土槿皮乙酸抗人宮頸癌Siha細胞及其機制研究

付瓊++李文霞++殷金鳳+++潘敏

[摘要] 目的 探討土槿皮乙酸（PAB）對人宮頸鱗癌Siha細胞的增殖抑制和凋亡誘導作用及其相關機制。 方法 根據不同PAB濃度和作用時間，將Siha細胞分為對照組（0 μmol/L）及1、2、4、8、16 μmol/L PAB組和24、48、72 h組。采用CCK-8試劑盒檢測不同濃度（0、1、2、4、8、16 μmol/L）PAB作用不同時間（24、48、72 h）后對Siha細胞的增殖抑制率。采用免疫印跡法檢測不同濃度PAB（0、2、4、8 μmol/L）作用48 h后Siha細胞PI3K/Akt/GSK-3β信號通路及凋亡相關蛋白Bax和Bcl-2表達變化。 結果 1、2、4、8、16 μmol/L PAB對Siha細胞增殖均有抑制作用，且呈劑量-時間依賴效應關系。與0 μmol/L PAB對照組比較，2、4、8 μmol/L PAB組Siha細胞PI3K、p-Akt、p-GSK-3β和抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表達明顯下調，促凋亡蛋白Bax表達明顯增加（P < 0.05）。 結論 PAB具有抗人宮頸鱗癌Siha細胞作用，且可能與PI3K/Akt/GSK-3β信號通路抑制及上調Bax和下調Bcl-2表達有關。

[關鍵詞] 土槿皮乙酸；宮頸癌；增殖；凋亡

[中圖分類號] R737.33 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2016）11（a）-0029-04

Study on the inhibition effect of pseudolaric acid B in human cervical carcinoma cell line Siha and its mechanism

FU Qiong LI Wenxia YIN Jinfeng PAN Min

Department of Gynecology and Obstetrics， Chengdu Second People's Hospital， Sichuan Province， Chengdu 610017， China

[Abstract] Objective To explore the effect of pseudolaric acid B （PAB） on human cervical carcinoma cell line Siha and its mechanism. Methods Siha cells were divided into control group （0 μmol/L PAB） and 1， 2， 4， 8， 16 μmol/L PAB group according to the concentrations of PAB， and 24， 48， 72 h group according to the treating time of PAB. The inhibitory effect of different concentrations of PAB （0， 1， 2， 4， 8， 16 μmol/L） and different exposure time （24， 48， 72 h） on Siha cells were measured by CCK-8 essay. The protein expression levels of PI3K， Akt， p-Akt， GSK-3β， p-GSK-3β， Bax and Bcl-2 were detected by immunoblotting. Results 1， 2， 4， 8， 16 μmol/L PAB had remarkable inhibiting effects on Siha cells and in a dose- and time-dependent manner. The protein expression levels of PI3K， p-Akt， p-GSK-3β and Bcl-2 were decreased in 2， 4， 8 μmol/L group of Siha cells than 0 μmol/L group after 48 exposure （all P < 0.05）. On the contrary， the protein expression level of Bax was increased （P < 0.05）. Conclusion PAB can inhibit the proliferation of Siha cells， its mechanism may be related to the inhibition of PI3K/Akt/GSK-3β signaling pathway and the up-regulation of Bax and down-regulation of Bcl-2.

土槿皮為松科植物金錢松的干燥根皮或近根樹皮，土槿皮乙酸（pseudolaric acid B，PAB）是從土槿皮中提取分離得到的新型二萜酸化合物。有研究表明PAB具有抗真菌[1]、抗腫瘤[2-5]、抗血管生成[6-7]、激活過氧化物酶體增生物激活受體[8]等藥理作用。宮頸癌是女性常見的惡性腫瘤之一，在發(fā)展中國家尤為常見，是婦科三大惡性腫瘤之一，嚴重威脅婦女的健康[9]。因此，研究藥物對人宮頸癌細胞作用的分子機制，對宮頸癌的治療和預防具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和設備

