血清TTR的表達(dá)與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)性研究

徐靜　張洪柱　徐玉芬

[摘要] 目的 研究分析結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移與血清轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白（TTR）表達(dá)之間的相關(guān)性。 方法 選擇2014年1月～2015年12月間我院收治的23例結(jié)直腸癌患者進(jìn)行本次研究，采集其血液樣本。根據(jù)是否出現(xiàn)了遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移進(jìn)行分組，將其中無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的樣本設(shè)為對(duì)照組，共11例；發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的樣本設(shè)為觀察組，共12例。所有樣本都采用蛋白免疫印跡方法對(duì)TTR 表達(dá)進(jìn)行半定量分析。 結(jié)果 通過計(jì)算兩組樣本的光密度比值，結(jié)果顯示無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者血清樣本（對(duì)照組）中TTR的表達(dá)量更高，顯著高于發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者（觀察組）血清TTR表達(dá)量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.023<0.05）。 結(jié)論 結(jié)直腸癌患者血清TTR的表達(dá)水平與腫瘤是否發(fā)生轉(zhuǎn)移有相關(guān)性，發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌患者血清TTR表達(dá)量顯著更低，在今后對(duì)結(jié)直腸癌浸潤與轉(zhuǎn)移水平的評(píng)估中，TTR可作為一種腫瘤標(biāo)志物。

[關(guān)鍵詞] 血清TTR；結(jié)直腸癌；相關(guān)性；表達(dá)水平

[中圖分類號(hào)] R735.3 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2016）30-0016-04

轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白（TTR），也被稱為“前白蛋白”，英文簡稱PA，是由4個(gè)相同亞基共同構(gòu)成的一種四聚體，每個(gè)亞基由127個(gè)氨基酸組成，其主要功能是以轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的身份參與轉(zhuǎn)運(yùn)甲狀腺素、視黃醇，同時(shí)TTR還能夠體現(xiàn)體內(nèi)蛋白的合成情況，當(dāng)體內(nèi)蛋白丟失，出現(xiàn)應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，TTR水平會(huì)迅速下降，反之則增高[1]。由于TTR是一種甲狀腺素與視黃醇的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，所以其表達(dá)情況可體現(xiàn)機(jī)體的營養(yǎng)及某些病理改變，可作為預(yù)測(cè)疾病、判斷疾病預(yù)后的一項(xiàng)指標(biāo)[2]。為此，我院選取2014年1月～2015年12月間所收治的結(jié)直腸癌住院患者進(jìn)行研究，分析發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移與未發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者TTR的表達(dá)情況，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

納入我院2014年1月～2015年12月結(jié)直腸癌住院患者23例為研究對(duì)象，所有患者均經(jīng)病理確診，經(jīng)檢查均未發(fā)現(xiàn)其他惡性腫瘤與甲狀腺代謝疾病。采集血清樣本，其中11例患者未出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，12例患者伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（均屬于肝或者胃轉(zhuǎn)移），患者年齡最小48歲，最大79歲，平均（69.1±3.1）歲，其中男12例，女11例。全部患者于術(shù)前采集血清樣本，術(shù)前均未進(jìn)行放射治療、化療與免疫治療，全部患者臨床資料均齊全。血清樣本均置于-80℃保存，采用全自動(dòng)生化儀對(duì)血清蛋白濃度進(jìn)行檢測(cè)。

1.2方法

對(duì)23例患者血清采用蛋白免疫印跡半定量檢測(cè)。①吸取30 μL血清標(biāo)本，采用SDS-PAGE，變性溫度設(shè)置為100℃，處理時(shí)間設(shè)置為18 min。②電泳濃縮膠電壓設(shè)置為60 V，分離膠電壓設(shè)置為120 V。90 min半干電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)膜，采用封閉液進(jìn)行封閉，封閉液采用5%脫脂奶粉+PBST；封閉一抗，封閉液采用抗體稀釋劑，TTR抗體：封閉液=1∶1000，β-actin抗體：封閉液=1∶400，在4℃下過夜；PBST：0.05% Tween+PBS，每20分鐘對(duì)膜進(jìn)行一次清洗，共清洗3次。封閉二抗，TTR抗體與β-actin抗體分別采用山羊抗兔（LgG H+L）辣根過氧化物酶抗體與山羊抗小鼠（LgG H+L）辣根過氧化物酶抗體，其中TTR抗體：封閉液=1∶1500，β-actin抗體：封閉液=1∶2000，將其放置在溫室搖床孵育，時(shí)間設(shè)置為90 min，PBST每15分鐘進(jìn)行一次洗膜，共進(jìn)行3次，采用DBA顯色液對(duì)膜顯色5 min[3]。然后采用分析軟件Image J進(jìn)行條帶光密度的計(jì)算和分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)獲得的計(jì)量資料、計(jì)數(shù)資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組與未發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組的計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，顯著水平95%，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移與無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組患者血清TTR的表達(dá)結(jié)果比較

