電脈沖法增強(qiáng)CZP3 DNA疫苗免疫不育效果的研究①

王 穎 張貝貝 阿地拉·艾皮熱 張 冀 羅嬌嬌 張富春

(新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆生物資源基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊830046)

電脈沖法增強(qiáng)CZP3 DNA疫苗免疫不育效果的研究①

王 穎 張貝貝 阿地拉·艾皮熱 張 冀 羅嬌嬌 張富春

(新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆生物資源基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊830046)

目的：研究電脈沖法對CZP3 DNA疫苗免疫不育效果的影響。方法：在小鼠腿部肌肉分別注射5、10、20和50 μg的pcDNA3.0-CZP3質(zhì)粒，經(jīng)電脈沖刺激，ELISA法檢測免疫小鼠的CZP3抗體水平及最高抗體滴度。與雄鼠合籠三周后，計(jì)算各免疫組的不孕率及平均產(chǎn)仔數(shù)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果：相比單獨(dú)肌肉注射免疫，電脈沖法能極顯著提高DNA疫苗的免疫水平,電脈沖50 μg組的抗體效價(jià)可以達(dá)到1∶4 000。此外隨著血清中CZP3抗體水平的增高，小鼠不孕率明顯上升，平均產(chǎn)仔數(shù)顯著減少。統(tǒng)計(jì)分析顯示，免疫小鼠的CZP3抗體水平與產(chǎn)仔數(shù)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。結(jié)論：電脈沖法能夠顯著提高CZP3 DNA疫苗的免疫水平，降低小鼠生育能力，這為CZP3 DNA疫苗應(yīng)用于流浪犬避孕奠定了基礎(chǔ)。

卵透明帶3；DNA疫苗；電脈沖法；免疫不育

近年來，由于犬走失及飼養(yǎng)者將犬放歸野外等原因的存在，使得我國流浪犬?dāng)?shù)量激增，如僅2012年烏魯木齊市動(dòng)物疾控中心公布的全市流浪犬的數(shù)量就高達(dá)7 000只，這不但引發(fā)了很多城市環(huán)境、衛(wèi)生、管理等方面的問題，更增加了人畜共患傳染病的傳播機(jī)率，我國每年因狂犬病死亡的人數(shù)超過2 000人，在傳染病中僅次于艾滋病的致死人數(shù)，如何控制流浪犬?dāng)?shù)量成為一個(gè)社會(huì)難題。目前控制流浪犬?dāng)?shù)量的方法有撲殺、去勢、免疫避孕等方法。撲殺方法時(shí)效較短，物種專一性差，且違背動(dòng)物福利，違反動(dòng)物保護(hù)法；去勢又因?yàn)橘M(fèi)時(shí)費(fèi)力，人工成本很高，難以有效推廣；因此采用人道而又方便易行、直接有效的避孕疫苗控制流浪犬?dāng)?shù)量的方法得到了廣泛的認(rèn)可。

卵透明帶(Zona pellucid,ZP)主要由3種糖蛋白(ZP1、ZP2、ZP3)組成，ZP3是精子的初級受體，誘發(fā)精子的頂體反應(yīng)，其抗體可以阻止精卵結(jié)合[1]，已經(jīng)有大量的實(shí)驗(yàn)證明動(dòng)物免疫ZP3蛋白后產(chǎn)仔數(shù)顯著下降[1-5]。目前針對犬ZP3(CZP3)避孕疫苗的研究主要以蛋白疫苗為主，如用CZP3與T細(xì)胞表位結(jié)合或精子蛋白Izumo結(jié)合制作成各種融合蛋白疫苗都取得了不錯(cuò)的免疫效果[6-8]。但已有研究表明，CZP3蛋白表達(dá)量低，純化難度大，且純化的蛋白保存條件要求高，因而表達(dá)成本很高，很難滿足犬免疫避孕的市場需求。DNA疫苗具有制備工藝簡便、生產(chǎn)成本低、表達(dá)的抗原生物活性高、可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞、體液等多種免疫應(yīng)答形式的優(yōu)點(diǎn)。DNA疫苗已在多種疫病中開展了廣泛研究，其中乙肝DNA疫苗已進(jìn)入臨床階段。DNA疫苗雖然有很多優(yōu)點(diǎn)，但因其肌肉注射免疫后，進(jìn)入抗原遞呈細(xì)胞(APC)的量很少，遞呈效率較低，導(dǎo)致其誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答水平不高，這限制了其進(jìn)一步的應(yīng)用。已有研究證實(shí)，電脈沖可以顯著提高DNA疫苗轉(zhuǎn)染效率，誘導(dǎo)產(chǎn)生較高的免疫應(yīng)答[9-12]。研究者在獼猴、羊及豬等動(dòng)物中使用過電脈沖方式進(jìn)行DNA疫苗免疫，與傳統(tǒng)注射方式相比，電脈沖注射明顯提高了動(dòng)物機(jī)體對疫苗的應(yīng)答響應(yīng)[13-16]。但目前電脈沖法應(yīng)用于DNA避孕疫苗的研究鮮有報(bào)道。

