納葛膠囊對(duì)心肌缺血模型大鼠心肌組織NF-κB-P65和IκB-α基因表達(dá)的影響*

任鳳梧 張樹明 徐惠梅 曹 蕊 姚 琳 郭雪瑩 馬 迪 王偉明

（黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院·哈爾濱 150036）

·方藥研究·

納葛膠囊對(duì)心肌缺血模型大鼠心肌組織NF-κB-P65和IκB-α基因表達(dá)的影響*

任鳳梧 張樹明 徐惠梅 曹 蕊 姚 琳 郭雪瑩 馬 迪 王偉明**

（黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院·哈爾濱 150036）

目的：觀察納葛膠囊對(duì)Wistar大鼠心肌缺血模型中細(xì)胞內(nèi)核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB-P65）活性和人核因子κB抑制蛋白α(IκB-α)的RNA表達(dá)，從而研究該藥對(duì)心肌缺血作用的可能機(jī)制。方法：健康Wistar大鼠90只，隨機(jī)分為空白組、模型組、心通口服液陽性對(duì)照組及納葛膠囊高、中、低劑量組。采用高脂飼料聯(lián)合異丙腎上腺素注射法制備大鼠心肌缺血模型，運(yùn)用聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)檢測(cè)大鼠心肌組織NF-κB-P65及IκB-α的基因表達(dá)。結(jié)果：納葛膠囊高、中、低劑量組與各模型組及心通口服液組比較，NF-κB-P65基因表達(dá)顯著降低，而IκB-α基因表達(dá)顯著升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05)。結(jié)論：納葛膠囊可以通過降低NF-κB-P65的表達(dá)水平，并提高IκB-α的基因表達(dá)，調(diào)節(jié)內(nèi)皮損傷介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，從而改善具有冠心病心肌缺血的作用。

冠心病 納葛膠囊 聚合酶聯(lián)反應(yīng) 心肌缺血 NF-κB-P65 IκB-α

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病簡(jiǎn)稱冠心病（CHD），指冠狀動(dòng)脈粥樣硬化使血管腔狹窄或阻塞，或（和）因冠狀動(dòng)脈功能性改變（痙攣）導(dǎo)致心肌缺血缺氧或壞死而引起的心臟病，亦稱作缺血性心臟病。近年來，隨著生活方式的改變、社會(huì)的發(fā)展、社會(huì)壓力的增加，社會(huì)心理因素對(duì)心血管疾病影響越來越大，尤其以冠心病多見。冠心病是心血管系統(tǒng)的常見病，其的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)，在我國屬于高發(fā)病，且年齡趨向年輕化，已經(jīng)嚴(yán)重威脅到人類的身心健康，因此冠心病的防治研究稱為醫(yī)學(xué)界的重要課題。

而細(xì)胞內(nèi)核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB-P65）和人核因子κB抑制蛋白α(IκB-α)在細(xì)胞因子誘導(dǎo)的基因表達(dá)中起關(guān)鍵性的調(diào)控作用，通過多種基因的表達(dá)，參與免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)等多種生物進(jìn)程，在冠心病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。其中核因子κB，首先由Sen等在B淋巴細(xì)胞核抽提物中檢測(cè)到[1-2]，后來現(xiàn)代分子生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)NF-κB存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞及心肌細(xì)胞中[3]，并參與冠心病的發(fā)生發(fā)展和急性心肌缺血事件，與冠心病的關(guān)系得到日益廣泛的重視。因此，通過觀察缺血心肌中NF-κB-P65和IκB-α檢測(cè)的PCR研究，進(jìn)而探討納葛膠囊治療冠心病的作用機(jī)制和療效。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物

納葛膠囊（原名：血暢膠囊），規(guī)格：0.3g/粒，主要由納豆激酶、葛根、人參、三七、黃芪等組成；心通口服液，規(guī)格：10ml/支，魯南厚普制藥有限公司生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號(hào)：國藥準(zhǔn)字Z10920014。鹽酸異丙腎上腺素注射液：上海禾豐制藥有限公司生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號(hào)：國藥準(zhǔn)字H31021344，規(guī)格2ml/支。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康Wistar大鼠90只，雌雄各半，體重（180±20）克；由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（黑）2013-001。

