含幽門螺桿菌特異性抗體牛奶清除幽門螺桿菌效果的臨床隨機試驗①

趙連梅 魏思思 武一鵬 劉維華 趙 川 胡代倫 李勝棉 王 莧 單保恩

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院科研中心,石家莊050011)

含幽門螺桿菌特異性抗體牛奶清除幽門螺桿菌效果的臨床隨機試驗①

趙連梅 魏思思 武一鵬 劉維華②趙 川②胡代倫③李勝棉 王 莧②單保恩

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院科研中心,石家莊050011)

目的：比較觀察抗幽門螺桿菌抗體牛奶根除幽門螺桿菌的效果。方法：用4株幽門螺桿菌(1株為標(biāo)準(zhǔn)菌株，3株為本地流行菌株)免疫奶牛，制備出抗幽門螺桿菌抗體牛奶。本次試驗共篩選148例患者，C-14呼氣試驗陽性的患者為72例，最后符合入選標(biāo)準(zhǔn)的為39例，將符合標(biāo)準(zhǔn)的患者隨機分為試驗組和對照組，分別為21例和18例，試驗組飲用含特異性幽門螺桿菌抗體的牛奶，對照組飲用普通牛奶，連續(xù)飲用2個月后，觀察結(jié)果。結(jié)果：試驗組的21名對象中，9人C-14呼氣試驗轉(zhuǎn)為陰性，10人降低。有效清除率達42.86%，而對照組未有清除，兩組清除率有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.005，P<0.05)。結(jié)論：抗幽門螺桿菌抗體牛奶具有多克隆性和很高的效價，能夠有效清除胃內(nèi)幽門螺桿菌。

幽門螺桿菌;抗體牛奶;臨床隨機試驗

幽門螺桿菌( Helicobacter pylori,H.Pylori)是一種定植于人胃黏膜的微需氧革蘭陰性桿菌。H.Pylori感染屬世界范圍性，約有半數(shù)以上的人口胃內(nèi)有H .Pylori定居。H.Pylori感染可引起慢性B型胃炎、消化性潰瘍、胃黏膜相關(guān)淋巴組織(MALT)淋巴瘤和胃癌等，嚴(yán)重威脅著人類健康[1]。1996年WHO將其列為“一級致癌因子”。近年研究表明，H.Pylori感染與不明原因缺鐵性貧血、慢性特發(fā)性血小板減少性紫癜、阿爾茨海默病、結(jié)直腸腺瘤和結(jié)腸癌的發(fā)生均有相關(guān)性[2]。長期以來，我們使用多種抗生素的聯(lián)合療法來根除H.Pylori，雖然有效,但H .Pylori對抗生素的耐受性逐漸增加，根除率逐年下降。1998年意向性分析(Per-Protocol，PP)和符合方案集分析(Intent-To-Treat，ITT)根除率分別可達95.2%、92%，目前PP和ITT根除率分別是65.1%、63.5%，根除率下降趨勢仍將繼續(xù)，尋找“H.Pylori治療新路徑”[3]是今后H.Pylori治療的研究方向。與其他病原菌一樣，免疫防治可能是最有效的方法。用抗H.Pylori多克隆抗體牛奶防治H.Pylori感染或許可以成為一種新的最有效的途徑。本實驗用幽門螺桿菌混合菌株免疫奶牛，制備含幽門螺桿菌特異性抗體的牛奶，對C-14呼氣試驗陽性的患者進行臨床隨機對照試驗，進而觀察此種抗體牛奶對幽門螺桿菌的根除效果。

1 材料與方法

1.1 材料 用來免疫奶牛的菌株選用國際標(biāo)準(zhǔn)菌株SS1和三株本地流行的臨床株作為混合免疫抗原，三株臨床株毒力型為臨1(S1bS2m1a)，臨2(S2m1am1bi2)，臨3(S1am2i2)，本地流行的臨床株由河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院和石家莊市疾控中心聯(lián)合篩選。病例來自河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院消化內(nèi)科就診人員，共篩選148例患者,C-14呼氣試驗陽性的患者為72例,最后符合入選標(biāo)準(zhǔn)的為39例。以下為入選標(biāo)準(zhǔn)：①C-14尿素呼氣試驗陽性；②停用治療胃病的藥物或抗菌素兩周以上；③征詢患者同意，自愿入組。檢測牛奶抗體的ELISA試劑盒購自皮爾斯TMBCA蛋白濃度測定試劑盒(賽默飛世爾科技公司，Waltham，MA，USA)。

