碘[131I]愛(ài)克妥昔單抗注射液免疫反應(yīng)活性的分析方法

賈瑩瑩，崔海平，沈振芳，冉宇靚，王曉靜,*

碘[131I]愛(ài)克妥昔單抗注射液免疫反應(yīng)活性的分析方法

賈瑩瑩1，崔海平1，沈振芳1，冉宇靚2，王曉靜1,*

研究建立了碘[131I]愛(ài)克妥昔單抗注射液免疫反應(yīng)活性檢驗(yàn)分析方法。用活細(xì)胞結(jié)合百分?jǐn)?shù)法，對(duì)細(xì)胞選擇、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度和分離方法進(jìn)行研究，并應(yīng)用該方法分析愛(ài)克妥昔單抗注射液免疫活性的穩(wěn)定性及批間變異系數(shù)。結(jié)果表明：選擇CEA表達(dá)陽(yáng)性的LS180活細(xì)胞，反應(yīng)時(shí)間為16 h，反應(yīng)溫度為4 ℃，分離方法為直接分離法。該方法批間變異系數(shù)小于10%，重復(fù)性好，可以用于分析碘[131I]愛(ài)克妥昔單抗注射液的免疫反應(yīng)活性。

131I；單克隆抗體；免疫反應(yīng)活性

單克隆抗體類藥物一般包括兩類[1-2]：(1) 抗腫瘤單抗，即未與藥物或放射性核素偶聯(lián)的裸抗體，包括抗體及其片段，具有兩種功能，一是與靶分子特異性結(jié)合的結(jié)合功能；二是殺傷腫瘤細(xì)胞的效應(yīng)功能，即主要是通過(guò)依賴補(bǔ)體的細(xì)胞毒性和抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用兩種免疫機(jī)制實(shí)現(xiàn)；(2) 抗腫瘤單抗偶聯(lián)物，或稱免疫偶聯(lián)物，它由單抗與“彈頭”兩部分構(gòu)成，可用作“彈頭”的物質(zhì)主要有3類，放射性核素、藥物和毒素，與單抗連接分別構(gòu)成放射免疫偶聯(lián)物、化學(xué)免疫偶聯(lián)物和免疫毒素；單克隆抗體與上述“彈頭”結(jié)合，可加強(qiáng)對(duì)腫瘤靶細(xì)胞的殺傷作用[3]。

碘[131I]標(biāo)記的單克隆抗體注射液在治療肺癌、肝癌等惡性疾病的治療上有一定的療效[4-7]，目前國(guó)內(nèi)碘標(biāo)記單克隆抗體有利卡汀和唯美生。利卡汀是以HAb18 單克隆抗體的F(ab′)2片段為導(dǎo)向載體，將放射性核素131I有選擇性和針對(duì)性地帶到肝癌部位，利用其發(fā)出的β射線有效殺死癌細(xì)胞，但全身其它器官無(wú)放射性藥物的蓄積。唯美生又名為腫瘤壞死靶向治療單抗(tumor necrosis therapy)，是一種特異性結(jié)合腫瘤壞死區(qū)細(xì)胞核從而導(dǎo)向治療實(shí)體瘤的新型單抗[8-10]?，F(xiàn)針對(duì)癌胚抗原表達(dá)陽(yáng)性的大腸癌開發(fā)出新的碘[131I]愛(ài)克妥昔單抗注射液，用含有高效表達(dá)的重組嵌合抗癌胚抗原(CEA)單克隆抗體基因的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞[11]，經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)，高度純化并標(biāo)記碘[131I]后加入適量人血白蛋白穩(wěn)定劑制成的放射性液體制劑，主要用于治療癌胚抗原表達(dá)陽(yáng)性的大腸癌。其中免疫反應(yīng)活性是碘[131I]愛(ài)克妥昔單抗注射液的質(zhì)量指標(biāo)之一，因此對(duì)免疫反應(yīng)活性分析方法進(jìn)行研究十分必要。

