DNA甲基化的植物學(xué)意義及其研究方法

李坤懌，袁文婭，王鵬文,通信作者

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DNA甲基化的植物學(xué)意義及其研究方法

李坤懌1，袁文婭2，王鵬文1,通信作者

（1. 天津農(nóng)學(xué)院農(nóng)學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，天津 300384；2. 天津市農(nóng)作物研究所，天津 300384）

DNA中堿基的化學(xué)修飾一直是生命科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點之一。DNA甲基化作為DNA序列的修飾方式，是一種重要的表觀遺傳機(jī)制，能夠在不改變DNA分子一級結(jié)構(gòu)的情況下調(diào)節(jié)基因組的功能，在生命活動中起著重要的作用。對于受到環(huán)境脅迫的植物生命體基因表達(dá)調(diào)控過程中也有DNA甲基化變化的痕跡。本文對植物DNA甲基化的產(chǎn)生機(jī)制、功能，DNA甲基化在植物應(yīng)對逆境脅迫中的作用以及用來分析檢測DNA甲基化技術(shù)方法的原理特點進(jìn)行綜述，以便更好地理解植物DNA甲基化及其對環(huán)境脅迫的響應(yīng)，為植物抗逆性研究及作物遺傳改良提供理論參照。

植物DNA甲基化；基因表達(dá)調(diào)控；DNA甲基轉(zhuǎn)移酶；生物學(xué)功能

DNA甲基化是指由S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl-methionine，SAM）提供所需要的甲基，在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的催化作用下使甲基（—CH3）轉(zhuǎn)移到DNA分子中特定堿基上，其中最常見的特定堿基是5-甲基胞嘧啶[1-2]。DNA甲基化屬于表觀遺傳學(xué)范疇，是真核細(xì)胞基因組在復(fù)制及轉(zhuǎn)錄后最為常見的一種修飾方式，對于生物生命活動起重要作用。DNA甲基化在調(diào)節(jié)基因組功能的同時不改變DNA分子堿基序列。植物DNA甲基化可以調(diào)控環(huán)境脅迫下的基因表達(dá)過程：調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育；控制某些特定植物基因沉默；調(diào)控某些特定基因表達(dá)，保持整個基因組遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性等。植物體可以通過甲基化、去甲基化和從頭甲基化作用來調(diào)控植物基因表達(dá)，當(dāng)自身不需要的時候不表達(dá)，需要的時候就表達(dá)，因此可達(dá)到在不同環(huán)境條件和發(fā)育階段下基因的調(diào)控[3]。

DNA甲基化是通過改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性以及DNA與蛋白質(zhì)之間的相互作用，來調(diào)控基因表達(dá)。對于植物體而言，環(huán)境發(fā)生變化會導(dǎo)致一些與之相對應(yīng)的表觀遺傳變異。當(dāng)不同程度的環(huán)境壓力作用于植物時，表觀遺傳發(fā)生變化會影響植物DNA的構(gòu)象，進(jìn)一步改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)及DNA與蛋白質(zhì)的相互作用，最終達(dá)到調(diào)節(jié)基因表達(dá)的作用[4-5]。研究表明，低溫、干旱、鹽堿、重金屬等人工模擬的非生物脅迫，均可誘導(dǎo)植物基因組中可遺傳DNA甲基化發(fā)生變異。用NaCl對油菜進(jìn)行鹽脅迫試驗，可以使耐鹽材料的甲基化水平降低，而鹽敏感材料的甲基化水平升高[6]；用不同時長的低溫脅迫因素對玉米的幼苗進(jìn)行試驗，可以改變玉米苗期葉片基因組DNA甲基化的模式[7]；用NaCl處理水稻，可以降低鹽敏感材料和耐鹽的根中甲基化水平，全甲基化比半甲基化水平高[8]；張美善[9]對高粱采用逆境脅迫，可以改變親本及雜交種基因組DNA甲基化的類型和水平；馮奇志[10]的研究表明，在吉林白城的鹽堿土中種植水稻，可以改變水稻的甲基化水平，且可以遺傳給后代。綜上所述，表觀遺傳的變異能促進(jìn)產(chǎn)生遺傳變異，豐富了植物的表型多樣性和環(huán)境適應(yīng)性，為培育新品種提供了新的方向。