本研究擬用電脈沖法輔助CZP3 DNA疫苗免疫小鼠，檢驗(yàn)電脈沖法對于CZP3 DNA避孕疫苗的免疫增效效果和最佳免疫劑量，評估免疫避孕效果，分析抗體水平與抗生育能力的相關(guān)性，為CZP3 DNA避孕疫苗的進(jìn)一步應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑 質(zhì)粒pcDNA3.0為本實(shí)驗(yàn)保存，pcDNA3-CZP3為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，6～8周齡BALB/c小鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。His標(biāo)簽一抗、HRP標(biāo)記的山羊抗鼠二抗均購自北京全式金公司。其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純級。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 pcDNA-CZP3的制備 將pcDNA3-CZP3重組質(zhì)粒氯化鈣法轉(zhuǎn)入DH5α中，鋪板，挑取單克隆菌株，搖菌，提取質(zhì)粒，酶切及測序鑒定。對鑒定正確的菌株擴(kuò)增2 L菌液，按照《分子克隆3》的實(shí)驗(yàn)步驟，進(jìn)行質(zhì)粒的大量提取、純化。用滅菌的生理鹽水溶解質(zhì)粒后，用Nanodrop測定質(zhì)粒的濃度。調(diào)整質(zhì)粒濃度，使注射組的質(zhì)粒終濃度為0.5 μg/μl，電脈沖注射組的質(zhì)粒終濃度分別為：0.25、0.5、1、2.5 μg/μl。pcDNA3.0空質(zhì)粒作為陰性對照，其質(zhì)粒制備及定量均按上述方法。

1.2.2 小鼠免疫實(shí)驗(yàn) 小鼠分組及免疫程序如表1，42只BALB/c小鼠隨機(jī)分為7組，每組6只。于免疫前24 h小鼠腿部肌肉分多點(diǎn)注射5 μg普魯卡因，選擇性破壞肌肉纖維，使肌細(xì)胞再生，增強(qiáng)細(xì)胞對于質(zhì)粒DNA的吸收。各電脈沖法免疫組在60 V電壓下進(jìn)行電脈沖刺激。免疫后每周對小鼠眼眶靜脈叢采血，分離血清，-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

表1 小鼠實(shí)驗(yàn)分組及免疫程序

Tab.1 Mice experiment groups and immunization programs

ImmunecycleImmunegroups0d14d28dIMcontrol50μg50μg50μgIMCZP350μg50μg50μg50μgEPControl10μg10μg10μgEPCZP35μg5μg5μg5μgEPCZP310μg10μg10μg10μgEPCZP320μg20μg20μg20μgEPCZP350μg50μg50μg50μg

Note：IM.Intramuscular inject；EP.Electric pulse.

1.2.3 抗體水平檢測 用本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的pET28a-CZP3c表達(dá)的CZP3c蛋白作為包被抗原，通過棋盤法確定包被濃度為10 μg/ml，100 μl包被96孔酶標(biāo)板。一抗的稀釋比例為1∶100，山羊抗鼠二抗的稀釋比例為1∶2 000，OD450檢測抗體水平。

1.2.4 pcDNA-CZP3免疫組抗體效價(jià)檢測 用電脈沖免疫pcDNA-CZP3 50 μg組小鼠第6周的血清做倍比稀釋，稀釋倍數(shù)分別為1∶50、1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000，ELISA檢測抗體滴度。

1.2.5 抗生育水平檢測 初免后42 d，將具有生育能力的BALB/c雄鼠按照1∶3的比例與免疫過的雌鼠進(jìn)行合籠，每天輪換雄鼠。3周后將雄鼠取出，統(tǒng)計(jì)雌鼠的產(chǎn)仔數(shù)，計(jì)算不育率。

2 結(jié)果

2.1 pcDNA3-CZP3的制備 EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切鑒定結(jié)果顯示，在約1 200 bp處出現(xiàn)目的條帶(圖1)。測序結(jié)果與Genbank上公布的CZP3基因的序列同源性100%。

