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    中藥有效成分硫酸多聚糖WSS25在動物膠質(zhì)瘤血管再生中的實驗研究

    2017-02-23 13:57續(xù)嶺王培謝明祥肖順武猶春躍吳海
    關(guān)鍵詞:膠質(zhì)瘤

    續(xù)嶺 王培 謝明祥 肖順武 猶春躍 吳海濤 張學(xué)軍 趙洪新 唐懷波 代垠

    【摘要】 目的:分析中藥有效成分硫酸多聚糖WSS25對動物模型下腦膠質(zhì)瘤血管再生的影響作用。方法:以10只正常大鼠腦組織作為對照組,以20只C6膠質(zhì)瘤模型大鼠腦腫瘤組織作為觀察組,對比兩組微血管密度計數(shù)(MVD)及CD34陽性表達(dá)率差異。同時將30只C6膠質(zhì)瘤模型大鼠分為未接受藥物干預(yù)的未干預(yù)組及接受硫酸多聚糖WSS25干預(yù)的干預(yù)組,每組15只。對比兩組MVD計數(shù)及CD34陽性表達(dá)率差異。結(jié)果:觀察組腦組織或腫瘤組織中MVD計數(shù)及CD34陽性表達(dá)率均明顯高于對照組(P<0.05),干預(yù)組腦腫瘤組織中MVD計數(shù)及CD34陽性表達(dá)率均明顯低于未干預(yù)組(P<0.05)。結(jié)論:大鼠C6膠質(zhì)瘤模型腦腫瘤組織中血管均明顯增生,且經(jīng)硫酸多聚糖WSS25干預(yù)后,腦腫瘤組織中血管可顯著降低,其作用機(jī)制可能與CD34密切相關(guān)。

    【關(guān)鍵詞】 硫酸多聚糖WSS25; 大鼠; 膠質(zhì)瘤; 血管再生

    Study the Role of Glioma Angiogenesis and Its Mechanism of Chinese Medicine Effective Component Polysaccharide Sulfate WSS25 in Animal Models of Cerebral Glioma Angiogenesis/XU Ling,WANG Pei,XIE Ming-xiang,et al.//Medical Innovation of China,2017,14(02):001-004

    【Abstract】 Objective:To analyze the glioma angiogenesis and its mechanism of component Polysaccharide Sulfate WSS25 impact on animal models of cerebral glioma angiogenesis in animal models of cerebral glioma angiogenesis.Method:As the control group,with 10 normal rats,20 C6 glioma model rats were as the observation group,counting microvascular density(MVD) and CD34 positive expression rate the positive expression rate differences of two groups were compared.At the same time,30 rat of C6 glioma model were divided into the intervention group(Polysaccharide Sulfate WSS25) and the without intervention group,15 cases in each group.MVD counting and CD34 positive expression rate of two groups were compared.Result:MVD and CD34 positive expression in the observation group of brain tissue were significantly higher than those of the control group(P<0.05),MVD and CD34 positive expression in the intervention group were lower than those of the without intervention group(P<0.05).Conclusion:Rat C6 glioma model in brain tissue hyperplasia of blood vessels and lymphatic vessels are obvious,and the polysaccharide sulfate WSS25 after the intervention,in the brain blood vessels and lymphatic vessels can be significantly reduced,its mechanism may be closely related with CD34.

    【Key words】 Polysaccharide Sulfate WSS25; Rat; Glioma; Angiogenesis

    First-authors address:Affiliated Hospital of Zunyi Medical College,Zunyi 563003,China