1 DNA甲基化機(jī)理

DNA甲基化的過程包含兩個重要的形式：維持甲基化和重新甲基化。維持甲基化的過程是甲基化DNA完成復(fù)制后形成半甲基化DNA（DNA復(fù)制過程不能復(fù)制甲基化狀態(tài)），然后由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1（DNA methyltransferase 1，Dnmt1）根據(jù)親鏈上甲基化位點對已經(jīng)完成復(fù)制的半甲基化DNA做相應(yīng)的甲基化修飾，在此過程中，甲基化狀態(tài)穩(wěn)定性就由維持甲基化來起作用[11]。重新甲基化是在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3A（DNA methyltrans ferase 3A，Dnmt3a）和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3B（DNA methyltransferase 3B，Dnmt3b）的共同作用下，在無甲基修飾過的DNA位點上進(jìn)行甲基化修飾的過程[12]。去甲基化包括非特異性去甲基化和特異性去甲基化。在研究體外DNA去甲基化的試驗中發(fā)現(xiàn)，該過程是在去甲基化酶的作用下利用核苷酸切除和連接步驟而進(jìn)行的核酸替代過程，并受核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）的調(diào)節(jié)[13]。也有研究認(rèn)為，去甲基化可能是由糖基化酶或某種多肽以去除甲基的方式進(jìn)行[14]。在DNA復(fù)制的過程中，一些因子結(jié)合于DNA上，阻礙了甲基轉(zhuǎn)移酶（transmethylase，MTase）對半甲基化DNA的識別，因此甲基化形式不能被“遺傳”，而在不斷的傳代過程中，原有模板DNA上的甲基化被逐漸“稀釋”。

2 DNA甲基化植物生物學(xué)功能

2.1 DNA甲基化在基因組的防御中起作用

DNA甲基化對真核生物基因組排列構(gòu)象有較大影響。在5號碳原子上被甲基修飾過的胞嘧啶可以抑制外來DNA和外源轉(zhuǎn)座子（在基因組中可以通過切割、重新整合方式，從基因組中的一個位置“跳躍”到另一位置的一段可以移動的DNA序列）的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，從而保護(hù)基因組由于非等位基因之間產(chǎn)生的重組和轉(zhuǎn)座所導(dǎo)致的破壞，而且可避免許多由于外源DNA表達(dá)引起的病原侵染。在植物體中，阻止有害的轉(zhuǎn)座子表達(dá)可以通過甲基化發(fā)揮作用。例如擬南芥的基因沉默突變體sgs2、sgs3都比較容易受到病毒感染[14]，正是因為有害的轉(zhuǎn)座子沒有受到甲基化作用抑制而得到了表達(dá)，才容易被病毒侵染。

2.2 DNA甲基化參與調(diào)節(jié)植物的正常生長發(fā)育

在植物生長過程中，DNA甲基化參與調(diào)節(jié)其生長發(fā)育等很多生物過程，如果甲基化水平過低，就會導(dǎo)致植物生長發(fā)育及表型異常[15]。把甘藍(lán)的幼苗經(jīng)過5-氮雜胞苷（5-azac）處理后，甘藍(lán)幼苗DNA甲基化水平低于正常水平，在生長發(fā)育中出現(xiàn)各營養(yǎng)器官的發(fā)育不完全，比如植株矮化、葉片變小、結(jié)實率降低、果實小而蔫等現(xiàn)象[16]。在煙草和擬南芥中轉(zhuǎn)入可以抑制甲基化酶活性的基因，相對于對照組的DNA甲基化水平明顯高于轉(zhuǎn)入反義基因的植株的DNA甲基化水平，另外一個現(xiàn)象是試驗組的開花時間較對照組的提前，該研究結(jié)果表明，降低DNA甲基化的水平，可以使植物開花提前；轉(zhuǎn)入反義基因的植株和后代植物的生殖器官和營養(yǎng)都產(chǎn)生不同程度的異常，而且DNA甲基化的水平與這種現(xiàn)象成反比[17]。

