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    高山石斛再生體系的建立

    2017-02-27 10:41王一諾黃雪彥李磊
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2017年1期
    關(guān)鍵詞:芽苗石斛高山

    王一諾+黃雪彥+李磊

    摘要:以高山石斛(Dendrobium infundibulum Lindl.)成熟種子為外植體,MS為基本培養(yǎng)基,研究植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素對(duì)高山石斛組織培養(yǎng)過(guò)程中繼代增殖和生根的影響。結(jié)果表明,高山石斛最佳的啟動(dòng)培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 1.0 mg/L;繼代增殖中,6-BA、NAA、KT等激素的配合使用具有較好的效果,利于繼代增殖的培養(yǎng)基為MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+KT 0.5 mg/L+活性炭1.0 g/L;最佳的生根壯苗培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 2.0 mg/L+香蕉汁10%,此時(shí)苗的根系長(zhǎng)而粗壯,芽苗葉色翠綠,平均根長(zhǎng)2.79 cm,生根率達(dá)到92%。

    關(guān)鍵詞:高山石斛;6-BA;NAA;KT;組織培養(yǎng);繼代培養(yǎng)基;生根培養(yǎng)基

    中圖分類號(hào): S567.23+9.043 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A 文章編號(hào):1002-1302(2017)01-0050-02

    高山石斛(Dendrobium infundibulum Lindl.)產(chǎn)于云南南部,系蘭科石斛屬多年生草本植物,生于海拔約2 000 m的密林中樹(shù)干上,喜溫暖、潮濕環(huán)境[1]。高山石斛被譽(yù)為“四大觀賞洋花”之一,具有極高的觀賞價(jià)值,花期為每年的8—11月,其總狀花序來(lái)自具葉的頂端,具1~2朵花,花姿優(yōu)雅,氣味芳香,既可做切花,可用于插花和餐桌的布置[2],也可做盆栽。自然條件下,石斛屬植物的種子細(xì)小,不具胚乳,繁殖能力極低,主要通過(guò)分株方式繁殖[3],而這種繁殖方法周期長(zhǎng),短時(shí)間內(nèi)得到的有效苗數(shù)少。高山石斛的培植推廣受到種苗生產(chǎn)的制約[4]。近年來(lái),隨著市場(chǎng)需求量的日益增大,原本自然資源稀缺,加之人們盲目過(guò)度采挖,使高山石斛的野生資源受到嚴(yán)重破壞[5]。本試驗(yàn)以MS為基本培養(yǎng)基,通過(guò)不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的配比應(yīng)用,對(duì)高山石斛進(jìn)行組織培養(yǎng)技術(shù)研究,篩選出高山石斛各個(gè)生長(zhǎng)培養(yǎng)階段的優(yōu)勢(shì)培養(yǎng)基,加快其繁殖速度,以期使高山石斛野生資源得到有效保護(hù),同時(shí)降低組培成本,為高山石斛大規(guī)模的組培苗生產(chǎn)提供技術(shù)支撐。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    高山石斛未開(kāi)裂成熟蒴果,采自廣西壯族自治區(qū)藥用植物園科研基地內(nèi)健壯、無(wú)病害的植株上。

    1.2 組織培養(yǎng)

    1.2.1 外植體消毒與啟動(dòng)培養(yǎng) 將高山石斛成熟飽滿、未開(kāi)裂的蒴果用流水清洗表面污垢,置于燒杯中依次用2%洗潔精溶液浸泡5 min,用線狀的自流水沖洗15 min;移至超凈工作臺(tái),用75%乙醇表面消毒30 s,無(wú)菌水沖洗2次;用添加2滴吐溫-20的0.1% HgCl2浸泡15 min,無(wú)菌水浸泡沖洗3次;用消毒的濾紙除去表面水分,用無(wú)菌解剖刀將高山石斛蒴果的果皮輕輕切開(kāi),用無(wú)菌鑷子將胚均勻撒播在以MS為基本培養(yǎng)基、添加不同濃度植物生長(zhǎng)劑(6-BA、NAA)的啟動(dòng)培養(yǎng)基上,觀察接入外植體的變化。

