銀鯧不同組織中4種同工酶的表達(dá)差異

劉 磊，張晨捷，彭士明，高權(quán)新，施兆鴻

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部東海與遠(yuǎn)洋漁業(yè)資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200090；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306）

銀鯧不同組織中4種同工酶的表達(dá)差異

劉 磊1，2，張晨捷1，彭士明1，高權(quán)新1，施兆鴻1，2

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部東海與遠(yuǎn)洋漁業(yè)資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200090；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306）

采用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)，分析了銀鯧（Pampus argenteus）脾臟、肝臟、肌肉、心臟、腎臟等5種組織中酯酶（EST）、乳酸脫氫酶（LDH）、谷氨酸脫氫酶（GDH）、乙醇脫氫酶（ADH）等4種同工酶的表達(dá)模式，并對各種同工酶的酶譜進(jìn)行了分析。結(jié)果表明：這4種同工酶在銀鯧5種組織中的分布均存在一定的組織特異性，其與各組織的生理機(jī)能密切相關(guān)。銀鯧4種同工酶共記錄出61條酶帶，其中EST被檢測出的酶帶數(shù)量最多也較復(fù)雜，ADH同工酶酶帶數(shù)量最少，只有6條酶帶被檢測到，LDH和GDH分別檢測到16條和9條酶帶；組織特異性主要表現(xiàn)在位點(diǎn)表達(dá)和酶活性強(qiáng)弱不同這兩個方面，GDH1和ADH2只在肝臟中表達(dá)。

銀鯧；同工酶；組織特異性

同工酶（isozyme）是指由一個或多個基因座位編碼、存在于同一種（或?qū)伲┑纳锘蛲粋€體的不同組織中，甚至存在同一組織或同一細(xì)胞中，催化同一種化學(xué)反應(yīng)，但酶分子結(jié)構(gòu)有所不同的一類酶。同工酶在生物發(fā)育分化及代謝調(diào)節(jié)中必不可少，魚類同工酶的研究始于1960年，至今技術(shù)已經(jīng)十分成熟，研究方法較多。作為一種生化遺傳指標(biāo)，已經(jīng)廣泛用于魚類物種鑒定［1－2］、親緣關(guān)系分析［3－4］、種群遺傳［5－6］、系統(tǒng)發(fā)育［7］等各個方面。

銀鯧（Pampus argenteus）屬鱸形目鯧亞目鯧科鯧屬，為暖溫性近海中上層集群性經(jīng)濟(jì)魚類［8］，銀鯧主要分布于印度洋、印度-太平洋區(qū)、朝鮮和日本西部海域，在中國沿海地區(qū)也有分布［9］，是東海主要捕撈經(jīng)濟(jì)魚類之一，屬名貴食用魚類。迄今對銀鯧的研究，主要集中在種群洄游和資源量評估［9－10］、資源動態(tài)［8－11］、生殖力及人工繁養(yǎng)殖［12－14］、生理及生態(tài)［15－17］等方面。而對銀鯧同工酶的研究還較少，本研究對銀鯧4種同工酶［酯酶（EST）、乳酸脫氫酶（LDH）、谷氨酸脫氫酶（GDH）、乙醇脫氫酶（ADH）］進(jìn)行了組織特異性的初步分析，以期為其種質(zhì)資源、人工選育和遺傳研究提供同工酶譜和生化遺傳學(xué)的參考指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)魚取自江蘇省啟東的上海市水產(chǎn)研究所啟東科研基地，為東海水產(chǎn)研究所本所自行繁育的1齡銀鯧，從養(yǎng)殖池中隨機(jī)撈取10 ind，平均體質(zhì)量為（18.8±7.2）g，平均叉長為（9.1± 1.1）cm。采樣時間為2015年8月。

1.2 酶液樣品制備

解剖銀鯧，迅速摘取脾臟、肝臟、肌肉、心臟、腎臟5種組織，沖去血污，于濾紙上靜置吸去水分，裝入管中冷凍備用。實(shí)驗(yàn)時，切取一小塊樣品，加入預(yù)冷的磷酸緩沖液（0.1 M，pH 7.0），加入比例按照1∶4（質(zhì)量／體積），勻漿機(jī)中勻漿后4℃靜置3 min，然后12 000轉(zhuǎn)離心10 min，取上清液備用。取等體積的上清液與上樣緩沖液（20%的蔗糖溶液與1%的溴酚藍(lán)）混勻即可上樣電泳。