2.3 DNA甲基化與植物的春化作用

Finnegan等[18]的研究表明，DNA甲基化可以影響植物春化作用的進(jìn)程，促進(jìn)植物開花，用5-azac和低溫處理都可以使植物早期開花。春化作用是通過使植物基因組的DNA甲基化的水平降低來實現(xiàn)的，去甲基化的程度越高，促進(jìn)開花的效果越明顯；甲基化水平越低，低溫春化促進(jìn)開花的作用越明顯。春化作用可以促進(jìn)開花的原因可能是其可以誘導(dǎo)植物開花的啟動子和相關(guān)的基因會發(fā)生去甲基化表達(dá)，然后抑制開花基因的重新甲基化，使開花基因不表達(dá)，最終改變植物體的生理生化狀態(tài)和蛋白的表達(dá)情況，從而誘導(dǎo)植物開花[19-20]。

2.4 DNA甲基化可引起轉(zhuǎn)基因沉默

轉(zhuǎn)基因沉默（transcriptional gene silencing, TGS）是向生物體內(nèi)導(dǎo)入的外源基因，可以特異性的被相應(yīng)序列的內(nèi)源或者外源基因抑制表達(dá)的現(xiàn)象，是一種基因調(diào)控現(xiàn)象。根據(jù)引起沉默的機(jī)制可以分為：轉(zhuǎn)錄基因沉默和轉(zhuǎn)錄后基因沉默（post-transcriptional gene silencing，PTGS）[21]。由于可以控制轉(zhuǎn)基因啟始的啟動子和編碼區(qū)的甲基化狀態(tài)，與轉(zhuǎn)基因沉默現(xiàn)象有關(guān)，所以DNA甲基化可以影響外源基因活性，從而引起轉(zhuǎn)錄基因沉默。DNA甲基化可直接或間接地影響基因表達(dá)，前者通過直接干擾DNA與轉(zhuǎn)錄活化因子結(jié)合，從而達(dá)到影響轉(zhuǎn)錄過程的效果[22-23]；而后者通過產(chǎn)生有特異性的蛋白質(zhì)與轉(zhuǎn)錄因子競爭甲基化DNA的結(jié)合位點，結(jié)合后的蛋白質(zhì)變成多蛋白質(zhì)的復(fù)合體，這個復(fù)合體可以改變?nèi)旧w組蛋白乙?；罱K達(dá)到抑制轉(zhuǎn)錄效果。目前鑒定了很多這樣的轉(zhuǎn)錄阻遏物，其中用于轉(zhuǎn)錄抑制已經(jīng)有4個[24]。

3 DNA甲基化的研究方法

3.1 全基因組DNA甲基化檢測方法

3.1.1 SssI甲基轉(zhuǎn)移酶法/甲基化酶溫育法

由SssI甲基轉(zhuǎn)移酶（SssI methyltransferase）作為催化劑來催化DNA的 CpG位點從頭甲基化，再將3H-S-腺苷甲硫氨酸（3H-SAM）中的甲基轉(zhuǎn)移到基因組DNA CpG位點的非甲基化胞嘧啶上。通過測量沒有參加反應(yīng)的3H-SAM的量，可以檢測到基因組DNA的甲基化水平，檢測結(jié)果中放射性量越多，說明基因組DNA的CpG位點的甲基化水平越低[25]。