    1.2.2 繼代增殖 將經(jīng)過(guò)初代培養(yǎng)獲得的無(wú)菌芽切為獨(dú)立的單芽,接種于以MS為基本培養(yǎng)基,添加30 g/L蔗糖、4.5 g/L 瓊脂、1 g/L活性炭、不同濃度植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑(1.0~4.0 mg/L 6-BA、0.5~1.0 mg/L NAA、0~0.5 mg/L KT)的繼代增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng),pH值為5.8。重復(fù)3次。

    1.2.3 生根培養(yǎng) 將繼代增殖培養(yǎng)生長(zhǎng)至3 cm左右的健壯單株從叢芽中剝離,接種至添加不同濃度植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑(6-BA、NAA)和植物提取液的MS基本培養(yǎng)基上進(jìn)行壯苗生根培養(yǎng)60 d,pH值為5.8;調(diào)查統(tǒng)計(jì)高山石斛生根的情況。每種培養(yǎng)基接種50株。

    1.3 組織培養(yǎng)條件

    溫度24~28 ℃,光照時(shí)間為12 d/h,平均光照為1 500~2 200 lx。

    1.4 煉苗移栽

    挑取生長(zhǎng)健壯、根系發(fā)達(dá)的高山石斛組培苗移入大棚溫室內(nèi),打開(kāi)瓶蓋放置7 d,期間往瓶?jī)?nèi)組培苗噴灑少量水,保持瓶?jī)?nèi)水分充足;將瓶?jī)?nèi)幼苗取出,流水沖洗干凈根部的培養(yǎng)基,避免損傷根部的幼嫩組織;將幼苗于傍晚移栽至經(jīng)消毒過(guò)的栽培基質(zhì)中,保持濕度,上部覆蓋1層遮陽(yáng)網(wǎng)適度遮陰。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 種子的萌發(fā)情況

    種子接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)25 d,大部分種子都固著在培養(yǎng)基表面,可明顯地觀察到種子胚開(kāi)始變大,由淡黃色慢慢變成淡綠色;隨培養(yǎng)時(shí)間的增加,淡綠色轉(zhuǎn)變?yōu)樯罹G,萌發(fā)為原球莖;培養(yǎng)60 d,膨大的原球莖頂端產(chǎn)生葉原基突起,原球莖開(kāi)始慢慢分化,出現(xiàn)芽尖,并逐漸長(zhǎng)成芽苗。由表1可見(jiàn),6-BA、NAA都對(duì)高山石斛芽的誘導(dǎo)產(chǎn)生影響;6-BA濃度不變時(shí),NAA濃度增大有利于芽的萌發(fā);NAA濃度不變時(shí),6-BA 在0.1~0.5 mg/L范圍內(nèi),濃度過(guò)高反而會(huì)使芽的萌發(fā)率下降;在MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 1.0 mg/L培養(yǎng)基上,高山石斛種子的萌發(fā)個(gè)數(shù)相對(duì)最多,芽苗顏色濃綠,長(zhǎng)勢(shì)良好(圖1)。因此,MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 1.0 mg/L為最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

    2.2 繼代增殖

    由表2可見(jiàn),以MS為基本培養(yǎng)基、添加不同激素的12種培養(yǎng)基中,無(wú)菌芽苗接入增殖培養(yǎng)基30 d開(kāi)始分化,芽的增殖倍數(shù)有明顯差異;NAA、KT保持濃度不變,6-BA濃度為3.0 mg/L時(shí)芽的增殖能力相對(duì)較強(qiáng),芽的增殖倍數(shù)為3.7~4.6(培養(yǎng)基編號(hào)為B7~B9),隨著6-BA濃度增加,芽的增殖倍數(shù)有所下降,且苗生長(zhǎng)過(guò)快,莖較細(xì)弱,有效苗的質(zhì)量變差;6-BA、NAA保持濃度不變時(shí),培養(yǎng)基中加入KT有利于苗的增殖;培養(yǎng)基MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+KT 0.5 mg/L+活性炭1.0 g/L芽的增殖能力最強(qiáng),增殖倍數(shù)達(dá)到4.6,芽生長(zhǎng)情況良好,苗健壯,葉色翠綠(圖2)。因此,確定培養(yǎng)基MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+KT 0.5 mg/L+活性炭1.0 g/L為高山石斛芽苗的最適增殖培養(yǎng)基。

