補(bǔ)骨脂乙醇提取物小鼠灌胃急性及亞急性毒性試驗(yàn)研究

阿卜杜米吉提·阿卜力孜+阿布都吉力力·阿布都艾尼+艾西木江·熱甫卡提+尤力都孜·買買提+李治建+斯拉甫·艾白

[摘要] 目的 研究補(bǔ)骨脂乙醇提取物（EEPF）的急性毒性特點(diǎn)。 方法 急性毒性分對(duì)照組和EEPF組[12.0 g/（kg·d）]，灌胃給藥，亞急性毒性分對(duì)照組和EEPF 0.65、1.30 g/kg組，灌胃給藥14 d，進(jìn)行一般觀察，檢測(cè)體重、臟器重量及系數(shù)、血液學(xué)及血液生化學(xué)，并進(jìn)行肝臟、腎臟組織病理學(xué)檢查。 結(jié)果 急性毒性小鼠死亡14只，可見(jiàn)肝臟中央靜脈擴(kuò)張充血，部分腎小管擴(kuò)張；亞急性毒性給藥14 d未見(jiàn)明顯反應(yīng)，EEPF低劑量組雄性脾臟重量及系數(shù)明顯降低、雌性胸腺重量及系數(shù)明顯升高（P < 0.05），雌性高劑量組體重明顯升高（P < 0.05）、腎臟系數(shù)顯著降低（P < 0.01）；血液學(xué)：EEPF組雄性中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)（NEUT）比例（%）、單核細(xì)胞（MONO）比例（%）明顯降低（P < 0.05），紅細(xì)胞（RBC）、血紅蛋白（HGB）、血細(xì)胞比容（HCT）（%）、淋巴細(xì)胞（LYMPH）（%）明顯升高（P < 0.05），雌性RBC明顯升高（P < 0.05），血小板計(jì)數(shù)（PLT）和血小板壓積（PCT）顯著升高（P < 0.01）；血液生化學(xué)：EEPF雄性低劑量組A/G顯著升高（P < 0.01），尿素氮（BUN）明顯升高（P < 0.05），高劑量組丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）和三酰甘油（TG）顯著降低（P < 0.01），雌性低、高劑量組總膽紅素（TBIL）明顯降低（P < 0.05），TG顯著降低（P < 0.01），總膽汁酸（TBA）和ALT明顯升高（P < 0.05），高劑量球蛋白（GLOB）明顯降低（P < 0.05）；EEPF組出現(xiàn)肝細(xì)胞壞死、腎小球萎縮。 結(jié)論 EEPF最大給藥量12.0 g/kg可致部分小鼠70%死亡；亞急性毒性EEPF 0.65、1.30 g/kg對(duì)小鼠血液學(xué)、血液生化學(xué)有一定影響，肝臟、腎臟可見(jiàn)毒性病變。

[關(guān)鍵詞] 補(bǔ)骨脂乙醇提取物；小鼠；急性；亞急性；毒性

[中圖分類號(hào)] R285.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2016）11（a）-0020-05

補(bǔ)骨脂為豆科植物補(bǔ)骨脂Psoralea corylifolia L.的干燥成熟果實(shí)，是中醫(yī)、維吾爾醫(yī)常用藥材[1]，具有溫腎助陽(yáng)、納氣平喘、溫脾止瀉等作用，用于腎陽(yáng)不足、陽(yáng)痿遺精等，外用治白癜風(fēng)、斑禿[2-3]?！缎l(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)——維吾爾藥分冊(cè)》收載的含補(bǔ)骨脂的白癜風(fēng)治療制劑有9種[4]；《中國(guó)藥典》（2015年版）中收載的含補(bǔ)骨脂的中成藥就有40種[2]，臨床應(yīng)用更廣泛。有報(bào)道補(bǔ)骨脂及其復(fù)方具有肝毒性[5-11]，其安全性值得關(guān)注。如不能闡明其毒性的特點(diǎn)，將會(huì)限制補(bǔ)骨脂的推廣使用。本研究對(duì)補(bǔ)骨脂乙醇提取物（ethanol extract of Psoraleae Fructus，EEPF）小鼠灌胃急性及亞急性毒性進(jìn)行研究，探討其毒性作用及靶器官，為其重復(fù)給藥毒性研究提供相關(guān)的信息，以及臨床應(yīng)用急性中毒解毒提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

1.1.1 藥品

EEPF，批號(hào)：20160310，按高效液相色譜法測(cè)定[2]，含補(bǔ)骨脂素5.22 mg/g、異補(bǔ)骨脂素3.78 mg/g和補(bǔ)骨脂酚231.15 mg/g。藥材購(gòu)自新疆齊康哈博維藥有限責(zé)任公司（批號(hào)：20151027），由新疆維吾爾醫(yī)藥研究所希爾艾力主任藥師鑒定為正品。提取方法：取藥材10 kg，10倍量75%乙醇加熱回流提取1 h，共3次，合并提取液濃縮干燥，出膏率為9.51%。