1.2 方法

1.2.1 菌株的保存與培養(yǎng) 將菌株保存于含有20%甘油和10%FBS的凍存液中，置于-80℃冰箱。在哥倫比亞平板上，微氧條件(10%CO2、85%N2、5%O2)下，37℃、95%濕度培養(yǎng)3～10 d，用無菌環(huán)選取細菌，用0.9%無菌鹽水洗3遍，最后懸浮于0.1 mol/L的PBS緩沖液中作為疫苗，保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 抗H.pylori抗體牛奶的制備與消毒 選用4種菌株作為混合抗原，免疫4頭孕期奶牛，總共免疫8次，2次在生產(chǎn)前最后1個月，6次在生產(chǎn)后。每次免疫菌量為6×109cfu H .Pylori。通過鼻黏膜滴注、乳上淋巴結(jié)的皮下注射和臀部肌肉注射進行免疫，平均每2周加強免疫1次。用等體積的免疫佐劑乳化幽門螺桿菌懸液，初始免疫時用弗氏完全佐劑，每次加強免疫用弗氏不完全佐劑。在免疫以前和免疫50 d后分別收集牛奶進行抗體檢測?？贵w牛奶和普通牛奶都進行巴氏消毒，備用。

1.2.3 ELISA檢測抗體牛奶中的抗體量 用1×PBS分別稀釋抗體牛奶和對照牛奶100、200、400和800倍，每孔100 μl加入酶標(biāo)板，37℃孵育1 h，清洗；使用含0.1%BSA的1×PBS 1∶8 000 稀釋HRP標(biāo)記二抗，每孔100 μl加入酶標(biāo)板，室溫孵育30 min，清洗；最后顯色，在450nm處測定吸光度值。

1.2.4 臨床試驗 本研究為隨機臨床試驗，將符合入選標(biāo)準(zhǔn)的39例患者按完全隨機方法分入試驗組和對照組，采用執(zhí)行者和患者雙盲原則分發(fā)、飲用牛奶。試驗組21名,飲用特異性抗體牛奶200 ml/d+1 ml NaHCO3(1 mol/L);對照組18名,飲用普通牛奶200 ml/d+1 ml NaHCO3(1 mol/L),同時飲用2個月，測定C-14呼氣試驗值，觀察結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進行處理，試驗組和對照組幽門螺桿菌清除率的比較采用χ2檢驗,檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 用ELISA檢測不同稀釋度下的抗體奶中4種菌株抗體的濃度 結(jié)果證明，抗體奶含有較高的特異性抗體濃度，抗體效價也比較高，表1。

2.2 抗體牛奶飲用效果評價 本研究共納入39例受試者。試驗組21例，飲用抗體牛奶，有9例C-14尿素呼氣試驗轉(zhuǎn)陰，10例數(shù)值明顯下降，具體數(shù)值變化見表2；對照組18例，未有轉(zhuǎn)陰者。通過統(tǒng)計分析，試驗組有效清除率為42.86%，對照組未有有效清除率，有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.005，P<0.05)。

2.3 不良反應(yīng) 本次實驗試驗組和對照組均無不良反應(yīng)者。

表1 不同稀釋度下的抗體奶中特異性抗體濃度

Tab.1 Special concentration of antibodies under different dilution of milk

ProportionofmilkSS1Clinicalsample1Clinicalsample2Clinicalsample3Control1∶100294627802755274402151∶200270119422071197102421∶4002099123714709891∶8001408081809820647

表2 受試者服用抗體牛奶前后C-14呼氣試驗數(shù)值變化

Tab.2 Values of C-14 in volunteer who drink antibody milk at different time

NoBeforeAfterNoBeforeAfter11029Negative124544032126337613108479431382Negative14590Negative4390017821512004175263Negative161663138861364168417358011007143Negative18384Negative836836519780Negative9244358820742Negative1013177502142328011110Negative

3 討論

我國自然人群幽門螺桿菌的感染率為54.76%，廣東地區(qū)H.Pylori感染率最低為42.01%，西藏H.Pylori的感染率最高為84.62%[4]。H.Pylori的高陽性率基本顯示與胃內(nèi)病變的一致性。幾年內(nèi)的感染多數(shù)僅能引起輕度的淺表性胃炎；但數(shù)十年的長期慢性感染易出現(xiàn)糜爛、疣狀胃炎、萎縮性胃炎甚至胃腫瘤。因此，尋找一種有效且易執(zhí)行的治療方法非常重要。

先前的體外研究表明，抗幽門螺桿菌抗體牛奶具有很好的治療效果，但尚無體內(nèi)臨床研究顯示它的根除作用[5-14]。本研究表明，用H.Pylori全菌體抗原免疫奶牛,能夠獲得很高效價的多克隆免疫牛奶，服用這種抗體牛奶不僅有很好的清除效果，且能改善一些臨床癥狀，無不良反應(yīng)的發(fā)生。由于不同國家的不同地區(qū)之間H.Pylori的基因型和血清型明顯不同，即使是同一國家的不同地區(qū)之間也有很大區(qū)別[15，16]，因此我們選擇了一株標(biāo)準(zhǔn)菌株和三株當(dāng)?shù)氐牧餍芯曜鳛榛旌峡乖?。已有研究表明，胃?nèi)pH會影響牛奶中的特異性抗體與H.Pylori的結(jié)合，pH4.0以下不能有效結(jié)合，pH在7.0～8.0時能達到最大程度結(jié)合[17]。因此，本研究中，飲用抗體奶時需加入NaHCO3，提高胃黏膜的pH值，促進特異性抗體的吸收與結(jié)合。本研究中試驗組的21例受試對象中，有9例C-14尿素呼氣試驗轉(zhuǎn)陰，10例數(shù)值明顯下降，而對照組的18例對象中，未有轉(zhuǎn)陰者，結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義。

