pg/mL。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，GMCS的表達(dá)逐漸升高，在第8天出現(xiàn)高峰，含量為（3150± 327.1）pg/mL。隨后，GM-CSF表達(dá)量逐漸降低，在第20天，血清中的濃度為（266.67±53.17）pg/mL。PBS組在各個(gè)時(shí)點(diǎn)的血清中均未檢測(cè)到GM-CSF（圖1）。

2.2 oHSV2抑制腫瘤生長(zhǎng)而不伴有明顯毒副作用

在首次治療后第28天，PBS組荷瘤小鼠平均體積為（2 197.67±121.97）mm3，oHSV2組平均腫瘤體積為（1 439.17±107.39）mm3，與對(duì)照組有顯著性差異（P＜0.01）。5-FU組平均腫瘤體積為（1 309.53± 124.53）mm3，與對(duì)照組有顯著性差異（P＜0.01），但兩治療組間腫瘤平均體積差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.08，圖2A）。5-FU治療后，小鼠體質(zhì)量持續(xù)下降，在首次治療后的第28天，荷瘤小鼠平均體質(zhì)量為（16.61± 0.74）g，與PBS組有顯著性差異（P＜0.01）。oHSV2組和PBS組荷瘤小鼠體質(zhì)量均逐漸上升，在第28天體質(zhì)量分別為（21.16±0.68）g、（22.07±0.54）g，兩組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖2B）。在病毒瘤內(nèi)注射治療期間，小鼠未出現(xiàn)與治療相關(guān)死亡，病毒注射部位及瘤周皮膚未發(fā)生壞死、潰瘍。與陰性對(duì)照組相比（中位生存期為36 d），治療組均顯著延長(zhǎng)小鼠中位生存期（圖2C）。其中5-FU治療組小鼠中位生存期為51 d（P＜0.01），溶瘤病毒治療組小鼠中位生存期為50 d（P＜0.01）。但兩治療組間的小鼠中位生存期差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.55）。

2.3 oHSV2對(duì)荷瘤小鼠免疫影響

本研究通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC及T淋巴細(xì)胞比例變化。與PBS組相比，5-FU降低了TDLN內(nèi)的DC比例（2.04%vs.3.73%，P＜0.05）。但oHSV2治療組DC的平均比例則顯著升高（6.49%vs.3.73%，P＜0.01）。同樣，5-FU組小鼠瘤內(nèi)CD4+T和CD8+T細(xì)胞比例相對(duì)于PBS組也明顯降低（4.17%vs.8.57%，P＜0.05；2.98%vs.5.15%，P＜0.05）。而瘤體內(nèi)T淋巴細(xì)胞比例在病毒組則顯著提高（15%和8.19%，P＜0.01，圖3）。

圖1 血清中GM-CSF的含量變化Figure 1 GM-CSF serum concentrations over time following intratumoral injection of oHSV2 in tumor-bearing mice

圖2 oHSV2有效抑制CT26移植瘤生長(zhǎng)Figure 2 oHSV2 suppresses growth of CT26 colorectal tumors in mice

圖3 oHSV2增強(qiáng)荷瘤小鼠抗腫瘤免疫Figure 3 oHSV2 increased antitumor immunity in vivo

3 討論

目前，結(jié)直腸癌的治療仍然是一個(gè)復(fù)雜而具有挑戰(zhàn)性的臨床問(wèn)題。遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、化療耐藥、反復(fù)復(fù)發(fā)使得結(jié)直腸癌患者的預(yù)后較差。利用病毒治療癌癥是一種新穎的，具有發(fā)展前景的抗腫瘤方法。本實(shí)驗(yàn)首次研究Ⅱ型溶瘤單純皰疹病毒oHSV2治療結(jié)直腸癌，選用傳統(tǒng)結(jié)直腸癌化療藥物5-FU作為陽(yáng)性對(duì)照組，更直接的觀察病毒的抑瘤效果。

本研究結(jié)果顯示，與PBS組相比，oHSV2組的小鼠腫瘤體積增長(zhǎng)趨勢(shì)明顯下降，中位生存期明顯延長(zhǎng)，與5-FU藥物的治療效果相當(dāng)。從臨床角度看，oHSV2可能是結(jié)直腸癌理想的治療方式，尤其對(duì)于低位直腸癌，復(fù)雜的盆腔結(jié)構(gòu)以及腫瘤鄰近肛門(mén)括約肌使得局部注射溶瘤病毒更加方便、有效［17］。在治療過(guò)程中，病毒組小鼠體質(zhì)量一直穩(wěn)定增加，未發(fā)生與治療相關(guān)的死亡，小鼠注射區(qū)域皮膚也未見(jiàn)潰瘍、壞死。這表明oHSV2治療較安全，毒副反應(yīng)較少［18］。基礎(chǔ)化療藥5-FU雖表現(xiàn)出積極的抗腫瘤效應(yīng)，但由于化療藥物常伴有一定的毒副反應(yīng)，其在殺傷腫瘤的同時(shí)，也引起小鼠體質(zhì)量的下降。在臨床上，患者接受化療時(shí)出現(xiàn)體質(zhì)量下降將影響預(yù)后［19］。