1.3 電泳方法

采用不連續(xù)聚丙烯酰胺垂直平板電泳。濃縮膠的濃度均為4%，pH值6.8；分離膠乳酸濃度為8%，其它濃度為12.5%，pH值8.8。電極緩沖液為三羥甲基氨基甲烷-甘氨酸（Tris-Gly）。10 mA恒流預(yù)電泳1 h，電泳120 V恒壓電泳，電泳時間各種酶有所不同。電泳結(jié)束后進(jìn)行染色。

1.4 染色及酶譜分析

同工酶的染色方法參照文獻(xiàn)［18－20］稍作改進(jìn)，37℃避光染色，至條帶出現(xiàn)后停止染色，蒸餾水沖洗，脫色后7%乙酸溶液保存，經(jīng)相機(jī)拍照保存，照片經(jīng)調(diào)光處理后使用。

EST同工酶染色方法如下：稱取100 mg 4-苯甲酰氨基-2，5-二甲氧基氯化重氮苯氯化鋅鹽（Fast Blue RR Salt，簡稱固藍(lán)RR鹽）、50 mg乙酸-1-萘酯（1-Naphthyl acetate）和50 mg乙酸-2-萘酯（2-Naphthyl acetate）共同溶于10 mL丙酮中，待溶解完成后，加入90 mL 0.1 M磷酸溶液（PB），現(xiàn)配現(xiàn)用。

LDH同工酶染色液按照氧化型輔酶Ⅰ溶液（NAD＋，5 mg·mL－1）∶乳酸鈉（1 mg·mL－1）∶氯化鈉（0.1 M）∶氯化硝基四氮唑藍(lán)（NBT，1 mg· mL－1）∶甲硫吩嗪（PMS，1 mg·mL－1）∶磷酸鹽緩沖液（PBS，0.5 M pH 7.5）＝4.0∶2.5∶2.5∶10.0∶1.0∶5.0比例進(jìn)行配制，現(xiàn)配現(xiàn)用。

GDH同工酶染色液按照氧化型輔酶Ⅰ溶液（NAD＋，5mg·mL－1）∶谷氨酸鈉（1M pH 7.0）∶蒸餾水∶氯化硝基四氮唑藍(lán)（NBT，1 mg·mL－1）∶甲硫吩嗪（PMS，1mg·mL－1）∶磷酸鹽緩沖液（PBS，0.5 M pH 7.5）＝12∶5∶30∶30∶2∶25比例進(jìn)行配制，現(xiàn)配現(xiàn)用。

ADH同工酶染色液按照氧化型輔酶Ⅰ溶液（NAD＋，5 mg·mL－1）∶95%乙醇∶蒸餾水∶氯化硝基四氮唑藍(lán)（NBT，1 mg·mL－1）∶甲硫吩嗪（PMS，1 mg·mL－1）∶三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液（Tris-HCl，0.2 M pH 8）＝5∶2∶20∶15∶1∶7比例進(jìn)行配制，現(xiàn)配現(xiàn)用。

同工酶的命名［21］，以各酶帶的相對遷移率（Rf）從大到小依次命名，即離陰極最近的編為1號，依次順序編為2，3，4，……。

2 結(jié)果與分析

2.1 EST

從銀鯧的EST電泳圖譜（圖1）可以看出，在銀鯧的5種組織中都有EST的條帶顯示，但條帶的顏色深淺不同，說明檢測到了酯酶的活性，但活性強(qiáng)弱有所差別。比較銀鯧5種組織中的EST電泳條帶可知：肝臟是檢測到EST同工酶最多的組織，酶帶多且染色深，活性最強(qiáng)，其次是心和肌肉組織；肝和心臟中EST條帶分布較均勻，肌肉中條帶在EST6～EST12位點(diǎn)之間分布多于EST6位點(diǎn)之前；脾和腎中檢測到的條帶數(shù)目少且顏色淺，顯示EST活性弱；脾是EST同工酶最少的組織，酶帶少且染色淺，活性最弱，銀鯧EST同工酶在5種組織中的表達(dá)具有顯著的組織特異性。