SssI和SAM甲基轉(zhuǎn)移酶（SAM methyltrans ferase）的性質(zhì)不穩(wěn)定，試驗過程中需要設(shè)立對照組來降低試驗結(jié)果的誤差。DNA的溶解是否均一是試驗成功與否的一個至關(guān)重要的因素，因為它會影響到對DNA濃度測定精確程度，實際操作過程中可以先用識別位點中不含CpG序列的限制性內(nèi)切酶消化待測DNA，再用酚-氯仿抽提，但試驗過程中要注意防護(hù)同位素。

3.1.2 氯乙醛反應(yīng)法

氯乙醛反應(yīng)法是先用氯乙醛與基因組DNA反應(yīng)，然后用熒光分析法檢測DNA甲基化水平。該方法的原理是將基因組DNA用硫酸處理再將其提純后，將DNA鏈上的嘌呤用柱色譜或銀小心除去；再用亞硫酸處理，此時發(fā)生未甲基化的胞嘧啶位點會轉(zhuǎn)化為尿嘧啶；把氯乙醛與處理后的DNA樣品一起溫育，此時已甲基化的胞嘧啶就會轉(zhuǎn)變?yōu)闊晒庑院軓?qiáng)的乙烯胞嘧，就可以用啶熒光分析法來檢測[26]。熒光越強(qiáng)表明DNA甲基化水平越高。其中檢測成功與否的關(guān)鍵是嘌呤去除的是否完全。該方法的優(yōu)點是可檢測所有生物DNA序列甲基化水平，且僅需要少量下游純化，因為DNA和氯乙醛自身都是無熒光的。但是此法缺點是用到的氯乙醛有劇毒，而且比較耗時。

3.1.3 免疫學(xué)法

單克隆抗體與甲基化的胞嘧啶發(fā)生特導(dǎo)性反應(yīng)稱為免疫學(xué)法。此法原理是單克隆抗體使用異硫氰酸熒光素標(biāo)記，然后把固定在二乙氨基乙基（diethyl-aminoethanol，DEAE）薄膜上的DNA樣品和標(biāo)記好的單克隆抗體一起溫育，DNA甲基化的水平可通過測定所得的DEAE薄膜上的熒光素強(qiáng)度來反映。DNA甲基化的水平越高，熒光素強(qiáng)度就越高。該方法中抗體的設(shè)計關(guān)系到結(jié)果的高度敏感性和特異性。但是該法只能定量測定單鏈狀態(tài)下的甲基化胞嘧啶，而在濃縮染色體上很難可以有這種狀態(tài)[27]。

3.2 位點特異性DNA甲基化的檢測方法

3.2.1 限制性內(nèi)切酶檢測法（Southern Blot）

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)320余種可以識別特定序列是否被甲基修飾過的限制性內(nèi)切酶，甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶（MSREs）就是其中一種。這類酶中大多數(shù)只能切含有1個甲基化堿基位點，一些可以切半甲基化（雙鏈中只有一條鏈被甲基化）位點，一些能切全甲基化（雙鏈均被甲基化）位點。但是5-羥甲基胞嘧啶、糖化5-羥甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶或4-甲基胞嘧啶等由于結(jié)構(gòu)比較相似，所以識別時會難一些[28]。Southern Blot法是目前最普遍通用且基于此原理的方法[29]。此法中的兩種酶Ⅱ和Ⅰ，均可識別CCGG序列，可分別用RI/Ⅱ，R I/Ⅰ兩種酶組合對DNA進(jìn)行雙酶切。此法優(yōu)點是只需提供待測樣品基因組DNA，不需要知道整個DNA序列以及詳細(xì)一級結(jié)構(gòu)，就可以對被檢基因直接評價以及定量分析甲基化。