目前標(biāo)記抗體均采用一種細(xì)胞濃度(即單一的抗原濃度)來(lái)評(píng)價(jià)標(biāo)記抗體的結(jié)合百分比，這種單一抗原濃度計(jì)算的結(jié)合百分比十分不穩(wěn)定，隨著細(xì)胞數(shù)量的誤差、細(xì)胞培養(yǎng)狀態(tài)導(dǎo)致的細(xì)胞表面抗原分子表達(dá)密度的不同、加入標(biāo)記抗體濃度的不同或誤差，該法均能產(chǎn)生較大的誤差；并且單一濃度細(xì)胞法測(cè)定的并不是真正的免疫結(jié)合百分比例，它只保證了真正的免疫結(jié)合百分比例不低于所測(cè)定的值，因此不能詳細(xì)地了解標(biāo)記抗體的實(shí)際結(jié)合活性。

本工作擬采用活的人腫瘤細(xì)胞最大程度地模擬標(biāo)記抗體在病人體內(nèi)將要結(jié)合的靶細(xì)胞，采用低溫下反應(yīng)避免活細(xì)胞的新陳代謝活動(dòng)對(duì)抗原抗體結(jié)合的影響，同時(shí)采用過(guò)夜反應(yīng)來(lái)使抗原抗體結(jié)合免疫反應(yīng)充分到達(dá)平衡，保證所檢測(cè)結(jié)果的真實(shí)性，并且采用多個(gè)濃度的測(cè)定值外推，可以克服上述誤差大的缺點(diǎn)，并可以計(jì)算實(shí)際的免疫結(jié)合百分比。

1 實(shí)驗(yàn)原理

采用活細(xì)胞結(jié)合百分?jǐn)?shù)法[12]測(cè)量免疫反應(yīng)活性。供試品標(biāo)記抗體中保留有活性的抗體能與細(xì)胞表面的CEA分子結(jié)合，采用大大過(guò)量的CEA陽(yáng)性的活細(xì)胞作為固相化抗原，在此反應(yīng)體系中加入一定量的標(biāo)記抗體孵育一定時(shí)間，這時(shí)大部分仍保持有活性的標(biāo)記抗體應(yīng)結(jié)合于細(xì)胞表面，通過(guò)洗滌除去未結(jié)合的以及喪失活性的標(biāo)記抗體，最后計(jì)算殘留的放射劑量，并外推至抗原數(shù)量無(wú)窮大，即可獲得供試品碘[131I]標(biāo)記抗體的免疫反應(yīng)活性，并判斷供試品的免疫反應(yīng)活性是否符合規(guī)定，具體計(jì)算方法如下式。

A=N/Ntot

其中：A，直接結(jié)合百分?jǐn)?shù)；N，特異性結(jié)合的計(jì)數(shù)率，min-1；Ntot，總計(jì)數(shù)率，min-1。

以Ntot/N為縱坐標(biāo)，相應(yīng)的細(xì)胞濃度(3.2×107、1.6×107、0.8×107、0.4×107、0.2×107/mL)的倒數(shù)為橫坐標(biāo)，制作曲線圖，在EXCEL軟件中做直線擬合，外推至細(xì)胞濃度無(wú)窮大(x=0)，求出此時(shí)的y值，計(jì)算供試品碘[131I]愛(ài)克妥昔單抗注射液的免疫反應(yīng)活性=1/y×100%。測(cè)量的供試品免疫反應(yīng)活性應(yīng)不小于50%，以此判斷所測(cè)定供試品是否合格。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 材料與儀器

碘[131I]愛(ài)克妥昔單抗注射液，由原子高科股份有限公司提供；CEA陽(yáng)性的人結(jié)腸癌細(xì)胞LS180，細(xì)胞活度大于95%，購(gòu)自美國(guó)ATCC(在血清培養(yǎng)狀態(tài)下測(cè)定)。

氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀，分析純(AR)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；牛血清蛋白(BSA)，AR，北京海天生物科技有限公司；乙二胺四乙酸(EDTA)，常州海豐化工有限公司。

TDL-40B型離心機(jī)，上海安亭儀器廠； KK25V61T1型冰箱，海爾公司；WH-986型混漩儀，上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠；GAMMA-C12 γ計(jì)數(shù)器，DPC公司。

2.2 細(xì)胞的選擇

CEA是一個(gè)有價(jià)值的腫瘤標(biāo)志，有大量的相關(guān)抗原。CEA分子特征可以轉(zhuǎn)化到不同來(lái)源的細(xì)胞，如黑色素瘤、結(jié)腸腺癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、白血病與前列腺腫瘤的抗原，這種僅限于在腫瘤細(xì)胞膜表達(dá)的分子特征，可用于鑒別人腫瘤細(xì)胞、正常胚胎和成人組織交叉反應(yīng)[13]。故只有細(xì)胞膜表面的CEA分子的結(jié)合才是與治療效果相關(guān)的有效結(jié)合，選用CEA表達(dá)陽(yáng)性的活細(xì)胞作為模擬腫瘤宿主細(xì)胞與單抗注射液反應(yīng)。LS180不僅是結(jié)腸癌細(xì)胞，而且在細(xì)胞膜表面高表達(dá)靶抗原CEA，其表達(dá)強(qiáng)度在目前已知的結(jié)腸癌細(xì)胞中幾乎是最高的幾種細(xì)胞系之一，符合免疫結(jié)合活性測(cè)定的細(xì)胞的要求，且較LS174T細(xì)胞更易培養(yǎng)，操作時(shí)實(shí)用性較強(qiáng)。

細(xì)胞準(zhǔn)備：取約1.7×108個(gè)活細(xì)胞，用PBS洗滌細(xì)胞2次，再用適量EDTA的消化液消化細(xì)胞，然后加入適量含血清的完全培養(yǎng)基終止消化，吹散成單個(gè)細(xì)胞狀態(tài)，采用臺(tái)盼藍(lán)染色法計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量和活度。1 000 g離心5 min收獲細(xì)胞，再用40 mL不含血清的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞至每毫升3.52×107個(gè)細(xì)胞。

2.3 反應(yīng)時(shí)間的選擇

由于其他單抗注射液的測(cè)定免疫反應(yīng)活性時(shí)細(xì)胞濃度單一化，免疫反應(yīng)活性不夠精確，故設(shè)定梯度細(xì)胞濃度分別與標(biāo)記抗體在4 ℃反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間設(shè)為1、2、4、8、16、20 h。

2.4 反應(yīng)溫度的選擇

確定了細(xì)胞濃度外推法和最佳反應(yīng)時(shí)間以后，設(shè)定不同的反應(yīng)溫度4 ℃與37 ℃，觀察免疫反應(yīng)活性的改變。

2.5 分離方法的選擇

分別用直接離心法、葡聚糖凝膠層析法[14](尖底)、葡聚糖凝膠層析法(圓底)進(jìn)行洗脫，測(cè)定計(jì)數(shù)率，確定合適的分離方法。

3 結(jié)果和討論

3.1 方法學(xué)建立

3.1.1 反應(yīng)時(shí)間的確定 不同濃度細(xì)胞分別與標(biāo)記抗體在4 ℃反應(yīng)，設(shè)定不同反應(yīng)時(shí)間，得到的放射性檢測(cè)結(jié)果列入表1。由表1可知：隨著細(xì)胞濃度降低，Ntot/N逐漸增加，但在1、2、4、8 h時(shí)，Ntot/N增加幅度過(guò)大，無(wú)法求出當(dāng)細(xì)胞濃度無(wú)限大時(shí)的Ntot/N值。反應(yīng)16 h和20 h細(xì)胞濃度的倒數(shù)對(duì)直接結(jié)合百分?jǐn)?shù)倒數(shù)的線性擬合圖示于圖1。由圖1可知：16 h和20 h細(xì)胞免疫反應(yīng)活性分別約為75%和79%，均達(dá)到合格標(biāo)準(zhǔn)；當(dāng)反應(yīng)時(shí)間達(dá)到16 h以上時(shí)，才可能將抗原數(shù)量外推至無(wú)窮大，獲得穩(wěn)定的免疫反應(yīng)活性。因此本實(shí)驗(yàn)選擇16 h作為反應(yīng)時(shí)間。