圖1 銀鯧不同組織EST圖譜Fig.1 EST pattems in various tissues of P.argenteus

2.2 LDH

在銀鯧5種組織LDH同工酶圖譜中，不同組織的LDH表現(xiàn)出明顯的組織特異性（圖2）。電泳圖譜共檢測到5條酶帶，每種組織的酶帶數(shù)2～5條不等。在脾臟中檢測到2條酶帶LDH4和LDH5，且LDH4染色較深，活性LDH4＞LDH5；在肝臟組織中共檢測到5條酶帶，活性強(qiáng)弱依據(jù)酶帶深淺為LDH4＞LDH2＞LDH3＞LDH1＞LDH5；在肌肉組織中共檢測到LDH4和LDH2兩條酶帶，其中LDH2染色極淺，其活性較弱；在心臟中檢測到3條酶帶，活性LDH5＞LDH4＞LDH2；腎臟中清晰的檢測到4條酶帶，其中LDH2和LDH3染色清晰，說明其穩(wěn)定性強(qiáng)，LDH4染色最深，活性最強(qiáng)，LDH5染色最淺，活性最弱。綜上，LDH1酶帶只在肝組織中檢測到，其它組織中并未發(fā)現(xiàn)LDH1酶帶。

圖2 銀鯧不同組織LDH圖譜Fig.2 LDH pattems in various tissues of P.argenteus

2.3 GDH

由銀鯧的不同組織的GDH電泳圖譜（圖3）可見，GDH在銀鯧脾、肝臟、肌肉、心臟、腎臟各組織中都有分布，共檢測到5條酶帶。其中GDH1僅在肝臟中檢測到且染色較淺，活性比較弱；GDH2及GDH3在腎臟中檢測到明顯的條帶，活性居中；而GDH4在5種組織中都有酶帶出現(xiàn)，酶帶較寬，在肝臟、肌肉和腎中染色較深，活性最強(qiáng)，心臟中的活性次之，在脾臟活性最弱；GDH5僅在心臟中檢測到明顯酶帶，染色較深，活性較強(qiáng)。腎臟是檢測到GDH同工酶最多的組織，有3條酶帶，脾臟是GDH同工酶最少的組織，只檢測到1條酶帶，且染色較淺，活性弱，銀鯧GDH同工酶在5種組織中的表達(dá)具有顯著的差異性。

圖3 銀鯧不同組織GDH圖譜Fig.3 GDH pattems in various tissues of P.argenteus

2.4 ADH

銀鯧不同組織的ADH電泳圖譜見圖4，銀鯧ADH同工酶共檢測到2條酶帶，ADH2僅在肝臟中檢測到酶帶，染色淺，活性低，在其它4種組織中未檢測到ADH2活性。ADH1在銀鯧脾、肝臟、肌肉、心臟、腎臟各組織中都檢測到了酶帶，但其染色程度有差異，在心臟中ADH1酶帶染色最深，活性最強(qiáng)。肝臟中檢測到2條酶帶，其它組織只有1條酶帶，且染色程度差異明顯，ADH同工酶在銀鯧5種組織中的表達(dá)具有一定的組織差異。

圖4 銀鯧不同組織ADH圖譜Fig.4 ADH pattems in various tissues of P.argenteus

3 討論

3.1 銀鯧同工酶表達(dá)的組織特異性

表1 銀鯧各組織同工酶酶帶數(shù)統(tǒng)計(jì)表Tab.1 Enzyme band number in various tissues of P.argenteus

本實(shí)驗(yàn)對銀鯧4種同工酶的研究發(fā)現(xiàn)，在5種組織中各種同工酶都有一定程度的表達(dá)，由表1可見，肝臟中酶的含量最為豐富，4種同工酶都檢測到活性且總酶帶數(shù)量最多，共檢測到18條酶帶，活性幾乎是幾種組織中最高的；其次為心臟；再次之為肌肉和腎臟；脾臟酶含量最少，共檢測到5條酶帶，且各酶帶染色淺，說明其表達(dá)量較低，活性弱。腎臟中，EST酶表達(dá)較弱，只有3條酶帶，且染色淺，活性低，而其余3種酶表達(dá)較活躍，僅次于肝臟中3種酶的表達(dá)。對卵形鯧鯵（Trachinotus ovatus）同工酶表達(dá)的研究發(fā)現(xiàn)［22］，EST同工酶在肝臟和腎臟中表達(dá)了兩個座位，在肌肉、脾臟和心臟只表達(dá)一個座位，而與之不同，本研究中銀鯧腎臟組織中EST同工酶表達(dá)弱；卵形鯧鯵LDH同工酶在腎臟中表達(dá)最強(qiáng)，而在脾臟中沒有表達(dá)，這與本研究中銀鯧的研究結(jié)果相類似，銀鯧的LDH同工酶在腎臟中表達(dá)較強(qiáng)，而在脾臟中表達(dá)弱；卵形鯧鯵與本實(shí)驗(yàn)銀鯧組織同工酶表達(dá)有異有同，說明同工酶在不同種之間表達(dá)也存在較大差異性。