    doi:10.3969/j.issn.1674-4985.2017.02.001

    腦膠質(zhì)瘤為臨床最為常見的顱內(nèi)惡性腫瘤,其占顱內(nèi)惡性腫瘤的50%左右,臨床有著較高的發(fā)病率[1]。雖然目前臨床已經(jīng)出現(xiàn)了包括手術(shù)治療、放射治療、藥物化療及基因免疫治療在內(nèi)的多種治療方法及治療方案,可應(yīng)用于本病的臨床治療,但因本病有著增長迅速且易于復(fù)發(fā)的臨床特征,不僅增加了本病的治療難度,同時也使得患者的死亡率較高[2]。近年來臨床研究顯示,腦膠質(zhì)瘤快速增生其原因與腫瘤內(nèi)部血管生成有著密切的關(guān)系,快速生成的腫瘤內(nèi)部血管,可為腫瘤提供充足的氧氣及營養(yǎng)成分,促進(jìn)腫瘤組織的快速增長,因此抗腫瘤血管生成目前已經(jīng)成為惡性腫瘤治療中最為重要的治療方向之一[3]。而近年來臨床觀察顯示,中藥天麻有效成分硫酸多聚糖WSS25在一定程度上具有著抗腫瘤血管生長的作用,而對于其作用機(jī)制目前臨床研究上少。故為可系統(tǒng)地評價硫酸多聚糖WSS25對腫瘤內(nèi)部血管生長的影響及其作用機(jī)制,本研究將其應(yīng)用于C6膠質(zhì)瘤模型大鼠中,現(xiàn)報道如下。

    1 資料與方法

    1.1 一般資料 以60只Wistar雄性大鼠作為觀察對象,隨機(jī)將大鼠分為對照組、觀察組、未干預(yù)組及干預(yù)組四組。對照組含大鼠10只,未接受腦膠質(zhì)瘤建模;觀察組含大鼠20只,接受C6腦膠質(zhì)瘤建模;未干預(yù)組含大鼠15只,為C6腦膠質(zhì)瘤建模成功后,未接受硫酸多聚糖WSS25干預(yù);干預(yù)組含大鼠15只,為C6腦膠質(zhì)瘤建模成功后,接受腫瘤內(nèi)注射硫酸多聚糖WSS25干預(yù)。對照組體質(zhì)量261~296 g,平均(279.66±12.11)g;觀察組體質(zhì)量262~297 g,平均(277.33±12.26)g;未干預(yù)組體質(zhì)量260~298 g,平均(278.16±12.09)g;干預(yù)組體質(zhì)量261~298 g,平均(279.98±12.05)g。對照組與觀察組間、未干預(yù)組與干預(yù)組間體質(zhì)量比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。

    1.2 建模方法 觀察組、未干預(yù)組及干預(yù)組三組內(nèi)大鼠均需接受C6膠質(zhì)瘤建模,C6膠質(zhì)瘤購自中科院上海生物學(xué)研究所。大鼠均于麻醉、固定及消毒后,進(jìn)行開顱鉆孔,暴露局部腦組織,隨后將C6膠質(zhì)瘤接種至右腦尾狀核部位,完成接種后,觀察組及未干預(yù)組立即封閉鉆孔部位,而干預(yù)組隨后均于該部位硫酸多聚糖WSS25局部注入,見圖1~4。所有大鼠均于C6膠質(zhì)瘤接種20 d后處死。

    1.3 標(biāo)本制作 大鼠處死后,留取局部腦組織(對照組隨機(jī)選擇腦組織部位,觀察組、未干預(yù)組及干預(yù)組選取膠質(zhì)瘤部位),應(yīng)用免疫組化S-P法對四組局部腦組織或腫瘤中CD34及LYVE-1陽性表達(dá)率進(jìn)行及觀察。免疫組化S-P方法:首先對所有腦組織或腫瘤組織組織裂解,做成細(xì)胞懸液,完成固定及包埋后,進(jìn)行切片,切片厚度為4 μm。隨后將所有切片置于80 ℃下進(jìn)行溫烘烤,烘烤時間設(shè)定為50 min。烘烤完成后,將切片進(jìn)行脫蠟及脫水處理。完成以上操作后,需對標(biāo)本切片進(jìn)行孵育,孵育液應(yīng)用3%過氧化氫,孵育溫度為室溫,孵育時間為10 min。隨后進(jìn)行蒸餾水沖洗及5 min的PBS浸泡。完成浸泡后,將標(biāo)本切片放置于沸騰的枸櫞酸鈉沖液中,放置時間為15 min。取出后需于室溫下靜置40 min,并進(jìn)行PBS沖洗3次。沖洗完成后進(jìn)行一抗及二抗,一抗及二抗結(jié)束時分別進(jìn)行3次PBS沖洗。完成一抗及二抗后進(jìn)行標(biāo)本切片的染色及復(fù)染,染色應(yīng)用DAB染色,復(fù)染應(yīng)用蘇木素。免疫組化試劑盒為KIT-5010(購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司),DAB顯色試劑盒為