    2.3 生根培養(yǎng)

    由表3可見(jiàn),高山石斛在MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 2.0 mg/L+香蕉汁10%的培養(yǎng)基上生根率和生根數(shù)分別為92%、46條,平均根長(zhǎng)達(dá)2.79 cm,且芽苗葉色翠綠,植株健壯,根系長(zhǎng)而粗壯,主次分明(圖3),優(yōu)于其他組合;6-BA濃度保持不變時(shí),隨NAA濃度的增大,高山石斛芽苗的生根率提高、生根數(shù)有所增加,NAA濃度為2.0 mg/L時(shí)生根效果相對(duì)最好,濃度過(guò)高反而不利于根的生長(zhǎng)。

    2.4 煉苗移栽

    試驗(yàn)表明,煉苗基質(zhì)以木屑 ∶草炭=2 ∶1為宜,栽好幼苗再覆蓋1層苔蘚,澆透水定根,同時(shí)保持棚內(nèi)濕度85%左右、溫度為20~30 ℃,15 d左右長(zhǎng)出新根去掉遮陽(yáng)網(wǎng),此時(shí),幼苗成活率高,生長(zhǎng)健壯。

    3 結(jié)論與討論

    組織培養(yǎng)過(guò)程中,只有植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比恰當(dāng),才有利于組培苗的生長(zhǎng)、 分化和快速繁殖[6]。MS培養(yǎng)基適合于大多

    數(shù)的雙子葉植物,但不同品種在種子萌發(fā)和增殖過(guò)程中需要的激素濃度有很大區(qū)別[7]。本試驗(yàn)中,MS基本培養(yǎng)基中加入適宜的6-BA、NAA,可促進(jìn)高山石斛種子的萌發(fā),較適宜種子萌發(fā)的培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 1.0 mg/L,NAA濃度不變時(shí),6-BA濃度過(guò)高反而會(huì)抑制萌發(fā)。

    幼苗增殖和分化是組織培養(yǎng)過(guò)程中繁殖速度和增殖系數(shù)的關(guān)鍵[8],而組培苗的增殖系數(shù)很大程度上受細(xì)胞分裂素的影響。試驗(yàn)表明,隨6-BA濃度的增大,繁殖系數(shù)有所提高,但當(dāng)6-BA濃度達(dá)到4.0 mg/L時(shí),繁殖系數(shù)反而有所降低。KT作為外源性細(xì)胞分裂素,可以促進(jìn)側(cè)芽發(fā)育[9]。在高山石斛繼代增殖過(guò)程中,6-BA、NAA、KT等激素的聯(lián)合使用,對(duì)芽苗的增殖起到較為理想的效果,高山石斛在培養(yǎng)基MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+KT 0.5 mg/L+活性炭 1.0 g/L 中的繼代增殖效果相對(duì)最佳,芽生長(zhǎng)情況良好,苗健壯,葉色翠綠,增殖倍數(shù)達(dá)到4.6,且得到的有效苗數(shù)最多。

    植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑NAA對(duì)高山石斛的壯苗生根起到重要作用,與植物提取液香蕉汁配合使用生根效果較好,培養(yǎng)出的種苗植株健壯,主根系長(zhǎng)而粗壯,成活率高。因此,最適宜壯苗生根的培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 2.0 mg/L+香蕉汁10%。

    高山石斛喜溫暖、潮濕的環(huán)境,移栽時(shí)關(guān)鍵是選取合適的栽培基質(zhì)。以木屑 ∶草炭灰=2 ∶1作為栽培基質(zhì),并覆蓋1層苔蘚,既疏松又保水透氣,是一種較好的栽培基質(zhì)。

    參考文獻(xiàn):

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