采集11例未發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者血清，實(shí)驗(yàn)以5或6例為一組，采用Western blotting雜交實(shí)驗(yàn)對(duì)血清中的TTR 進(jìn)行測(cè)定，實(shí)驗(yàn)以β-actin 為內(nèi)參，結(jié)果見圖1。同樣方法，運(yùn)用雜交實(shí)驗(yàn)半定量分析12例發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌患者血清中TTR表達(dá)，結(jié)果見圖2。

2.2遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移與無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組結(jié)直腸癌患者血清TTR半定量結(jié)果比較

比較遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移與無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組結(jié)直腸癌患者血清TTR 與β-actin光密度值，β-actin 為參考標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)比分析兩類患者血清TTR的表達(dá)量相對(duì)變化，同時(shí)計(jì)算TTR 的變化相對(duì)比率。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，比較發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌患者（觀察組）與未出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌患者（對(duì)照組）血清中TTR 的表達(dá)量，前者為（3.6±0.8），后者為（11.4±3.5），發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌患者血清TTR表達(dá)量顯著更低，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.524，P=0.023<0.05）。

3 討論

轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白（TTR）也被稱為前白蛋白（PA），合成于肝臟與脈絡(luò)叢，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)人體內(nèi)甲狀腺素、視黃醇蛋白并參與維生素A 的代謝。甲狀腺結(jié)合前清蛋白，屬于血漿運(yùn)輸?shù)鞍?，主要?fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)維生素A與蛋白和甲狀腺素結(jié)合。甲狀腺結(jié)合前清蛋白主要于肝臟、眼睛和脈絡(luò)膜中產(chǎn)生，在人體血漿及腦脊髓液中有分布[4]。在pH=7.2的生理?xiàng)l件與環(huán)境下，TTR是一種穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，其基本結(jié)構(gòu)及其功能均是穩(wěn)定的[5]。當(dāng)TTR發(fā)生分解成為單體后，將會(huì)導(dǎo)致淀粉變性病[6]。與正常人血清中TTR表達(dá)量比較，惡性腫瘤患者血清中的TTR表達(dá)量往往體現(xiàn)為低表達(dá)。相關(guān)研究結(jié)果表明，與正常人相比，在肝癌、肺癌患者中TTR表達(dá)呈下降態(tài)勢(shì)[7-8]，所以，在惡性腫瘤中TTR 基因具有抑癌基因的作用。通過查閱大量的文獻(xiàn)資料，有關(guān)惡性腫瘤TTR表達(dá)的研究報(bào)道指出，在惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展的過程中，TTR起到了腫瘤抑制物的作用，對(duì)腫瘤有抑制作用[9-10]。國外相關(guān)研究報(bào)道指出，通過對(duì)比結(jié)直腸癌患者與正常人的血清蛋白差異點(diǎn)，結(jié)果顯示二者在TTR 的表達(dá)上存在顯著的差異，但對(duì)比CEA陰性與陽性患者血清蛋白差異點(diǎn)，結(jié)果顯示并無顯著性差異[11-12]。在結(jié)直腸癌的診斷中，TTR可作為標(biāo)志物，研究顯示，血清蛋白優(yōu)勢(shì)更加明顯。當(dāng)前在惡性腫瘤的分期和分級(jí)中，有關(guān)TTR的報(bào)道較少，有關(guān)研究指出結(jié)直腸癌患者出現(xiàn)淋巴轉(zhuǎn)移的與未出現(xiàn)淋巴轉(zhuǎn)移的TTR表達(dá)量并沒有顯著差異[13-14]。上述研究結(jié)果顯示，TTR基因具有抑制癌癥的作用，而結(jié)直腸癌的發(fā)展與TTR表達(dá)存在一定的聯(lián)系，并且不同分期中TTR蛋白的表達(dá)存在明顯的差異，預(yù)示著TTR的診斷價(jià)值。