1.3 主要試劑

GOTaq 1-Step RT-qPCR System，南京佰杰斯生物技術(shù)有限公司

1.4 主要儀器

LDZX-75KB立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；NanoQuant infinite M200 PRO酶標(biāo)儀，TECAN貿(mào)易有限公司；全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)，北京恒奧德儀器儀表有限公司；WH-2微型漩渦混合儀，上海滬西分析儀器廠有限公司；Sovall ST-16R離心機(jī)，賽默飛世爾科技公司；培養(yǎng)箱/干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；紫外分析儀，上海馳唐電子有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 大鼠心肌缺血模型制作及分組

采用高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合鹽酸異丙腎上腺素腹腔注射法，建立大鼠冠心病模型[4]。健康Wistar大鼠90只，普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。隨機(jī)分為6組，每組15只，分別是正常組、模型組、心通口服液組及納葛膠囊高、中、低劑量組。正常組給予普通飼料飼喂，其余組以高脂飼料飼（配方：膽固醇2%、豬油10%、甲基硫氧嘧啶0.2%、牛膽酸鈉0.5%、基礎(chǔ)飼料87.3%）飼喂4周，喂食量為25g（100g體重24小時(shí)），保證其充足的飼料和飲水。

2.2 各組給藥方法

4周后開始灌胃給藥，每日灌胃一次，按10ml/kg液體量灌胃，正常組及模型組給予蒸餾水灌胃；心通口服液組給予心通口服液灌胃（按2.7ml/kg給藥，不足液體量應(yīng)用蒸餾水補(bǔ)足）；納葛膠囊各劑量組給予納葛膠囊混懸液灌胃，納葛膠囊高、中、低劑量組分別按0.648、0.342、0.171g/kg劑量配置相應(yīng)濃度混懸液；各組均每天一次，連續(xù)灌胃4周。自末次給藥前3d，除正常組外，其余各組皮下多點(diǎn)注射鹽酸異丙腎上腺素（5mg/kg體質(zhì)量），每日1次，連續(xù)3d，建立大鼠心肌缺血模型。末次注射后，各組動(dòng)物分別以10%水合氯醛(0.3ml/100g體質(zhì)量)腹腔注射麻醉，仰位固定，連接心電圖機(jī)，記錄末次注射異丙腎上腺素后5、10、20、30min的Ⅱ?qū)?lián)心電圖（見附圖1），觀察ST段的改變，以大鼠心電圖ST段抬高≥0.1mv作為造模成功的標(biāo)志。

2.3 標(biāo)本采集與處理

大鼠以10%水合氯醛（0.3ml/100g）腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血，迅速打開胸腔，取出心臟至冰上，剪取大鼠心室部分心臟組織，用含0.1%DEPC的0.01mmolPBS溶液沖洗，放入4%多聚甲醛固定液中（含0.1%DEPC的0.01mmolPBS）固定4h，組織常規(guī)脫水，石蠟包埋，進(jìn)行HE染色（見附圖2-7）。其余心臟組織于冰上絞碎研磨并標(biāo)記。

2.4 指標(biāo)檢測(cè)方法

采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）法[5]。用Trizol提取總RNA嚴(yán)格按說明書操作。建立25μL的擴(kuò)增反應(yīng)體系，依次加入下列試劑：cDNA1μL，ddH2O18.4μL，10×反轉(zhuǎn)錄緩沖液2.5μL，25mMgCl21.5μL，10mM dNTP混合物0.5μL，Taq酶0.5μL，目的基因及內(nèi)參基因上下游引物各0.3μL，引物序列見表1。混勻后放入PCR儀，擴(kuò)增條件如下：預(yù)變性94℃4min后進(jìn)入PCR循環(huán)：變性94℃1min，退火37-65℃1min，延伸72℃1min，共30個(gè)循環(huán)后，終延伸72℃7min。PCR產(chǎn)物分析：RCR結(jié)束后，取6μLPCR產(chǎn)物于1.7%瓊脂糖凝膠電泳，條帶在凝膠成像分析系統(tǒng)下進(jìn)行觀察記錄。電泳條件：60-80V，15-20分鐘；紫外分析儀檢查電泳結(jié)果。以GAPDH作內(nèi)參照[6]，進(jìn)行PCR產(chǎn)物的半定量分析。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以(x±s)表示。采用獨(dú)立樣本間兩兩比較的秩和檢驗(yàn)，檢驗(yàn)中α取雙尾為0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