目前,廣泛用于臨床根除H.Pylori的方案是抗生素抗菌治療，雖然療效肯定，但也有不甚理想之處：①耐藥率與日俱增；②大量長期服用藥物及胃腸道副反應(yīng)，很多患者難以耐受，依從性差；③不可用做預(yù)防用藥。使用抗H.Pylori抗體牛奶治療H.Pylori感染有許多優(yōu)勢，比如低成本、高營養(yǎng)、好的耐受性、不會形成抗生素耐藥且可以耐受長期使用等等。因此，被動免疫治療或許是防治H.Pylori感染最有效的途徑。

已有動物實驗證實，口服抗尿素酶IgA單克隆抗體可保護小鼠不受H.Pylori感染,分泌型IgA( sIgA )在兒童期防止消化道H.Pylori感染中有重要作用,母乳中的IgA 被攝入后能在消化道黏膜表面清除外來微生物，或隨食物咽下的抗原[18]。這些實驗為我們進行口服抗體治療揭示了美好的前景。牛奶中含有豐富的sIgA,研究特異性的抗H.Pylori抗體牛奶有很大應(yīng)用價值。以往的研究表明，服用含抗H.Pylori特異性抗體的牛奶,無任何不良反應(yīng)[19]。目前，國內(nèi)外有不少有關(guān)通過攝取免疫食品中的特異性抗體，來中和致病菌特異性毒力因子，防治消化道疾病,治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎,預(yù)防齲齒的報道[20]。但有關(guān)抗H.Pylori的免疫制劑的報道還不多見。用免疫乳作為對H.Pylori帶菌者預(yù)防性清除投藥,對胃腸道無刺激,對腸道菌群無干擾,通過免疫乳制品,使特異性抗體進入胃腸道發(fā)揮治病、防病作用，這將是一種經(jīng)濟、方便的方法。

雖然臨床效果和應(yīng)用前景都較好，但仍存在一些問題：篩選區(qū)域臨床流行株費時,費力；免疫菌株和感染者胃中的菌株差異比較大；免疫奶牛后，奶牛產(chǎn)奶量下降等，對此，我們將做進一步探究。

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[收稿2016-08-22]

(編輯 許四平)

Clearance effect of milk containing anti-Helicobacter pylori specific antibody:a randomized clinical trial

ZHAOLian-Mei，WEISi-Si，WUYi-Peng,LIUWei-Hua，ZHAOChuan，HUDai-Lun，LISheng-Mian，WANGXian，SHANBao-En.

ResearchCenter，theFourthHospitalofHebeiMedicalUniversity，Shijiazhuang050011，China

Objective:To compare and observe the different clearance effect of milk containing anti-Helicobacter pylori specific antibody.Methods: Four H.pylori strains were used to immune dairy cows to obtain milk containing anti-Helicobacter pylori specific antibody,of which,one was standardized strain and the other three were locally epidemic.Totally 148 people were screended,in which 72 were C-14 urea breath test positive,finally 39 meet the criteria.They were divided into two groups,the test group contained 21 subjects,were treated milk containing anti-Helicobacter pylori specific antibody;the 18 subjects in control group with common milk.The study was continued for 2 months.Results: Conducting the C-14 urea breath test,9 subjects in test group were negative,but no one was changed in control group.The effective clearance rate of the test group was 42.86%,and there was no effective clearance in the control group,so there was significant difference in the two groups(P=0.005，P<0.05).Conclusion: The milk containing anti-Helicobacter pylori specific antibody is polyclonal and has higher valence,and could clear H .Pylori effectively.

Helicobacter pylori；Antibody milk；Randomized clinical trial

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.02.023

①本文受國家自然科學(xué)基金(81502032)、河北省中醫(yī)藥管理局研究項目(2015130)和河北省自然科學(xué)基金(H2015206376)項目資助。

趙連梅(1981年-)，女，博士，副研究員，主要從事腫瘤免疫學(xué)及分子生物學(xué)機制相關(guān)研究，E-mail：lianmeizhmail@163.com。

及指導(dǎo)教師：單保恩(1962年-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事腫瘤免疫學(xué)相關(guān)研究，E-mail：shanbaoen@163.com。

R186

A

1000-484X(2017)02-0274-04

②石家莊市疾控中心，石家莊050011。

③河北醫(yī)科大學(xué)臨床學(xué)院，石家莊050031。