2.2 CZP3抗體水平檢測 初免后2周，不同電脈沖法免疫劑量組的小鼠都產(chǎn)生了針對CZP3的抗體，而注射組與其對照組相比沒有出現(xiàn)差異，直到初免后4周注射組才產(chǎn)生抗CZP3抗體。到初免后6周注射組和電脈沖各免疫劑量組的抗體水平達(dá)到峰值，隨后開始下降，到初免后24周，注射組和各電脈沖法劑量組的抗CZP3抗體仍然維持在一定的水平。注射組與注射對照組相比只有初免后第9周才出現(xiàn)極顯著差異，而電脈沖各劑量組從初免第4周開始一直到第24周與對照組相比都呈顯著差異，初免后第6～14周呈極顯著差異，其中50 μg電脈沖法免疫組的抗體水平自第6周后一直處于各免疫組的最高水平。比較50 μg注射組和50 μg電脈沖組免疫水平發(fā)現(xiàn)，從初免后第2周到24周50 μg電脈沖組與50 μg注射組的抗體水平呈顯著差異，其中第4～24周呈極顯著差異。見圖2。

2.3 50 μg pcDNA3-CZP3電脈沖組抗體效價(jià)檢測 將50 μg pcDNA3-CZP3電脈沖法免疫組小鼠第6周的血清分別進(jìn)行倍比稀釋后，ELISA檢測最高抗體效價(jià)。圖3顯示，抗體稀釋1∶4 000時(shí)，電脈沖免>疫組小鼠的抗體水平相對于空白對照組呈極顯著差異。

圖1 pcDNA-CZP3雙酶切鑒定Fig.1 Identification of pcDNA3-CZP3 digested by EcoRⅠ and XhoⅠNote: 1.pcDNA3-CZP3 digested by EcoRⅠ and XhoⅠ; M.DL 2 000 marker.

圖2 不同免疫組的小鼠CZP3抗體水平檢測Fig.2 Antibody level of BALB/c mouse from different groups detected by ELISANote: A.Antibody level of injection group;B.Antibody level of electroporation group;C.Antibody level at same immune dose group(*.vs control group，0.01

表2 小鼠抗生育免疫實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析

Tab.2 Analysis of mice immune experiment statistical result

ImmunegroupMicenumberPregnantmicenumberInfertilityrate(%)MeannumberbornP1)IMControl660533±115IMCZP350μg660417±223EPControl660533±044EPCZP35μg65167417±183050EPCZP310μg660367±144EPCZP320μg626773±2003EPCZP350μg626772±2003

Note：IM.Intramuscular inject；EP.Electric pulse.Infertility rate = the amount of unbearing mice/the amount of female mice every group;The mean number born of each immune group show with mean ± SEM;1)pcDNA3-CZP3 group，pcDNA3.0 group vs normal saline group,infertility percent conduct Chi-square test.

圖3 電脈沖免疫CZP3 DNA疫苗的小鼠抗體效價(jià)檢測Fig.3 Detection of antibody titer on electric impulsed CZP3 groupNote: **.P<0.01, immune CZP3 DNA vaccine group is significantly different with negative group, statistical result analyzed by Chi-square test.

2.4 抗生育水平檢測 所有免疫組與其對照組相比小鼠的平均產(chǎn)仔數(shù)都有所減少，隨著免疫水平的提高，平均產(chǎn)仔數(shù)逐漸下降。免疫組小鼠生育率也隨著抗體水平的提高而降低，其中，20 μg、50 μg電脈沖法免疫組的小鼠生育率與對照組相比差異顯著(0.01

2.5 抗體水平與抗生育能力的相關(guān)性 對初免后第9周以電脈沖法免疫各組的產(chǎn)仔鼠平均數(shù)和抗體水平檢測結(jié)果(表2和圖2B)進(jìn)行相關(guān)性分析。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，相關(guān)系數(shù)為-0.976，P=0.004<0.01，相關(guān)系數(shù)具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明抗CZP3抗體水平與小鼠產(chǎn)仔數(shù)呈高度負(fù)相關(guān)，在一定范圍內(nèi)，抗CZP3抗體水平越高，小鼠的產(chǎn)仔數(shù)越少，疫苗的免疫不育效果越好。