銀鯧5種組織的4種同工酶都表現(xiàn)出組織特異性，具體表現(xiàn)在以下2個方面：首先是位點(diǎn)的表達(dá)，某些位點(diǎn)的同工酶可能是某種組織所特有的，在其它組織中不表達(dá)或者活性太低無法檢測到。比如ADH同工酶，在肝臟中檢測到兩條酶帶，而其它組織中只檢測到ADH1酶帶，ADH2是肝臟組織中所特有的；又如GDH1僅在肝臟中檢測到酶帶，GDH5僅在心臟組織中檢測到酶帶，肝臟和腎臟中EST酶帶數(shù)基本相同，但是其相同位點(diǎn)酶帶表達(dá)有所差異，等等，以上這些說明組織特異性確實(shí)可表現(xiàn)在位點(diǎn)表達(dá)的差異上。其次，酶活性的強(qiáng)弱不同。同一位點(diǎn)在不同組織中的相對含量有所不同，其可通過染色深淺來加以判斷。如ADH1在5種組織中都有表達(dá)，但在心臟組織中酶帶顏色深，含量豐富，其次是腎臟和肌肉，活性最弱的是脾和肝臟；GDH4在5種組織中酶帶相同，表達(dá)量不同，在肝臟、肌肉、腎臟中高表達(dá)，活性強(qiáng)，其次是心臟中，最弱的是在脾臟中。同時，不同位點(diǎn)在不同組織中的相對活性不同，如EST同工酶，在肝臟、肌肉、心臟中表達(dá)活躍，酶帶數(shù)量多，而在脾和腎臟中檢測到的酶帶少，在肌肉中酶帶集中于EST6～EST12之間，而肝臟和心臟中酶帶分布均勻。

3.2 銀鯧不同組織同工酶表達(dá)的特異性及其與功能的關(guān)系

硬骨魚類的EST一般認(rèn)為是單體或二聚體酶，由多個位點(diǎn)編碼，多態(tài)現(xiàn)象非常普遍，條帶多且復(fù)雜［23－24］。EST是一種水解酶類，除維持正常的能量代謝外，還可以水解非正常存在的酯類化合物，具有解毒的功能［25］。銀鯧的肝臟和心臟中EST同工酶表達(dá)最強(qiáng)，這與肝臟的消化吸收、降解代謝廢物和毒素等生理生化功能相關(guān)，心臟中酶表達(dá)強(qiáng)可能與其活躍的能量代謝相關(guān)，銀鯧肌肉中EST同工酶表達(dá)僅次于肝臟和心臟，這可能與銀鯧的習(xí)性有關(guān)，銀鯧生性愛動，肌肉比較發(fā)達(dá)，這需要活躍的能量代謝，因此造成其EST同工酶高度表達(dá)。

LDH為四聚體［26－28］，是一種糖酵解酶，主要與乳酸的產(chǎn)生和利用有關(guān)［29］，它在無氧條件下能將丙酮酸還原為乳酸，產(chǎn)能以維持機(jī)體的能量需求。銀鯧5種組織中共檢測到5條酶帶，肝臟中LDH活性表現(xiàn)的最強(qiáng)，肝臟高強(qiáng)度的生理活動需要消耗大量能量，LDH催化乳酸氧化形成丙酮酸，參與有氧代謝。肌肉是機(jī)體無氧代謝較為旺盛的組織，銀鯧肌肉中LDH表現(xiàn)出2條酶帶，主要是催化丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸，參與無氧代謝。一般認(rèn)為C基因控制的LDH表型在部分魚類的肝臟中表達(dá)［30］，而這與銀鯧組織中特異的LDH1酶帶相對應(yīng)。

GDH是一種線粒體酶，GDH除催化L-谷氨酸脫氫外，還具有催化其它氨基酸如L-纈氨酸、L-2-氨基丁酸及L-亮氨酸脫氨，它以NAD、NADP或者同時利用兩者作為輔酶，參與到谷氨酸的合成與分解中［31］。本研究中，在銀鯧腎臟中檢測到GDH同工酶3條酶帶，腎臟具有排泄分泌代謝產(chǎn)物的功能，它還具有重吸收的功能，能夠?qū)被帷⑵咸烟堑热恐匚?，重吸收的相關(guān)氨基酸能夠參與谷氨酸的合成與再分解中，此過程GDH表現(xiàn)活躍，這與5種組織中腎臟GDH活性最強(qiáng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符合。

