葡萄酒蘋果酸—乳酸發(fā)酵高耐受性優(yōu)良植物乳桿菌直投式發(fā)酵劑的優(yōu)化

張莉+段浩云+田洪濤

摘要：從葡萄酒二次發(fā)酵液中篩選的優(yōu)良植物乳桿菌L42為研究對象，對菌株L42的高效直投式發(fā)酵劑進(jìn)行研制。利用單因素試驗和正交試驗對菌株L42最佳增殖培養(yǎng)基、離心條件、凍干保護(hù)劑進(jìn)行優(yōu)化，得到植物乳桿菌L42最佳廉價培養(yǎng)基為番茄汁基礎(chǔ)培養(yǎng)基、0.2% K2HPO4、0.5%胰蛋白胨、1.5%蛋白胨、2.5%葡萄糖，培養(yǎng)后活菌數(shù)可達(dá)到57.8億CFU/mL，與番茄汁基礎(chǔ)培養(yǎng)基相比提高了8.41倍；最佳離心條件為6 000 r/min、10 min，離心后活菌數(shù)收得率可達(dá)99.37%；最佳凍干保護(hù)劑的配方為10%脫脂乳、10%海藻糖、1.5%谷氨酸鈉、1%吐溫80、0.5%酵母浸粉，凍干存活率為89.01%；凍干后的植物乳桿菌L42在11%乙醇度、130 mg/L SO2、pH值3.0的環(huán)境下能夠正常增殖，將獲得的直投式發(fā)酵劑于4 ℃下保存11個月后活菌數(shù)仍可達(dá)到10億CFU/mL。

關(guān)鍵詞：葡萄酒；植物乳桿菌；離心濃縮；凍干保護(hù)劑；直投式發(fā)酵劑

中圖分類號： TS201.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）01-0167-04

蘋果酸-乳酸發(fā)酵（MLF）是乳酸菌以雙羧基L-蘋果酸為反應(yīng)底物，在蘋果酸-乳酸酶的作用下，轉(zhuǎn)變成單羧基的 L-乳酸和二氧化碳的過程[1-2]。經(jīng)MLF作用后，果酒中的蘋果酸被分解為乳酸而達(dá)到降低酸度作用；同時乳酸菌代謝活動還可以改變果酒中的酯類、醛類、氨基酸、有機(jī)酸和維生素等微量成分的含量以及呈香物質(zhì)的濃度，有利于形成酒體風(fēng)味復(fù)雜性[3-4]。當(dāng)葡萄酒酸度較高時，釀造出的葡萄酒口感較酸澀，須要進(jìn)行MLF改善其風(fēng)味[5]。

直投式發(fā)酵劑（directed vet set starters，DVS Starters）是高度濃縮和標(biāo)準(zhǔn)化的冷凍干燥發(fā)酵微生物菌種，因使用時不須要活化和擴(kuò)培處理而受到發(fā)酵行業(yè)的廣泛歡迎。目前，直投式發(fā)酵劑在歐美等發(fā)達(dá)國家得到了廣泛應(yīng)用[6-7]，在葡萄酒生產(chǎn)中得到普遍應(yīng)用，而國內(nèi)該領(lǐng)域的相關(guān)研究和應(yīng)用均較少。筆者已經(jīng)從自然發(fā)酵的葡萄酒中篩選得到對乙醇度、SO2濃度、pH值具有高耐受性的植物乳桿菌L42，本研究旨在通過單因素和正交試驗對植物乳桿菌L42的復(fù)合增殖培養(yǎng)基、最適離心條件及凍干保護(hù)劑進(jìn)行優(yōu)化，確定適合葡萄酒二次發(fā)酵的優(yōu)良植物乳桿菌高效直投式發(fā)酵劑研制參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌株來源 菌種為植物乳桿菌L42，由筆者所在實驗室從自然發(fā)酵的葡萄酒中分離篩選所得。

1.1.2 培養(yǎng)基 （1）復(fù)原脫脂乳培養(yǎng)基的制備。脫脂奶粉加蒸餾水制成14%復(fù)原脫脂乳液，調(diào)節(jié)pH值為6.5，0.07 MPa 滅菌10 min冷卻后備用。

（2）MRS培養(yǎng)基。牛肉膏10 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母粉 5 g/L、葡萄糖20 g/L、乙酸鈉5 g/L、檸檬酸二胺2 g/L、硫酸鎂0.58 g/L、硫酸錳0.25 g/L、吐溫80 1 mL/L、磷酸氫二鉀 2 g/L 配制固體培養(yǎng)基時另添加1.8%瓊脂，培養(yǎng)基均在 115 ℃ 下滅菌20 min。