3 討論

DNA疫苗肌肉注射免疫后，DNA質(zhì)粒被肌肉細(xì)胞和單核細(xì)胞吸收并在其內(nèi)表達(dá)。表達(dá)的抗原肽與肌肉細(xì)胞上的MHCⅠ分子或與抗原遞呈細(xì)胞上的MHCⅠ和 MHCⅡ結(jié)合，抗原遞呈細(xì)胞也可以直接從轉(zhuǎn)染細(xì)胞分泌物或從轉(zhuǎn)染引起凋亡的肌肉細(xì)胞中捕獲抗原蛋白[17,18]。結(jié)合了抗原的抗原遞呈細(xì)胞到達(dá)引流淋巴結(jié)，從而激活B細(xì)胞和T細(xì)胞，誘導(dǎo)產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答。但是DNA疫苗常規(guī)免疫方法的遞呈效率較低，抗原表達(dá)數(shù)量非常有限，導(dǎo)致DNA疫苗的免疫效果比傳統(tǒng)的蛋白疫苗遜色很多。電脈沖免疫首先將質(zhì)粒DNA注射進(jìn)入靶組織，隨后進(jìn)行電激。通過電脈沖將細(xì)胞膜暴露于電場條件下，變?yōu)闃O化膜，增強(qiáng)膜的通透性，降低負(fù)電荷DNA質(zhì)粒進(jìn)入雙分子層所需的能量[19]，從而增強(qiáng)DNA疫苗的免疫效果[20,21]。電脈沖免疫pcDNA3-CZP3 50 μg組無論是與注射免疫pcDNA3-CZP3 50 μg組還是與對照組相比，都能夠顯著提高免疫應(yīng)答水平，降低出生率與平均產(chǎn)仔數(shù)。注射免疫pcDNA3-CZP3 50 μg組與對照組相比雖然也能降低平均產(chǎn)仔數(shù)，但是其避孕效果與電脈沖免疫pcDNA3-CZP3 50 μg組相比還是相差較遠(yuǎn)。這也證實(shí)電脈沖確實(shí)可以增加細(xì)胞對于質(zhì)粒DNA的吸收，提高了抗原遞呈細(xì)胞的DNA疫苗的遞呈效率，從而能夠誘導(dǎo)較強(qiáng)的免疫應(yīng)答。

通常DNA疫苗注射所用的免疫劑量為100 μg/只小鼠，而在本次研究中僅用50 μg DNA質(zhì)粒電脈沖免疫小鼠所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答水平就遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于普通注射小鼠，同時(shí)能顯著降低小鼠的出生率及平均產(chǎn)仔數(shù)，證明了電脈沖這種免疫方式可以顯著增強(qiáng)DNA疫苗的免疫效果。雖然電脈沖免疫組產(chǎn)生了較高的抗體滴度，但是其避孕效果并沒有達(dá)到100 %，這可能因?yàn)槲覀兇舜蚊庖咝∈蟮腄NA避孕疫苗的抗原是CZP3，而CZP3與小鼠的ZP3同源性為66.8%，相似程度并不是很高，因而在小鼠體內(nèi)，CZP3 DNA疫苗表達(dá)的抗原蛋白的生物活性不高。因此要全面評價(jià)CZP3 DNA避孕疫苗的避孕效果，最終應(yīng)對靶動(dòng)物犬進(jìn)行免疫。電脈沖法免疫大大降低了免疫動(dòng)物對DNA疫苗劑量的要求，在較低免疫劑量的條件下就可以產(chǎn)生更為強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答，為犬避孕DNA疫苗的進(jìn)一步應(yīng)用奠定了一定的基礎(chǔ)。

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[收稿2016-07-04 修回2016-11-08]

(編輯 倪 鵬)

Efficacy of CZP3 DNA vaccine immune infertility enhanced by electric pulse method

WANGYing，ZHANGBei-Bei，ADILA·Aipire，ZHANGJi，LUOJiao-Jiao，ZHANGFu-Chun.

XinjiangKeyLaboratoryofBiologicalResourceandGeneticEngineering,CollegeofLifeScienceandTechnology,XinjiangUniversity,Urumqi830046,China

Objective:To analyze the immunocontraceptive efficacy of CZP3 DNA vaccine by electric pulse stimulating and the correlation between antibody level and antifertility.Methods: The mice were immunized with 5,10,20 and 50 μg DNA vaccine pcDNA3.0-CZP3 respectively and were stimulated at leg muscle by electric pulse.Detect the antibody level of each mice group and the highest antibody titer by ELISA.After mated with male mice for three weeks,calculated infertility rate of mice，the average litter size of each immune group and did statistical analysis.Results: Compared with the intramuscular injection alone,the electric pulse stimulation could increase serum antibody titers of mice significantly,the antibody titer of 50 μg group which was stimulated by electric pulse reached 1∶4 000.Moreover,the infertility of the mice increased and the mice average litter size reduced along with the increase of CZP3 antibody level significantly.Statistical analysis showed that the antibody level and the average litter size had a negative correlation.Conclusion: The electric pulse stimulation can improve the immune level and reduce the fertility efficiency of mice significantly,therefore establishes a foundation for further application of CZP3 DNA vaccine in stray dog contraception.

Canine zona pellucida 3;DNA vaccine;Electric pulse method;Immune antifertility

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.02.015

王 穎(1980年-)，女，博士，主要從事分子免疫學(xué)方面研究，E-mail: 328532518@qq.com。

及指導(dǎo)教師：張富春(1962年-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事分子免疫學(xué)方面研究，E-mail:zfcxju@qq.com。

Q819 R392-33

A

1000-484X(2017)02-0237-05

①本文為新疆維吾爾自治區(qū)科技支疆項(xiàng)目(No.201591134)。