ADH是一種催化醇脫氫形成醛或酮的酶，一般為二聚體酶［23］。ADH同工酶大量存在于人和動物肝臟中，它的生理作用是適應(yīng)厭氧酵解的需求。從本研究結(jié)果可以看出，肝臟中檢測到2條ADH酶帶，但染色顏色淺，肌肉、心臟和肝臟中只有1條酶帶但染色深，活性強(qiáng)，這與昆明裂腹魚（Schizothorax grahami）［32］及花鰻鱺（Anguilla marmorata）［27］的研究結(jié)果存在某些類似性，與膠齒鯛（Symphysodon spp.）［33］的研究結(jié)果有差異，其肝臟中染色深且十分穩(wěn)定，其余組織染色淺且極易失活，這可能與人工養(yǎng)殖銀鯧長期適應(yīng)生存環(huán)境相關(guān)。

4 小結(jié)

本研究結(jié)果表明：銀鯧的4種同工酶在酶帶組成和表達(dá)的活性方面表現(xiàn)出高度的組織特異性，同工酶的表達(dá)差異與各組織執(zhí)行的生理功能密切相關(guān)。同工酶的組織特異性表現(xiàn)在同工酶在組織中的表達(dá)活性強(qiáng)弱、位點(diǎn)表達(dá)特異性等。作為種質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)生化遺傳學(xué)指標(biāo)的同工酶電泳技術(shù)，同工酶的種類很多，不同標(biāo)準(zhǔn)有不同的檢測方法，本研究選取了4種同工酶用來分析銀鯧的生化遺傳結(jié)構(gòu)，可為將來制定銀鯧種質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)提供技術(shù)參考。

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Differential expression of 4 kinds of isozyme in different tissues of Pampus argenteus

LIU Lei1，2，ZHANG Chen-jie1，PENG Shi-ming1，GAO Quan-xin1，SHI Zhao-hong1，2
（1.Key and Open Laboratory of Marine and Estuarine Fisheries of Ministry of Agriculture，East China Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Shanghai 200090，China；2.College of Fisheries and Life，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China）

Isozyme，as a product of gene expression，is not only an important physiological index but also a reliable genetic index.It can provide valuable biochemical genetic indicators to study the tissue specificity of isozyme system，genetic diversity and variety improvement of Pampus argenteus.Polyacrylamide gel electrophoresis was used to investigate the expression pattern and isozyme zymogram of four isozymes（EST，LDH，GDH and ADH）in 5 tissues（spleen，liver，muscle，heart and kidney）of Pampus argenteus.The results showed that：four isozymes in the five tissues showed distinct specificities，which was attributed to the physiological functions of different tissues.A total of61 isozyme bands were examined，of which EST were the most complex and sufficient，6 isozyme bands were examined in ADH，the least in 4 kinds of isozymes，16 and 9 isoenzyme bands were examined in LDH and GDH respectively.EST was active in the liver and heart tissue，followed by muscle tissue，and then it showed in the kidney，the weakest expression in bands，distributed evenly in liver and heart，they mainly distributed from EST6 to EST12 in muscle；spleen LDH isozyme bands were examined in the liver，active strength was in the sequence of LDH4＞LDH2＞LDH3＞LDH1＞LDH5，4 and 3 isozyme bands were examined in the kidney and heart，2 isozyme bands in muscle and spleen tissue；3LDH isozyme bands were examined in kidney，2 isozyme bands in heart and liver，in muscle and spleen tissue；2 ADH isoenzyme bands were examined in the liver，and in other tissues respectively.Tissue specificity was mainly expressed in two aspects：different site expressions and enzyme activities，for example，GDH1 and ADH2 isozyme bands were only present in liver，EST was active in the liver and heart tissue，LDH1 isozyme bands was only present in liver tissue.In this paper，4 kinds of isozymes show a high level of tissue specificity in enzyme site expression and activity，and the expression of isozyme differences is closely related to the physiological functions.The paper will provide technical references for Pampus germplasm standards in the future.

Pampus argenteus；isozyme；tissue specificity

S 965.3

：A

1004－2490（2017）01－0068－08

2016－01－09

國家科技支撐項(xiàng)目（2011BAD13B01）

劉 磊（1990－），男，碩士研究生，從事海水魚類養(yǎng)殖生物學(xué)研究。E-mail：Katharineyaya＠126.com

施兆鴻，研究員。Email：shizh＠eastfishery.ac.cn