各組大鼠心肌組織NF-κB-P65的表達(dá)水平結(jié)果顯示，納葛膠囊高、中低劑量組與模型組比較，基表達(dá)均降低：納葛膠囊中、低劑量組與心通口服液組比較表達(dá)降低，低劑量級(jí)降低不明顯。各組大鼠心肌組織IκB-α的表達(dá)水平結(jié)果，納葛膠囊高、中、低劑量組與模型組比較，基表達(dá)均升高；納葛膠囊中、低劑量組與心通口服液組比較表達(dá)明顯升高，低劑量組不明顯。

通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得出以下結(jié)論，與模型組及心通口服液組比較，納葛膠囊各劑量組NF-κB-P65的表達(dá)均減低，IκB-α的表達(dá)升高(p＜0.05)，其中納葛膠囊高劑量組及中劑量組降低明顯，尤其以納葛膠囊高劑量組降低最顯著（p＜0.01)。納葛膠囊可以有效抑制心肌組織中NF-κB-P65的表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)IκB-α的表達(dá)。

4 討論

在我國古代醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)中，并沒有“冠心病”的病名，但是卻有很多相關(guān)記載。根據(jù)本病的癥狀應(yīng)屬中醫(yī)“胸痹”、“心痛”等范疇。《內(nèi)經(jīng)》名“心痛”，如《靈樞·五邪》稱“邪在心，則病心痛”；《金匱要略》名“胸痹”，如胸痹首見于《金匱要略·胸痹心痛短氣病脈證治第九》，在該篇中論述胸痹的病因病機(jī)為“陽微陰弦”，即胸陽不振，中下焦有痰飲水濕等陰邪上犯，痹阻胸陽,氣血運(yùn)行不暢，致胸痹的發(fā)生。其發(fā)生發(fā)展是多種致病因素相互作用的結(jié)果，進(jìn)而導(dǎo)致臟腑功能失調(diào)、氣血紊亂、痰淤阻滯。

心臟的缺血可引起心肌組織細(xì)胞因子的失衡及核轉(zhuǎn)錄因子的過度增多，導(dǎo)致心肌的炎癥反應(yīng)、壞死、凋亡等。這些病理改變與κB位點(diǎn)的基因過度表達(dá)有關(guān)[7]，提示NF-κB以及IκB參與了缺血再灌注損傷的生理病理過程，是心臟應(yīng)激反應(yīng)快速表達(dá)的基因蛋白產(chǎn)物，直接反應(yīng)心肌和血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。

納葛膠囊是黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院根據(jù)長期的臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)出的一個(gè)經(jīng)驗(yàn)方，其主要成份為納豆激酶、葛根、黃芪等中藥，納豆激酶具有溶解血栓、降低血液粘度、改善血液循環(huán)、軟化和增加血管彈性[8]的作用；葛根有升陽解肌，舒經(jīng)活絡(luò)的功效；方中黃芪益氣固表，全方嚴(yán)密配伍，治以補(bǔ)氣活血，意在補(bǔ)氣生血，正所謂“氣行則血行”，具有益氣而不破氣，活血而不破血，通陽舒經(jīng)而不純補(bǔ)陽氣的特點(diǎn)。該藥率先把現(xiàn)代生物發(fā)酵技術(shù)與逆流連續(xù)提取技術(shù)相結(jié)合，快速溶栓、降脂[9]，達(dá)到溶栓不破血的目的。而現(xiàn)代中藥藥理研究證明，葛根具有降低心肌耗氧量，使冠脈血流量增加，緩解心絞痛、抗心肌缺血等作用[10],黃芪總皂苷對(duì)心血管疾病的作用主要有：強(qiáng)心、保護(hù)心肌細(xì)胞等[11]。中醫(yī)藥很好的彌補(bǔ)了西醫(yī)治療的不足，從根本上著手，有效的改善了患者的癥狀，提高了患者的生存質(zhì)量，減少患者病死率，療效確切，已經(jīng)被普遍接受。

綜上所述，本研究結(jié)果表明納葛膠囊能夠抑制NF-κB-P65和IκB-α的基因表達(dá)，從而抑制心肌血管，內(nèi)皮的炎癥反應(yīng)，減慢了動(dòng)脈粥樣硬化的形成，具有抗冠心病心肌缺血的作用。

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* 黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目：H201459

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