在MSREs法基礎(chǔ)上，Pogribny等[30]建立了一種更加靈敏的甲基化分子新方法，該方法先進(jìn)之處在于：切割基因組DNA時用MSREs（如Ⅱ、Ⅰ、和HⅡ），顯露出5-G，繼而用3H-dCTP進(jìn)行單鏈DNA復(fù)制延伸，使鳥嘌呤堿基上3H數(shù)量直接與已切割完畢剩下的未甲基化 CpG位點成比例相關(guān)。在抑癌基因異常甲基化、基因或染色體的印跡分析以及某些遺傳疾病診斷中，常常會用到MSREs法以及它的改進(jìn)方法。這種方法的優(yōu)點有：靈敏性較高，可以檢測到納克級DNA；具有放射性標(biāo)記，可以不依賴于完整DNA；不需要DNA甲基化酶反應(yīng)或PCR擴(kuò)增就可以檢測甲基化。但是這種方法也存在著一些缺點，比如對樣品DNA的純度要求特別高，這個指標(biāo)對結(jié)果分析至關(guān)重要，另外主要用酶不同的拓?fù)洚悩?gòu)酶也會與其競爭與DNA的結(jié)合位點并形成共價中間產(chǎn)物從而影響酶切反應(yīng)。這個方法主要缺點是：DNA必須要酶切完全，否則會影響試驗結(jié)果；如果待檢片段中有多處甲基化狀態(tài)的CpG位點不統(tǒng)一，既有甲基化也有非甲基化，那么對結(jié)果將難以得出結(jié)論[14，31]。

3.2.2 基因組直接測序法

一直以來，基因組直接測序法是研究DNA甲基化的主要方法，該法主要原理是先用Maxam- Gilbert化學(xué)裂解法裂解DNA，然后通過PCR擴(kuò)增后電泳，通過跑出的電泳條帶分析序列。此法的優(yōu)點是保護(hù)5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5mC），可以通過測序膠上缺少對應(yīng)反應(yīng)產(chǎn)物的特定條帶來鑒定沒有被裂解5mC。

3.2.3 甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性（methylation sensitive amplification polymorphism，MSAP）分析法

MSAP是以擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）技術(shù)為基礎(chǔ)發(fā)展而來的，AFLP技術(shù)中內(nèi)切酶Ⅰ被限制性內(nèi)切酶Ⅱ和Ⅰ替代，Ⅰ酶特異性切割的片段被Ⅱ和Ⅰ酶所識別的5’-CCGG序列代替，其本質(zhì)是：將AFLP技術(shù)中的功能酶和目標(biāo)條帶換成對甲基化特異性的酶和序列5’-CCGG。MSAP主要包括DNA模板制備、雙酶切、PCR擴(kuò)增和電泳檢測等步驟。其原理是：采用Ⅱ和Ⅰ酶，對基因DNA進(jìn)行雙酶切，然后加上與之對應(yīng)的限制性內(nèi)切酶接頭，利用接頭序列設(shè)計引物，特異性擴(kuò)增5’-CCGG位點甲基化片段。Ⅱ和Ⅰ可以識別相同位點，但是在DNA甲基化的敏感程度上，Ⅱ和Ⅰ的差別比較大。所以擴(kuò)增出的結(jié)果有不同譜帶，可以通過這個現(xiàn)象檢測出基因組DNA總甲基化水平，并且區(qū)分出全甲基化和半甲基化等狀態(tài)[32]。

目前，在DNA甲基化研究中，運用比較普遍的方法是MSAP技術(shù)，與其他方法相比，MSAP技術(shù)有很多優(yōu)點：在全基因組范圍內(nèi)，可以檢測到CCGG 位點胞嘧啶甲基化變化，而且植物中存在CCGG比較廣泛；該方法中酶所識別的序列相同，所以可以在不知道待測DNA 序列信息情況下檢測；MSAP技術(shù)是在AFLP技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展而來的，使用這種方法時有理論可以依據(jù)，實際操作時有可行的操作方法，運用時比較方便。但是這個技術(shù)也有一定的局限性，如無法檢測非CCGG 位點的胞嘧啶的甲基化[33]。

4 小結(jié)