（3）番茄汁培養(yǎng)基。番茄汁制備工藝為：新鮮番茄、清洗、熱燙（90～95 ℃，3～5 min）、榨汁→過濾（100目濾布）、調(diào)pH值至6.0，0.07 MPa滅菌30 min備用。

（4）白菜汁培養(yǎng)基。白菜汁制備工藝為：選取無破損、無霉?fàn)€、無蟲蛀的新鮮白菜清水洗凈、瀝干→搗碎、打漿→過濾（100目濾布）、調(diào)pH值至6.0，0.07 MPa滅菌30 min備用。

（5）胡蘿卜汁培養(yǎng)基。胡蘿卜汁制備工藝為胡蘿卜、洗凈、去皮及根梢、稱質(zhì)量、切片→煮沸（料 ∶水=1 g ∶4 mL，100 ℃，5 min）→榨汁→過濾（100目濾布）→定容（1 kg胡蘿卜生產(chǎn)5 L汁定義為100%胡蘿卜汁）、調(diào)pH值至6.0、0.07 MPa 滅菌30 min備用。

1.1.3 儀器與設(shè)備 酸度計，PHS-3C，上海理達(dá)儀器廠；SW-CJ-1FD型潔凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；SPX-150B-Z型生化培養(yǎng)箱，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器，上海三申醫(yī)療器械有限公司；JA5002型電子天平，上海精天電子儀器有限公司；BCD-210C華意冰箱，中國華意電冰箱制造廠；離心機(jī)、凍干機(jī)。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種活化 菌種分別經(jīng)140 g/L復(fù)原脫脂乳液體培養(yǎng)基、液體MRS培養(yǎng)基活化，備用。

1.2.2 廉價增殖培養(yǎng)基的優(yōu)化

1.2.2.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的確定 將活化菌株按1%接菌量分別接種于番茄汁、胡蘿卜汁、白菜汁基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，每2 h取樣，測定D600 nm值，確定最佳收獲期，37 ℃恒溫培養(yǎng)至最佳收獲期，采用平皿菌落計數(shù)法確定最佳基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

1.2.2.2 增殖因子的篩選 在所選的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加 0.2% 磷酸氫二鉀的基礎(chǔ)上分別添加1%大豆蛋白胨、1%胰蛋白胨、1%蛋白胨、1%牛肉膏、0.5%酵母膏、2%乳糖、2%葡萄糖、2%蔗糖、0.5%玉米漿，制成不同增殖培養(yǎng)基，通過活菌數(shù)及結(jié)果差異顯著性比較確定較優(yōu)營養(yǎng)因子。

1.2.2.3 增殖復(fù)合培養(yǎng)基的確定 在單因素試驗基礎(chǔ)上采用正交試驗設(shè)計，以活菌數(shù)為評價指標(biāo)，以L9（34）正交表（表1）進(jìn)行試驗設(shè)計，篩選出增殖復(fù)合培養(yǎng)基。

1.2.3 乳酸菌濃縮分離技術(shù) 植物乳桿菌L42經(jīng)液體MRS培養(yǎng)基活化，分別以1%（活菌數(shù)約0.01億CFU/mL）接種于番茄汁復(fù)合增殖培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)至對數(shù)生長末期，分別采用不同離心力、離心時間濃縮分離菌體細(xì)胞，檢測不同離心條件下離心前初始活菌數(shù)和離心后上清液活菌數(shù)、沉淀的活菌數(shù)，計算離心損失率、離心存活率、離心收得率，以尋求獲得最高菌體收得率的離心條件。離心損失率、離心存活率、離心收得率計算公式如下。

離心損失率=上清液活菌數(shù)（CFU/mL）/初始活菌數(shù)（CFU/mL）×100%；

離心存活率=沉降細(xì)胞活菌數(shù)（CFU/mL）/[初始活菌數(shù)（CFU/mL）-上清液活菌數(shù)（CFU/mL）]×100%；

離心收得率=沉降細(xì)胞活菌數(shù)（CFU/mL）/初始活菌數(shù)（CFU/mL）×100%。

1.2.4 高效凍干保護(hù)劑 脫脂奶粉可作為乳酸菌的冷凍保護(hù)劑，糖類也是菌體在凍干時應(yīng)用較為廣泛的保護(hù)劑[8-9]，常用作糖類保護(hù)劑的主要有葡萄糖、蔗糖、海藻糖、乳糖。它們共同點(diǎn)是有大量自由基，具有還原性，抗干燥保護(hù)能力較強(qiáng)，同時還可抑制菌表面自由基的產(chǎn)生[10-14]；Fuchigami等認(rèn)為，海藻糖能使菌體內(nèi)的水形成細(xì)小和鈍圓的小冰晶，減弱了冷凍時冰晶的機(jī)械損傷作用，能穩(wěn)定細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，抗逆保鮮作用較強(qiáng)[15]。