PAB購于成都瑞芬思生物科技公司（規(guī)格：500 mg，批號：20160412）；RPMI1640培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）購于上海吉諾生物科技公司；胎牛血清購于杭州四季青生物公司（批號：160413）；CCK-8試劑盒（批號：20160318）、BCA試劑盒（批號：20160317）購于武漢科瑞生物科技公司；RAPI裂解液（批號：20160317）、抗β-actin（貨號：GB13001-3）一抗購于武漢谷歌生物公司；抗PI3K（貨號：4257）、Akt（貨號：9272）、p-Akt（貨號：4060）、GSK-3β（貨號：9315）、p-GSK-3β（貨號：9322）、Bax（貨號：5023）和Bcl-2（貨號：3498）一抗購于美國CST公司；羊抗兔熒光二抗（貨號：C40109-04）購于美國LI-COR公司。CO2培養(yǎng)箱為德國BINDER公司產品（BD53型）；倒置顯微鏡為日本OLYMPUS公司產品（CKX31型）；酶標儀為美國PerkinElmer公司產品（1420型）；電泳電轉儀為北京六一儀器廠產品（DYCZ-40D型）；雙色紅外激光成像系統(tǒng)為美國LI-COR公司產品（Odyssey）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人宮頸鱗癌Siha細胞購于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、青霉素100 U/mL和鏈霉素100 μg/mL），于5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 細胞增殖抑制率檢測 Siha細胞以5×103/孔種于96孔板，24 h后更換含不同濃度PAB的培養(yǎng)基100 μL。藥物濃度分別為0、1、2、4、8、16 μmol/L，每個濃度設6個副孔，分別于24、48、72 h更換CCK-8檢測試劑100 μL（90 μL RMPI1640培養(yǎng)基+10 μL CCK-8液），于5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育4 h，用酶標儀在450 nm波長檢測各孔的吸光度值（A）。實驗重復3次。計算細胞增殖抑制率：抑制率（%）=（1-實驗組平均A值/對照組平均A值）×100%。

1.2.3 免疫印跡實驗 A2780細胞以2×105/孔種于6孔板，24 h后更換含不同濃度PAB的培養(yǎng)基1.5 mL，藥物濃度分別為0（對照組）、2、4、8 μmol/L，48 h后吸出培養(yǎng)基，預冷PBS洗1遍，向每孔細胞中加入預冷的RIPA裂解液（含1%苯甲基磺酰氟）200 μL，冰上靜置5 min后用細胞刮刮下細胞轉入無菌EP管中，冰上裂解30 min。12 000g低溫離心5 min，取上清，每個樣本取20 μL上清用BCA法測定蛋白樣品濃度，剩余蛋白上清加入上樣緩沖液充分混勻后100℃水浴加熱10 min。每孔20 μg蛋白體系，行10% SDS-PAGE凝膠電泳，電轉移至PVDF膜；3%脫脂奶粉封閉1 h，一抗（PI3K 1∶1000、Akt 1∶1000、p-Akt 1∶2000、GSK-3β 1∶1000、p-GSK-3β 1∶1000、Bax 1∶1000、Bcl-2 1∶1000、β-actin 1∶2000）4℃搖床孵育過夜；洗膜后加入熒光山羊抗兔二抗（1∶10 000）室溫搖床孵育1 h，洗膜后于雙色紅外激光成像系統(tǒng)掃描收集熒光信號。以β-actin為內參照，采用QuantityOne-v4.6.2軟件對Western條帶進行定量分析，蛋白條帶與內參的灰度比值為相對表達水平。

1.3 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 17.0進行統(tǒng)計學處理，計量資料采用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，各實驗組與對照組間的兩兩比較采用Dunnett法，實驗組之間的兩兩比較采用SNK法。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度PAB作用不同時間后對Siha細胞增殖抑制率的影響

與對照組比較，1、2、4、8、16 μmol/L PAB處理Siha細胞24、48、72 h后，細胞增殖受到明顯抑制，且與藥物作用時間和藥物濃度呈正相關，差異均有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見表1。