1.1.2 試劑

丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）（批號(hào)：140215003）；天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）（批號(hào)：140115002）；堿性磷酸酶（ALP）（批號(hào)：140314022）；尿素氮（BUN）（批號(hào)：141315001）；肌酐（Cr）（批號(hào)：141315016）；總蛋白（TP）（批號(hào)：140815002）；白蛋白（ALB）（批號(hào)：140915013）；總膽固醇（TC）（批號(hào)：141615013）；血糖（GLU）（批號(hào)：141515012）；總膽紅素（TBIL）（批號(hào)：140615012）；磷酸肌酸激酶（CK）（批號(hào)：142515012）；三酰甘油（TG）（批號(hào)：141715014）；谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（GGT）（批號(hào)：141715032），均由深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司提供。血液學(xué)試劑，SYSMEX公司，批號(hào)：A2007。

1.2 動(dòng)物

昆明小鼠，體重（20±2）g，購(gòu)自新疆實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，SPF級(jí)，許可證號(hào)：SCXK（新）2011-0001。飼養(yǎng)于新疆維吾爾醫(yī)藥研究所SPF級(jí)動(dòng)物房，自由飲水、攝食，室溫20～26℃，濕度40%～70%，光照/黑暗12/12 h。

1.3 方法

1.3.1 EEPF急性毒性試驗(yàn)

1.3.1.1 分組及劑量 設(shè)對(duì)照組（0.5%CMC-Na）、EEPF [12.0 g/（kg·d）]組，每組20只，雌、雄各半。按補(bǔ)骨脂藥材每天臨床用量10 g[2]、出膏率為9.51%計(jì)算，相當(dāng)于日服用提取物0.951 g，EEPF 12.0 g/（kg·d）相當(dāng)于臨床人（60 kg計(jì)算）每公斤體重用藥量的約750倍。

1.3.1.2 給藥方法 以EEPF最大配制濃度20%，每次灌胃給藥0.3 mL/10 g（每次6.0 g/kg），2次/d，間隔4～5 h給藥第2次，合計(jì)12.0 g/（kg·d）。進(jìn)行常規(guī)指標(biāo)觀察。

1.3.2 EEPF亞急性毒性試驗(yàn)

1.3.2.1 分組及劑量 小鼠隨機(jī)分組，每組20只，雌、雄各半，設(shè)對(duì)照組（Ⅰ組），EEPF 0.65 g/kg（Ⅱ組）、1.30 g/kg組（Ⅲ組），分別為臨床劑量的40、80倍。

1.3.2.2 給藥方法 以EEPF配制濃度3.4%（低劑量）、6.8%（高劑量），灌胃給藥0.2 mL/10 g，1次/d，共14 d。

1.4 觀察指標(biāo)

給藥前（D0）和給藥第1、4、7、11、14天稱取體重；末次給藥后禁食過(guò)夜毛細(xì)管眼眶采血加入抗凝劑檢測(cè)紅細(xì)胞（RBC）、白細(xì)胞計(jì)數(shù)（WBC）、血小板（PLT）、血紅蛋白（HGB）、血細(xì)胞比容（HCT）、平均紅細(xì)胞體積（MCV）、平均血紅蛋白量（MCH）、平均血紅蛋白濃度（MCHC）、網(wǎng)織紅細(xì)胞（Ret）。另外眼眶采血1.5 mL不加抗凝劑測(cè)定血液生化學(xué)指標(biāo)。取肝臟、腎臟、胸腺、脾臟稱重計(jì)算臟器系數(shù)（臟器重量/體重×100%），肝臟、腎臟于15%甲醛溶液固定，HE染色，觀察組織形態(tài)變化。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用PEMS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，組間比較時(shí)采用單因素方差分析，方差齊時(shí)用t檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)用秩和檢驗(yàn)。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EEPF急性毒性試驗(yàn)

第1次給藥后小鼠出現(xiàn)活動(dòng)減少、呼吸急促、倦怠、豎毛等癥狀，無(wú)死亡；第2次給藥后1 h內(nèi)死亡14只，其中雄性5只、雌性9只，解剖可見(jiàn)肝臟充血，剩余動(dòng)物24 h后恢復(fù)正常，觀察14 d未見(jiàn)明顯癥狀。由圖1～2可見(jiàn)，組織病理學(xué)檢查EEPF組肝臟中央靜脈擴(kuò)張充血，部分腎小管擴(kuò)張。