小分子保護(hù)劑，一般具有很強(qiáng)的親水性，分子結(jié)構(gòu)含有3個以上氫鍵，在冷凍或干燥過程中，可與菌體細(xì)胞膜磷脂中的磷酸基團(tuán)或菌體蛋白質(zhì)極性基團(tuán)形成氫鍵，保護(hù)細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的完整性。而大分子保護(hù)劑通過包裹形式保護(hù)菌體，同時，促進(jìn)低分子保護(hù)劑發(fā)揮作用。

1.2.4.1 單因素保護(hù)劑的篩選 將活化后的植物乳桿菌L42，以1%（活菌數(shù)約0.1億CFU/mL）接種于番茄汁復(fù)合增殖培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)至對數(shù)生長末期，離心收獲菌體，以10%脫脂乳為基礎(chǔ)保護(hù)劑，分別添加單糖類、多糖類、蛋白質(zhì)類等多種物質(zhì)在-20～18 ℃冷凍12 h，進(jìn)行真空冷凍干燥，測定其活菌數(shù)計算冷凍存活率及凍干存活率。

1.2.4.2 復(fù)合保護(hù)劑的篩選 在單因素試驗基礎(chǔ)上采用正交試驗設(shè)計，以活菌數(shù)為評價指標(biāo)，以L9（34）正交表（表2）進(jìn)行試驗設(shè)計，篩選出以10%脫脂乳為基礎(chǔ)保護(hù)劑的復(fù)合保護(hù)劑。冷凍存活率、凍干存活率計算公式如下：

冷凍存活率=冷凍后細(xì)胞活菌數(shù)（CFU/mL）/初始活菌數(shù)（CFU/mL）×100%；

凍干存活率=冷凍干燥后細(xì)胞活菌數(shù)（CFU/mL）/初始活菌數(shù)（CFU/mL）×100%。

1.2.5 菌株L42直投式發(fā)酵劑耐受性驗證 將凍干后的菌株L42直投式發(fā)酵劑無菌條件下加入等量4%葡萄糖溶液復(fù)溶，以0.1億CFU/mL的初始菌量，分別接種于不同乙醇度，乙醇度分別為9%、11%、13%；SO2濃度分別為70、100、130 mg/L；pH值分別為4.0、3.5、3.0的MRS液體培養(yǎng)基中，30 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，采用平板計數(shù)法測定不同處理的活菌數(shù)。

1.2.6 菌株凍干保護(hù)劑貯藏穩(wěn)定性 將保存于4 ℃的菌株凍干發(fā)酵劑，每隔2個月測定活菌數(shù)，觀察菌株在保藏期內(nèi)的活菌量變化，為今后確定其保質(zhì)期提供依據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 廉價增殖培養(yǎng)基的篩選

2.1.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的確定

2.1.1.1 植物乳桿菌L42的生長曲線 從圖1可以看出，在37 ℃條件下，植物乳桿菌L42在3種基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)6 h后細(xì)胞生物量開始快速增加，在6～16 h期間，菌體生物量呈對數(shù)增長，D值增長迅速，但胡蘿卜汁的增長速度較番茄汁、白菜汁增長緩慢。16 h后菌株L42在3種培養(yǎng)基中均進(jìn)入生長穩(wěn)定期，此時D值達(dá)到最大，并且保持穩(wěn)定狀態(tài)。通常細(xì)菌在對數(shù)增長期的后期，菌體細(xì)胞的活性較強(qiáng)，存活率較高，因此，在適宜條件下培養(yǎng)13～16 h是植物乳桿菌L42細(xì)胞收獲的最佳時期。

2.1.1.2 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的確定 從表3可以看出，植物乳桿菌L42在3種基礎(chǔ)培養(yǎng)基中均能生長，但由于3種基礎(chǔ)培養(yǎng)基的營養(yǎng)物質(zhì)不豐富，其細(xì)胞生長量不如MRS培養(yǎng)基，且在3種基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，菌株在番茄汁基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的長勢最好，說明3種基礎(chǔ)培養(yǎng)基中番茄汁最適合菌株的生長，且與其他培養(yǎng)基差異極顯著，所以選擇番茄汁作為增殖基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