本研究選擇2014年1月～2015年12月我院所收治的結(jié)直腸癌患者作為研究對(duì)象，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)比沒有出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌患者血清中的TTR表達(dá)，出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌患者血清中TTR的表達(dá)呈明顯下降態(tài)勢(shì)，對(duì)比分析兩類患者血清TTR的表達(dá)量相對(duì)變化，計(jì)算TTR 的變化相對(duì)比率。遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌患者TTR 的變化相對(duì)比率為（3.6±0.8），與未出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌患者TTR 的變化相對(duì)比率（11.4±3.5）比較顯著更低，此結(jié)果提示對(duì)TTR表達(dá)水平的研究可作為一種重要的標(biāo)志物來推斷結(jié)直腸癌的發(fā)生與進(jìn)展[15-17]。

TTR參與到甲狀腺素、視黃醇的轉(zhuǎn)運(yùn)當(dāng)中，目的在于保證體內(nèi)甲狀腺素、視黃醇以及結(jié)合蛋白水平處于正常水平[18]。TTR有很多種突變體，突變體的存在會(huì)造成多種疾病發(fā)生，其與細(xì)胞本身的變異、疾病的發(fā)生與發(fā)展緊密相關(guān)。現(xiàn)階段大部分惡性腫瘤的治療的關(guān)鍵就在于早期診斷，這對(duì)腫瘤研究起著巨大的作用。結(jié)合國內(nèi)外相關(guān)研究，主張TTR檢測(cè)可對(duì)多種惡性腫瘤進(jìn)行預(yù)測(cè)，因此被認(rèn)定是一種良好的標(biāo)志物，用于惡性腫瘤的診斷具有很高的價(jià)值[19]。當(dāng)前其他腫瘤相關(guān)研究并未提及惡性腫瘤在TTR基因結(jié)構(gòu)上存在異常，用于體外轉(zhuǎn)染癌細(xì)胞是否能夠抑制其生長并無定論，且對(duì)TTR具體影響腫瘤的機(jī)制也尚待研究[20-21]。當(dāng)前針對(duì)TTR與腫瘤發(fā)生、發(fā)展關(guān)系的研究樣本數(shù)量并不多，結(jié)果也有待進(jìn)一步的研究，通過對(duì)TTR及其突變體在腫瘤中的作用機(jī)制研究，可對(duì)該基因多態(tài)性病因?qū)W更好地做出闡述[22]。由于TTR存在部分突變體，當(dāng)這些突變體發(fā)生變化時(shí)將可能對(duì)診斷的準(zhǔn)確性造成一定的影響，造成結(jié)果不準(zhǔn)確，這也是需要進(jìn)一步探討的問題。當(dāng)前測(cè)定總體TTR含量可采用電流測(cè)定，同時(shí)酶聯(lián)免疫法測(cè)定TTR技術(shù)也逐漸得到應(yīng)用推廣，測(cè)定技術(shù)變得更加成熟，而測(cè)定結(jié)果也更加穩(wěn)定，特異性也顯著提高，因此進(jìn)一步開展對(duì)TTR表達(dá)的研究可使臨床腫瘤測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定性和特異性也進(jìn)一步提高，相信深入開展TTR 對(duì)于臨床腫瘤的診斷具有非常重要的意義和發(fā)展前景。

綜上所述，結(jié)直腸癌患者血清TTR的表達(dá)水平與腫瘤是否發(fā)生轉(zhuǎn)移有相關(guān)性，發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌患者血清TTR表達(dá)量顯著更低，在今后對(duì)結(jié)直腸癌浸潤與轉(zhuǎn)移水平的評(píng)估中，TTR可作為一種腫瘤標(biāo)志物。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Gouvea IE，Kondo MY，Assis DM，et al. Studies on the peptidase activity of transthyretin（TTR）[J]. Biochimie，2013， 95（2）：215-223.

[2] Su Y，Jono H，Misumi Y，et al. Novel function of transthyretin in pancreatic alpha cells[J]. FEBS Lett，2012，586（23）：4215-4222.

[3] Trenchevska O，Kamcheva E，Nedelkov D. Mass spectrometric immunoassay for quantitative determination of transthyretin and its variants[J]. Proteomics，2011，11（18）：3633-3641.