表1 不同反應(yīng)時(shí)間的計(jì)數(shù)率Table 1 Counting rate of different reaction time

注：t=4 ℃；A-1=Ntot/N=總計(jì)數(shù)率/(各組細(xì)胞濃度計(jì)數(shù)率-本底對(duì)照計(jì)數(shù)率)(下同)；括號(hào)內(nèi)數(shù)據(jù)為總計(jì)數(shù)率

圖1 反應(yīng)16 h(a)和20 h(b)細(xì)胞濃度的倒數(shù)對(duì)直接結(jié)合百分?jǐn)?shù)倒數(shù)的線性擬合圖Fig.1 Reciprocal cell concentration-combined with the reciprocal of the percentage chart reacting for 16 h(a) and 20 h(b)

3.1.2 反應(yīng)溫度的確定 4 ℃與37 ℃各細(xì)胞濃度的計(jì)數(shù)率比較列入表2。由表2可知，在37 ℃下各個(gè)細(xì)胞濃度的計(jì)數(shù)率均低于4 ℃下各個(gè)細(xì)胞濃度的值，同時(shí)由于在37 ℃時(shí)，LS180活細(xì)胞會(huì)不斷分泌出可溶性CEA分子，很難控制反應(yīng)時(shí)的抗原濃度，故選擇較短的時(shí)間進(jìn)行免疫反應(yīng)。由表2還可知，37 ℃下免疫反應(yīng)不充分，所以選擇4 ℃作為反應(yīng)溫度。細(xì)胞濃度的倒數(shù)對(duì)直接結(jié)合百分?jǐn)?shù)倒數(shù)的線性擬合示于圖2。由圖2可知，在4 ℃反應(yīng)16 h，細(xì)胞免疫反應(yīng)活性約為76%，達(dá)到合格標(biāo)準(zhǔn)。

表2 4 ℃與37 ℃各細(xì)胞濃度的計(jì)數(shù)率Table 2 Counting rate of each cell concentration at 4 ℃ and 37 ℃ min-1

注：括號(hào)內(nèi)數(shù)據(jù)為總計(jì)數(shù)率

4 ℃反應(yīng)16 h圖2 細(xì)胞濃度的倒數(shù)對(duì)直接結(jié)合百分?jǐn)?shù)倒數(shù)的線性擬合圖Fig.2 Reciprocal cell concentration-combined with the reciprocal of the percentage chart

3.1.3 分離方法的確定 將直接離心法、葡聚糖凝膠層析法[14](尖底)、葡聚糖凝膠層析法(圓底)測(cè)定的放射性計(jì)數(shù)率列入表3。由表3可知，直接離心法與凝膠柱法(圓底)測(cè)得的數(shù)據(jù)比較準(zhǔn)確。但由于凝膠柱法(圓底)需要剪掉底部軟管，容易造成未結(jié)合抗體回流至柱芯，得到的放射性計(jì)數(shù)率不能準(zhǔn)確表示免疫反應(yīng)活性；而直接離心法更加簡(jiǎn)單、快速，易于操作，故選擇直接離心法。

表3 不同分離方法測(cè)定的計(jì)數(shù)率Table 3 Counting rate of different separation methods min-1