腫瘤的形成與發(fā)展有多種機(jī)制的參與，其中包括免疫抑制和免疫逃避［20］。腫瘤迅速發(fā)展的免疫抑制可導(dǎo)致臨床治療失?。?1］。GM-CSF是具有多種免疫調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞因子，能激活持久、特異的抗腫瘤免疫，其作用主要是刺激抗原遞呈細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的分化和活化。DC是最主要的抗原遞呈細(xì)胞，在瘤體內(nèi)，未成熟的DC捕獲腫瘤抗原，加工處理后遷移到區(qū)域淋巴結(jié)分化為成熟的DC并通過(guò)MHCⅡ類(lèi)分子將腫瘤抗原呈遞給CD4+T，通過(guò)MHCⅠ類(lèi)分子將腫瘤抗原呈遞給腫瘤特異性CD8+T。研究表明單純皰疹病毒載體搭載GM-CSF治療小鼠結(jié)直腸癌模型比單獨(dú)應(yīng)用病毒載體療效更顯著［22-23］。在前期體外實(shí)驗(yàn)中，本研究發(fā)現(xiàn)oHSV2無(wú)論是高代次還是低代次均能高效表達(dá)GM-CSF，顯示出良好的生物學(xué)穩(wěn)定性［24］。感染病毒的荷瘤小鼠在第2天血清中檢測(cè)到GM-CSF，并在第8天出現(xiàn)表達(dá)高峰，隨后逐漸降低。而對(duì)照組血清中則一直未檢測(cè)到。這表明oHSV2瘤內(nèi)復(fù)制表達(dá)GM-CSF基因?qū)е卵褐蠫M-CSF增多。和其他溶瘤病毒一樣，機(jī)體產(chǎn)生的抗病毒免疫會(huì)致使oHSV2被清除［25］，這也是血清GM-CSF濃度在完成注射后下降的主要原因。故溶瘤病毒不宜單獨(dú)應(yīng)用于治療腫瘤，而是作為合理設(shè)計(jì)的聯(lián)合治療方案的一部分［26］。

免疫調(diào)節(jié)功能是通過(guò)GM-CSF調(diào)節(jié)CD11c陽(yáng)性DC而展現(xiàn)的，而CD86陽(yáng)性的DC才能成功激活和增殖T淋巴細(xì)胞［27］。TDLN單細(xì)胞懸液流式分析顯示，與對(duì)照組相比，oHSV2組DC的比例顯著提高。因此，瘤內(nèi)注射oHSV2可導(dǎo)致局部GM-CSF積聚，吸引和促進(jìn)DC的成熟。為了驗(yàn)證DC的功能，本研究檢測(cè)了瘤體內(nèi)的T淋巴細(xì)胞比例，結(jié)果顯示oHSV2治療后的小鼠瘤體內(nèi)CD4+T與CD8+T比例顯著升高。在腫瘤微環(huán)境中，CD4+T細(xì)胞能分泌多種細(xì)胞因子和表達(dá)表面分子發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。CD8+T在細(xì)胞免疫中至關(guān)重要，通過(guò)直接殺傷作用清除腫瘤細(xì)胞。研究結(jié)果同其他搭載GM-CSF的溶瘤病毒［28］。但在5-FU組，DC和T淋巴細(xì)胞均顯著減少。一方面這可能因?yàn)榛熕幬锎龠M(jìn)細(xì)胞凋亡，DC在這種非炎癥環(huán)境下不能激活［29］。另一方面，和其他化療藥物一樣，應(yīng)用5-FU導(dǎo)致免疫抑制、淋巴細(xì)胞增殖受限［30］。因此，oHSV2通過(guò)調(diào)節(jié)GM-CSF的表達(dá)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性的抗腫瘤免疫是抑制腫瘤增殖的重要原因。

綜上所述，oHSV2瘤內(nèi)注射后有效抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖而不伴有明顯毒副反應(yīng)。病毒體內(nèi)復(fù)制表達(dá)具有生物活性的GM-CSF可誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性的抗腫瘤免疫。因此，oHSV2可以通過(guò)直接溶瘤效應(yīng)［15］和促進(jìn)免疫系統(tǒng)殺傷癌細(xì)胞的雙重機(jī)制來(lái)治療腫瘤。這將為oHSV2聯(lián)合其他腫瘤治療方案在結(jié)直腸癌治療中的應(yīng)用提供新的思路和方向，并為進(jìn)一步闡明oHSV2對(duì)結(jié)直腸癌的療效奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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（2016-09-19收稿）