2.1.2 基礎(chǔ)培養(yǎng)基增殖因子的篩選 試驗以番茄汁為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，磷酸氫二鉀作為一種緩沖劑添加到番茄汁基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，再添加不同的增殖因子，以期獲得高活菌數(shù)，從表4可以看出，添加的不同增殖因子對植物乳桿菌L42均有不同的增殖效果，其中1%胰蛋白胨、1%蛋白胨、2%葡萄糖為最佳增殖因子，為植物乳桿菌L42提供豐富的氮源和碳源。

2.1.3 正交試驗篩選植物乳桿菌L42番茄汁增殖復(fù)合培養(yǎng)基 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選用L9（34）正交表進(jìn)行正交設(shè)計試驗，植物乳桿菌L42以胰蛋白胨、葡萄糖、酵母膏作為3個因素，參考正交表配制不同的復(fù)合培養(yǎng)基，從中優(yōu)化篩選出植物乳桿菌L42的最佳番茄汁復(fù)合培養(yǎng)基。以1%接種量分別接入正交試驗所設(shè)計的9種復(fù)合培養(yǎng)基中，37 ℃條件下培養(yǎng)16 h，進(jìn)行活菌計數(shù)。

從表5可以看出，植物乳桿菌L42的3個因素中，最佳培養(yǎng)基配比為A1B3C2。即在含有0.2% K2HPO4的番茄汁基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加0.5%胰蛋白胨、1.5%蛋白胨、2.5%葡萄糖，植物乳桿菌L42經(jīng)活化后按1%的接菌量接入該復(fù)合培養(yǎng)基中于37 ℃條件下培養(yǎng)16 h，活菌數(shù)可達(dá)到57.8億CFU/mL，與番茄汁基礎(chǔ)培養(yǎng)基相比提高了7.41倍，活菌數(shù)也提高了一個數(shù)量級。

2.2 乳酸菌濃縮分離技術(shù)

離心濃縮分離細(xì)胞是收獲菌體的簡便方法，多被采用。通過離心試驗，可盡量減少殘留在上清液中的細(xì)胞，也可改善離心力機(jī)械作用所造成的傷害，避免細(xì)胞死亡，尋求獲得活細(xì)胞最高收得率的最佳離心條件。從表6可以看出，菌株L42離心損失率最高為4 000 r/min、10 min；其次是 4 000、20 min，5 000、10 min，6 000、20 min，6 000、10 min，5 000、20 min，8 000、5 min，8 000、10 min，且差異極顯著（P<0.01）。

菌株L42離心收得率由低到高為 6 000、20 min，4 000、10 min，8 000、10 min，8 000、5 min，4 000、20 min，5 000、10 min，5 000、20 min，6 000、10 min。植物乳桿菌的最佳復(fù)合凍干保護(hù)劑為6 000 r/min、10 min，離心收得率可達(dá) 99.37%。

2.3 凍干保護(hù)劑的研究

2.3.1 單因素凍干保護(hù)劑的篩選 從表7可以看出，加不同保護(hù)劑的冷凍存活率和凍干后存活率差異極顯著，因而從大分子糖類中選擇海藻糖為最佳凍干保護(hù)劑，小分子凍干劑以谷氨酸鈉、吐溫80、酵母浸粉較高，具有抗冷凍作用，為較優(yōu)凍干保護(hù)劑。

2.4 菌株L42直投式發(fā)酵劑的耐受性

植物乳桿菌L42經(jīng)冷凍干燥后獲得的直投式發(fā)酵劑對乙醇、SO2、pH值仍具有一定的耐受性，在11%乙醇、130 mg/L SO2、pH值3.0的環(huán)境下能夠正常增殖且與原始菌株耐受性在同一數(shù)量級上（表9至表11）。

2.5 植物乳桿菌L42直投式發(fā)酵劑保藏期的驗證

菌株L42凍干發(fā)酵劑在4 ℃，11個月內(nèi)活菌數(shù)呈下降趨勢，但在11個月后活菌數(shù)依然可以達(dá)到10億CFU/mL，表明選擇的發(fā)酵劑可以滿足直投式發(fā)酵劑的活菌數(shù)要求，在保證乳酸菌的活菌數(shù)方面具有一定的優(yōu)勢，并具有一定的穩(wěn)定性（圖2）。