[4] 張文亮，宋林，李優(yōu)鑫，等. 毛細(xì)管電泳與MALDI-TOF/MS法聯(lián)用測(cè)定血清轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白的化學(xué)修飾[J]. 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2012，27（3）：185-188.

[5] 彭晨，王子安. 轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白在臨床腫瘤中的研究進(jìn)展[J]. 中華全科醫(yī)學(xué)，2014，12（1）：122-123.

[6] 夏云連，陳炯，盧寅，等. 應(yīng)用2D-DIGE及MALDI-TOF-MS篩選胰腺癌血清標(biāo)志物[J]. 國際外科學(xué)雜志，2012， 39（5）：313-317.

[7] 胡慧慧，孟倩，張曼.結(jié)直腸癌患者血清中轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白的表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)性[J].標(biāo)記免疫分析與臨床，2013，20（6）：378-380.

[8] 王連才，李德宇，高春輝，等. 基質(zhì)金屬蛋白酶-2及9在胰腺癌組織中表達(dá)及意義[J]. 中華實(shí)用診斷與治療雜志，2012，26（5）：452-455.

[9] Zhao L，Liu Y，Sun X，et al. Serum proteome analysis for profiling protein markers associated with lymph node metastasis incolorectal carcinoma[J]. J Comp Pathol，2011， 144（2-3）：187-194.

[10] Moore LE，Pfeiffer RM，Zhang Z，et al. Proteomic biomarkers in combination with CA125 for detection of epithelial ovarian cancer using prediagnostic serum samples from the Prostate，Lung，Colorectal，and Ovarian（PLCO）Cancer Screening Trial[J]. Cancer，2012，118（1）：91-100.

[11] Liao R，Wu H，Yi Y，et al. Clinical significance and gene expression study of human hepatic stellate cells in HBV related-hepatocellular carcinoma[J]. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research Cr，2012，32（12）：1-10.

[12] Barrow H，Rhodes JM，Yu LG. Simultaneous determination of serum galectin-3 and-4 levels detects metastases in colorectal cancer patients[J]. Cellular Oncology，2013， 36（1）：9-13.

[13] Fujii T，Sutoh T，Morita H，et al. Serum albumin is superior to prealbumin for predicting short-term recurrence in patients with operable colorectal cancer[J]. Nutr Cancer，2012，64（8）：1169-1173.

[14] Chen J，Chen LJ，Xia YL，et al. Identification and verification of transthyretin as a potential biomarker for pancreatic ductal adenocarcinoma[J]. J Cancer Res Clin Oncol，2013，139（7）：1117-1127.

[15] 趙蕾，張志華，白春強(qiáng)，等. 轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白在早期類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者中的臨床意義[J]. 實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2016， 32（14）：2337-2339.

[16] 王靖雯，楊林青，劉濤，等. 基質(zhì)金屬蛋白酶-9及血管內(nèi)皮生長因子在卵巢癌中表達(dá)及其關(guān)系研究[J]. 中華實(shí)用診斷與治療雜志，2010，24（7）：661-663.

[17] 廖存，賀永明，吳留成，等. 血清CEA 陰性結(jié)直腸癌患者血清差異蛋白質(zhì)的初步篩選[J]. 結(jié)直腸肛門外科，2011，17（3）：131-136.

[18] Hibi K，Mizukami H，Saito M，et al. FBN2 methylation is detected in the serum of colorectal cancer patients with hepatic metastasis[J]. Anticancer Research，2012，32（10）：4371-4374.

[19] Giampieri R，Scartozzi M，Loretelli C，et al. Cancer Stem Cell Gene Profile as Predictor of Relapse in High Risk Stage Ⅱ and Stage Ⅲ， Radically Resected Colon Cancer Patients[J]. Proceedings of the American Philosophical Society，2013，14（9）：16-17.

[20] Ding H，Liu J，Xue R，et al. Transthyretin as a potential biomarker for the differential diagnosis between lung cancer and lung infection[J]. Biomedical Reports，2014，2（5）：765-769.

[21] Timms JF，Arslan-Low E，Kabir M，et al. Discovery of serum biomarkers of ovarian cancer using complementary proteomic profiling strategies[J]. Proteomics-Clinical Applications，2014，8（11-12）：982-993.

[22] Rong CH，Yang JX，Shen K，et al. Primary separation and identification of cervical cancer associated proteins in serum[J]. Basic & Clinical Medicine，2012，32（2）：191-194.

（收稿日期：2016-06-24）