3.2 方法學(xué)驗(yàn)證

本實(shí)驗(yàn)建立碘[131I]愛(ài)克妥昔單抗注射液免疫反應(yīng)活性檢測(cè)方法后，共做三批樣品發(fā)貨的免疫反應(yīng)活性分析，而后每天取出一件-20 ℃冷凍保存的碘[131I]愛(ài)克妥昔單抗注射液進(jìn)行48、72、96 h檢測(cè)，共計(jì)12次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果列入表4。由表4可知，三批樣品直接結(jié)合百分?jǐn)?shù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差(s)最大為5.017%，批間變異系數(shù)(CV)最大為7.81%，反應(yīng)了本方法檢測(cè)碘[131I]愛(ài)克妥昔單抗注射液免疫反應(yīng)活性有較高的精密度，隨機(jī)誤差相對(duì)小，這是一種準(zhǔn)確性高的測(cè)定方法。

3.3 碘[131I]愛(ài)克妥昔單抗注射液免疫反應(yīng)活性的質(zhì)量穩(wěn)定性

由表4中三批數(shù)據(jù)繪制成免疫反應(yīng)活性變化曲線示于圖3。由圖3可知，碘[131I]愛(ài)克妥昔單抗注射液在5 d內(nèi)直接結(jié)合百分?jǐn)?shù)隨時(shí)間的推移而逐漸降低，免疫反應(yīng)活性均大于50%，達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。

●——樣品1，○——樣品2，△——樣品3圖3 免疫反應(yīng)活性變化曲線圖Fig.3 Immune activity change curves

樣品編號(hào)儲(chǔ)存時(shí)間/hAAs/%CV/%A±2s12474．31%74．84%0．94991．27(74 84±1 90)%22474．28%32475．94%14871．90%67．73%3．8345．66(67 73±7 67)%24864．36%34866．92%17266．14%64．24%5．0177．81(64 24±10 03)%27268．03%37258．55%19670．49%66．01%3．9355．96(66 01±7 87)%29664．45%39663．10%

4 結(jié) 論

通過(guò)采用活細(xì)胞結(jié)合百分?jǐn)?shù)法，選擇CEA表達(dá)陽(yáng)性的LS180活細(xì)胞，反應(yīng)時(shí)間為16 h，反應(yīng)溫度為4 ℃，分離方法為直接分離法，該方法批間變異系數(shù)小于10%，能夠較準(zhǔn)確地測(cè)出愛(ài)克妥昔單抗注射液的免疫反應(yīng)活性，提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

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1.原子高科股份有限公司，北京 102413；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 腫瘤醫(yī)院 分子腫瘤學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021

New Method to Inspection Immune Activity of Iodine[131I] Aiketuoxi Monoclonal Antibody Injection

JIA Ying-ying1, CUI Hai-ping1, SHEN Zhen-fang1, RAN Yu-liang2, WANG Xiao-jing1,*

1.Atom-Hitech Company, Beijing 102413, China；2.State Key Laboratory of Molecular Oncology, Cancer Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences(CAMS)&Peking Union Medical College, Beijing 100021, China

A method for identifying the immuneactivity of iodine [131I]aiketuoxi monoclonal antibody injection was developed. The paper reported the method of percentage of living cells. Cell selection, the effect of temperature, time and separation method were studied, and as well as the stability of the product and the coefficient of variation were analysed by the method. The cell line was CEA expression positive LS180 cell, reaction time was 16 h, reaction temperature was 4 ℃, and it used a direct separation method. The variation coefficient of the method was less than 10%. The method has good reproducibility and can be used for analysis the immuneactivity of iodine [131I]aiketuoxi monoclonal antibody injection.

131I; monoclonal antibody; immunoreactivity

2015-11-16；

2016-01-15；

時(shí)間：2017-01-03

賈瑩瑩(1984—)，女，安徽含山人，碩士，工程師，放射性同位素技術(shù)專業(yè)

*通信聯(lián)系人：王曉靜(1970—)，女，遼寧錦州人，研究員，主要從事放射性藥物研究工作，E-mail: wangxj70@163.com

R811

A

0253-9950(2017)01-0121-05

10.7538/hhx.2016.YX.2015100