3 結(jié)論

確定植物乳桿菌L42的最佳廉價培養(yǎng)基為番茄汁基礎(chǔ)培養(yǎng)基、0.2% K2HPO4、0.5%胰蛋白胨、1.5%蛋白胨、2.5%葡萄糖；最佳離心條件為6 000 r/min、10 min；最佳凍干保護(hù)劑的配方為10%脫脂乳、10%海藻糖、1.5%谷氨酸鈉、1%吐溫80、0.5%酵母浸粉。在此條件下獲得的植物乳桿菌L42直投式發(fā)酵劑進(jìn)行穩(wěn)定性研究，結(jié)果表明，該菌株直投式發(fā)酵劑在4 ℃條件下保藏11個月后活菌數(shù)仍可保持在10億CFU/mL。經(jīng)冷凍干燥后獲得的植物乳桿菌對乙醇、SO2、pH值仍具有一定的耐受性，在11%乙醇、130 mg/L SO2、pH值3.0環(huán)境下能夠正常增殖。

目前，我國大多數(shù)葡萄酒廠進(jìn)行葡萄酒MLF依靠進(jìn)口直投式活性乳酸菌或自然發(fā)酵，致使生產(chǎn)成本極大增加、葡萄酒質(zhì)量很難保證。本研究對葡萄酒二次發(fā)酵優(yōu)良植物乳桿菌L42進(jìn)行高密度培養(yǎng)和直投式發(fā)酵劑的制備，為葡萄酒優(yōu)良乳酸菌L42的大規(guī)模培養(yǎng)提供依據(jù)，對葡萄酒工業(yè)生產(chǎn)具有深遠(yuǎn)意義。

參考文獻(xiàn)：

[1]李 華. 現(xiàn)代葡萄酒工藝學(xué)[M]. 西安：陜西人民出版社，1995：109-118.

[2]Davis C R，Wibowo D，Eschenbruch R，et al. Practical implications of malolactic fermentation：a review[J]. American Journal of Enology and Viticuluture，1985，36（4）：290-301.

[3]朱寶鏞. 葡萄酒科學(xué)與工藝[M]. 北京：中國輕工業(yè)出版社，1992：17-18.

[4]張春暉，王 華，李 華. 蘋果酸-乳酸發(fā)酵對干紅葡萄酒品質(zhì)的影響[J]. 西北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1999，27（6）：74-78.

[5]朱寶鏞. 葡萄酒工業(yè)手冊[M]. 北京：中國輕工業(yè)出版社，1995：170-172.

[6]Vinderola C，Mocchiutti P，Reinheimer J. Interactions among lactic acid starter and probiotic bacteria used for fermented dairy products[J]. Journal of Dairy Science，2002，85（4）：721-729.

[7]Crittenden R，Bird A，Gopal P，et al. Probiotic research in Australia，New Zealand and the Asia-Pacific region[J]. Current Pharmaceutical Design，2005，11（1）：37-53.

[8]吳雁軍，劉松玲，郭慧媛，等. 直投式乳酸菌發(fā)酵劑活性影響因素的研究進(jìn)展[J]. 中國乳業(yè)，2011，113（5）：52-55.

[9]Wang W. Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals[J]. International Journal of Pharmaceutics，2000，203（1/2）：1-60.

[10]徐致遠(yuǎn)，劉 榮，郭本恒，等. 保護(hù)劑在乳酸菌凍干過程中的應(yīng)用[J]. 乳業(yè)科學(xué)與技術(shù)，2006，29（4）：155-157，165.

[11]萬紅兵. 高效濃縮型酸奶凍干發(fā)酵劑制備關(guān)鍵技術(shù)研究[D]. 保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.

[12]翟碩莉. 新鮮軟質(zhì)干酪發(fā)酵劑及發(fā)酵工藝研究[D]. 保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

[13]Bynum D G，Barbano D M. Whole milk reverse osmosis Retentates for cheddar cheese manufacture：Chemical changes during aging[J]. Journal of Dairy Science，1985，68（1）：1-10.

[14]于修維. 乳酸菌高密度培養(yǎng)及濃縮型發(fā)酵劑研究[D]. 南京：南京工業(yè)大學(xué)，2004.

[15]Fuchigami M，Ogawa N，Teramoto A. Trehalose and hydrostatic pressure effects on the structure and sensory properties of frozen tofu（soybean curd）[J]. Innovation Food Science&Emerging Technologies，2002，3（2）：139-147.林文秋，楊為海，鄒明宏，等. 澳洲堅果果皮不同溶劑提取物的含量和抗氧化活性[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（1）：171-174.