2.2 PAB對Siha細胞PI3K/Akt/GSK-3β信號通路的影響

與對照組比較，2、4、8 μmol/LPAB作用48 h后，PI3K、p-Akt和p-GSK-3β蛋白表達減少（P < 0.05），而Akt和GSK-3β蛋白表達與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。此外，與2 μmol/L組比較，4 μmol/L組細胞PI3K和p-GSK3β蛋白表達降低（P < 0.05），同時，與4 μmol/L組比較，8 μmol/L組細胞PI3K、p-Akt和p-GSK-3β蛋白表達下調（P < 0.05）。因此，PAB能下調PI3K、p-Akt和p-GSK-3β蛋白表達，且呈現一定的劑量依賴性。見圖1。

2.3 PAB對Siha細胞凋亡相關蛋白Bax和Bcl-2表達的影響

與對照組比較，2、4、8 μmol/LPAB處理組細胞促凋亡蛋白Bax表達增加（P < 0.05），而抗凋亡蛋白Bcl-2表達下調（P < 0.05）。此外，與4 μmol/L組比較，8 μmol/L組細胞Bax蛋白表達減少，且4 μmol/L組和8 μmol/L組細胞Bcl-2蛋白表達分別較2 μmol/L組和4 μmol/L組減少（P < 0.05）。因此PAB可上調促凋亡蛋白Bax的表達，下調抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，且呈現一定的劑量依賴性。見圖2。

3 討論

宮頸癌是女性最常見的生殖道惡性腫瘤，占女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的半數以上，嚴重威脅女性的健康[10]。PAB是從土槿皮中提取分離得到的新型二萜酸化合物。研究表明PAB對于多種腫瘤細胞具有較強的抑制作用[2-5]。本實驗用PAB體外實驗研究觀察該藥對Siha細胞的抑制作用。結果表明，PAB在1～16 μmol/L濃度范圍內對Siha細胞的增殖均有抑制作用，并呈現明顯的劑量和時間依賴效應關系，表明該藥對宮頸癌有治療潛能。

研究表明，磷酸肌醇-3-激酶/蛋白激酶B（phosphoinositide-3-kinese/protein kinase B，PI3K/Akt）通路與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉移、治療耐藥性密切相關[11]，細胞在一系列內外因素的作用下，通過PI3K/Akt信號轉導通路，誘導細胞的增殖、分化，避免細胞發(fā)生凋亡[12]。GSK3是一種可以調控多種細胞功能的關鍵酶[13]，是調節(jié)糖原合成的關鍵激酶，磷酸化糖原合酶并使之失活，從而抑制糖原合成促進糖代謝[14]，同時參與到多種信號通路的調節(jié)[14-16]。研究[17-18]表明GSK3的激活在多種情況下參與到細胞凋亡過程。Saiprasad等[19]研究表明GSK-3β參與到PI3K/AKT介導的細胞凋亡過程。本研究為了研究PI3K/AKT/GSK-3β在PAB誘導宮頸癌Siha細胞凋亡中的作用，采用不同濃度的PAB處理Siha細胞，結果表明，在2、4、8 μmol/LPAB作用48 h后，PI3K、p-Akt和p-GSK-3β蛋白表達明顯減少，而Akt和GSK-3β蛋白表達無變化，說明PAB可抑制Siha細胞PI3K/AKT/GSK-3β信號通路。

Bcl-2家族成員在腫瘤細胞凋亡中也發(fā)揮重要作用[20]。Bax活化后引起細胞色素C釋放到胞漿中并與apaf-1結合激活Caspase-9，然后激活下游的Caspase-3等。在不同濃度PAB對誘導的Siha細胞凋亡中，本研究發(fā)現2、4、8 μmol/LPAB處理組Siha細胞促凋亡蛋白Bax表達明顯增加，而抗凋亡蛋白Bcl-2表達明顯下調，且呈現一定的劑量依賴性，表明PAB通過增加Bax/Bcl-2的比例，激活以線粒體為中心的信號轉導途徑而誘導細胞凋亡。

綜上所述，PAB為一種具有潛在抗人宮頸癌作用的中藥活性成分，可通過抑制PI3K/Akt/GSK-3β信號通路來抑制細胞的增殖，并通過促進促凋亡蛋白Bax的表達和抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達來促進宮頸癌細胞的凋亡，為臨床應用PAB治療宮頸癌提供了有力的實驗證據和理論依據，為新藥的研發(fā)開辟了新領域。

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（收稿日期：2016-08-04 本文編輯：張瑜杰）