DNA的甲基化修飾普遍存在于植物生長發(fā)育整個過程中，是植物通過基因調(diào)控生長發(fā)育過程的重要手段，因此研究植物生長發(fā)育過程中的DNA甲基化有重要意義。DNA甲基化貫穿植物一生，從一粒種子到成熟再到衰老的過程中，它作為一種重要的表觀遺傳現(xiàn)象，在許多生理活動中方面都發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，且DNA分子的一級結(jié)構(gòu)不會被改變。當(dāng)甲基化修飾以半甲基化形式標(biāo)記DNA時參與的生命活動有：控制DNA復(fù)制啟動和終止，控制DNA復(fù)制過程中出現(xiàn)錯誤然后修正的過程；甲基化修飾可以保證DNA分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，減少不利因子轉(zhuǎn)錄，從而確?；蚪M遺傳物質(zhì)能一代接一代穩(wěn)定遺傳下去；參與調(diào)配細(xì)胞分化方向，是細(xì)胞命運去向的指揮官，從而維持植物正常生長發(fā)育。近來有研究表明，不良環(huán)境脅迫可以誘導(dǎo)植物基因組產(chǎn)生DNA甲基化狀態(tài)的變化來適應(yīng)新的不良環(huán)境，有人認(rèn)為這種可遺傳的表型變異可以改良植物的性能，為育種提供了新的途徑。DNA甲基化產(chǎn)生和維持的機(jī)制以及在植物生命活動中的生物學(xué)功能的研究在逐年增加，但是目前DNA甲基化的作用機(jī)制尚還不是明確，研究DNA甲基化不夠深入，得到的一些結(jié)論還不成熟，迫切需要攻破的問題主要有以下幾個：①其涉及的信號傳遞與轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，甲基化到底是怎樣控制復(fù)制的起始，它的作用媒介到底是誰？②植物的全基因組甲基化水平普遍較低，但為什么只有胞嘧啶的甲基化水平卻較高？③目前還未知的是，造成基因沉默的源動力是什么？總而言之，深入研究DNA甲基化還有很大的發(fā)展空間，如果可以闡明DNA甲基化的作用機(jī)理以及在生物體發(fā)育的各階段中DNA甲基化起到的作用，將會為作物遺傳改良與新品種的選育提供新的研究方向。

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責(zé)任編輯：宗淑萍

Botany Meaning and Research Methods of DNA Methylation

LI Kun-yi1, YUAN Wen-ya2, WANG Peng-wen1,Corresponding Author

（1. College of Agronomy and Resource Environment, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China；2. Tianjin Crops Research Institute, Tianjin 300384, China）

In recent years, chemical modification in DNA bases has been one of the hottest areas of life science research. DNA methylation as one kind of modification way of DNA sequences, is an important epigenetic mechanism. It can regulate the expression of many vital genes while the base compositions of these genes don’t change, therefore DNA ethylation is very important to the plant’s grow progress. For the plants under environmental stress, the number of DNA methylation had changed during the regulation of gene expression. This paper introduces the mechanisms and biological functions of DNA methylation in plant, and its functions in plant response to environmental stress, and the principle and characteristics of the method for DNA methylation analysis. This would enable us to better understand the methylation of plant DNA and its response to environmental stress, and provide a theoretical reference for plant stress tolerance research and crop genetic improvement.

plant DNA methylation; gene expression and regulation; DNA methyltransferase; biological function

1008-5394（2017）01-0077-06

Q75

A

2016-07-14

天津市農(nóng)科院院長基金項目“鹽脅迫下玉米雜交種與親本間DNA甲基化差異性分析”（15011）

李坤懌（1992-），男，新疆昌吉人，碩士在讀，研究方向：作物遺傳育種。E-mail: 845613986@qq.com。

王鵬文（1957-），男，遼寧蓋州人，教授，博士，主要從事作物遺傳育種方面的研究。E-mail: pengwenw@sina.com。