2.2 EEPF亞急性毒性試驗(yàn)

2.2.1 一般觀察

與Ⅰ組比較，亞急性毒性試驗(yàn)EEPF組給藥14 d未見(jiàn)明顯反應(yīng)，動(dòng)物無(wú)死亡。

2.2.2 體重、臟器重量級(jí)系數(shù)

與Ⅰ組比較，Ⅲ組雌性給藥第4～14天體重升高，雄性未見(jiàn)明顯改變（圖3～4）；雄性低劑量組脾臟重量及系數(shù)明顯降低（P < 0.05），雌性低劑量組胸腺重量及系數(shù)明顯升高（P < 0.05），雌性高劑量組腎臟系數(shù)顯著降低（P < 0.01）。

（n = 10）

2.2.3 血液學(xué)

與Ⅰ組比較，EEPF組雄性RBC、HGB、HCT、LYMPH明顯升高（P < 0.05），MONO明顯降低（P < 0.05），Ⅱ組NEUT明顯降低（P < 0.05），WBC顯著升高（P < 0.01）；雌性動(dòng)物Ⅲ組PLT、PCT顯著升高（P < 0.01），RBC明顯升高（P < 0.05），其余指標(biāo)與Ⅰ組比較未見(jiàn)明顯改變，見(jiàn)表2～3。

2.2.4 血液生化學(xué)

與Ⅰ組比較，雄性動(dòng)物Ⅲ組ALT、TG顯著降低（P < 0.01），Ⅱ組A/G顯著升高（P < 0.01），BUN明顯升高（P < 0.05）；雌性動(dòng)物EEPF組TBIL明顯降低（P < 0.05），TG顯著降低（P < 0.01），Ⅲ組GLOB明顯降低（P < 0.05），Ⅱ組ALT、TBA明顯升高（P < 0.05），其余指標(biāo)與Ⅰ組比較未見(jiàn)明顯改變，見(jiàn)表4～5。

2.2.5 組織病理學(xué)檢查

Ⅰ組肝腎組織未見(jiàn)明顯改變。EEPF組可肝細(xì)胞壞死、腎小球萎縮。見(jiàn)圖5～6。

3 討論

急性毒性EEPF可致70%動(dòng)物死亡，且雌性死亡多于雄性，死亡動(dòng)物肝臟中央靜脈擴(kuò)張充血，部分腎小管擴(kuò)張。亞急性毒性試驗(yàn)雌性高劑量組體重明顯升高，雄性體重未見(jiàn)明顯改變，EEPF組脾臟、胸腺重量及系數(shù)與對(duì)照組比較雖有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但均為低劑量改變，無(wú)明顯劑量效應(yīng)關(guān)系，考慮非藥物引起。血液生化學(xué)雄性ALT的降低、雌性TBIL的降低雖有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，無(wú)毒理學(xué)意義，雌雄小鼠TG均明顯降低，雌性GLOB有一定降低，判斷與影響肝臟脂質(zhì)代謝相關(guān)，組織病理學(xué)檢查可見(jiàn)EEPF組肝細(xì)胞壞死、腎小球萎縮，且雌性腎臟系數(shù)有一定降低，雌性ALT、TBA升高，臨床報(bào)道其肝損傷特點(diǎn)多為女性ALT、TBA升高，與臨床表現(xiàn)具有相似性[6，11]，判斷TG、GLOB的降低和LYMPH的升高與影響肝臟功能相關(guān)，考慮EEPF對(duì)雌性肝、腎有一定影響。

另外，EEPF可引起小鼠RBC、HGB、HCT、PCT升高，對(duì)小鼠血液學(xué)有一定影響。有文獻(xiàn)報(bào)道補(bǔ)骨脂素具有提高小鼠造血功能的作用[12-13]?！吨袊?guó)藥典》中含補(bǔ)骨脂的此類復(fù)方有“補(bǔ)腎養(yǎng)血丸”“再造生血片”等均作用于造血系統(tǒng)[14]。因此，判斷EEPF對(duì)小鼠血液學(xué)的影響可能與其功能主治相關(guān)。

補(bǔ)骨脂要含香豆素、黃酮等化合物[15-18]。臨床應(yīng)用[5-6]和毒理學(xué)研究[7-9]發(fā)現(xiàn)補(bǔ)骨脂及復(fù)方對(duì)肝臟有一定的毒性作用[19-21]。韓國(guó)曾報(bào)道了與食用補(bǔ)骨脂有關(guān)的急性肝炎病例[5]，部分含有補(bǔ)骨脂的中成藥亦偶見(jiàn)肝毒性報(bào)道[10]。2009年香港報(bào)道3例肝損害病例，患者均使用補(bǔ)骨脂方劑[11]。本研究可見(jiàn)EEPF可致肝細(xì)胞壞死、腎小球萎縮，其毒性特點(diǎn)、毒性成分及機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2016-07-11 本文編輯：張瑜杰）