（2017-02-03修回）

（編輯：武斌 校對(duì)：孫喜佳）

Preclinical evaluation of recombinant herpes simplex virus oHSV2 in colorectal cancer

Lei YIN1,2,3,Yanlai SUN2,Chunhong ZHAO3,Zengjun LI2,Yanan ZHEN3,Ruixue XIAO3,Zhongfa XU3
Correspondence to:Zhongfa XU;E-mail:xzf2216@126.com

1School of Medicine and Life Sciences,University of Ji'nan-Shandong Academy of Medical Sciences,Jinan 250022,China;2Fourth Surgical Department,Shandong Tumor Hospital Affiliated to Shandong University,Jinan 250117,China;3Second Surgical Department,Affiliated Hospital of Shandong Academy of Medical Sciences,Jinan 250031,China

This study was supported by the Science and Technology Development Projects of Shandong Province(No.2013GSF11834),Youth Program of Shandong Academy of the Medical Sciences Technology Plan(Nos.2014-56 and 2014-61),Projects of Medical Science and Technology Development in Shandong Province(Nos.2015WS0149 and 2015WS0197),and the Natural Science Foundation of Shandong Province(No.ZR2013HL040)

Objective:To investigate therapeutic efficacy and mechanisms of action of oncolytic agent derived from herpes simplex virus type 2(oHSV2)in a xenograft mouse model bearing CT26 colorectal cancer.Methods:BALB/c mice were subcutaneously inoculated with CT26 cells to establish a xenograft mouse model of colorectal cancer.1)After intratumoral administration of oHSV2,enzyme-linked immunosorbent assay was used to determine granulocyte-macrophage colony-stimulating factor(GM-CSF)expression levels in the blood. 2)Model mice were divided into three groups:PBS group(negative control),oHSV2 group,and 5-fluorouracil(5-FU)group(positive control). After drug administration,drug effectiveness was evaluated on the basis of weight,tumor volume,general state,and survival time.3)Cells from the draining lymph nodes(TDLN)and tumor were surgically removed and used to quantify mature dendritic cells(DCs)and T lymphocytes by flowcytometry.Result:1)In the CT26 xenograft model,level of GM-CSF continuously elevated.At day 8,peak value was attained in the blood at concentration of 3150±327.1 pg/mL.Then,GM-CSF expression gradually reduced as time progressed.2)In in vivo study, both oHSV2 and 5-FU exerted antitumor effects relative to PBS group(50 days vs.36 days,P＜0.01;51 days vs.36 days,P＜0.01),and oHSV2 proved to be less toxic and safer.At day 28,the 5-FU group presented highly significant difference in mouse body weight compared with that of PBS group(16.61 g vs.22.07 g,P＜0.01).However,oHSV2 group did not show statistically significant change(all P＞0.05).Skin of virus injection region did not present necrosis and ulceration.3)In the TDLN,the frequency of DC was increased when treated with oHSV2 compared with the control group(6.49%vs.3.73%,P＜0.01).Similarly,the percentage of CD4+and CD8+T-cells from the oHSV2-treated groupwas signifcantly higher than mock-treated tumors(15%vs.8.57%,P＜0.01;8.19%vs.5.15%,P＜0.01).However,number of cells in the 5-FU group were significantly reduced with respect to that of the negative group(all P＜0.01).Conclusion:oHSV2 exerted potent antitumor effects in a murine colorectal cancer model.Compared with 5-FU,oHSV2 treatment caused fewer side effects.Such antitumor effect may be induced by stimulation of immune activity by GM-CSF production.

colorectal cancer,oncolytic virus,granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,immunotherapy

10.3969/j.issn.1000-8179.2017.03.083

①濟(jì)南大學(xué)山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院（濟(jì)南市250022）；②山東大學(xué)附屬山東省腫瘤醫(yī)院外四病區(qū)；③山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院外二病區(qū)

*本文課題受山東省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：2013GSF11834）、山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院院級(jí)科技計(jì)劃青年項(xiàng)目（編號(hào)：2014-56，2014-61）、山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：2015WS0149，2015WS0197）和山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（編號(hào)：ZR2013HL040）資助

徐忠法 xzf2216@126.com

尹磊 專(zhuān)業(yè)方向?yàn)槲改c道腫瘤的外科治療。

E-mail：15056997829@163.com