    DAB-0031(購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)。

    1.4 觀察指標(biāo) 首先將所有切片標(biāo)本置于顯微鏡低倍鏡下進(jìn)行觀察,選取標(biāo)本中血管豐富區(qū)域,轉(zhuǎn)換為高倍鏡,于高倍鏡下統(tǒng)計MVD計數(shù)。其次,對所有標(biāo)本組織裂解,做成細(xì)胞懸液,免疫組化辨別CD34、MMP-9、VEGF、TSP-1及PPAR-γ陽性率進(jìn)行判定,均以標(biāo)本中棕黃色細(xì)胞漿>10%者為陽性。對比兩組MVD計數(shù)、CD34、MMP-9、VEGF、TSP-1及PPAR-γ陽性率表達(dá)率差異。

    1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 本研究所得所有數(shù)據(jù)均導(dǎo)入SPSS 19.0軟件中,建立數(shù)據(jù)庫。計量資料用(x±s)表示,比較采用t檢驗;計數(shù)資料以率(%)表示,比較采用 字2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 對照組與觀察組MVD計數(shù)比較 對照組腦組織中MVD計數(shù)為(3.11±1.25)個/HP,觀察組腦腫瘤組織中MVD計數(shù)為(8.33±2.16)個/HP,觀察組明顯高于對照組(P<0.05)。

    2.2 對照組與觀察組血管因子陽性表達(dá)率比較 觀察組腦腫瘤組織中CD34、MMP-9及VEGF陽性表達(dá)率均明顯高于對照組,而TSP-1及PPAR-γ均明顯低于對照組(P<0.05),見表1。

    2.3 未干預(yù)組與干預(yù)組MVD與LVD計數(shù)比較 未干預(yù)組腦腫瘤組織中MVD計數(shù)為(8.55±2.32)個/HP,干預(yù)組腦腫瘤組織中MVD計數(shù)為(6.29±2.15)

    個/HP,干預(yù)組明顯低于未干預(yù)組(P<0.05)。

    2.4 未干預(yù)組與干預(yù)組間血管因子陽性表達(dá)率比較 干預(yù)組腦腫瘤組織中CD34、MMP-9及VEGF陽性表達(dá)率均明顯低于未干預(yù)組,而TSP-1及PPAR-γ明顯高于未干預(yù)組(P<0.05),見表2、圖5~7。

    3 討論

    3.1 膠質(zhì)瘤動物建模概況 因大鼠在膠質(zhì)瘤模型建立過程中具有著經(jīng)濟(jì)易得、制作簡單、腫瘤生長迅速、模型制作時間短、生存期可標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點,因此大鼠為目前臨床應(yīng)用于制作膠質(zhì)瘤最為常用的模型動物[4]。而雖然目前臨床可應(yīng)用于建立膠質(zhì)瘤模式的大鼠可包括Wistar大鼠、SD大鼠及無腺裸鼠等多種,但臨床觀察顯示,僅Wistar大鼠所制作出的動脈模型更接近于腦膠質(zhì)瘤[5-6]。而臨床在進(jìn)行模型建立過程中,最為常用的細(xì)胞株則包含C6、9L、T9 和F98等多,而通過近年來臨床觀察顯示,C6細(xì)胞株所制作出的膠質(zhì)瘤模型,具有著簡單、穩(wěn)定、成本低、易大規(guī)模制備等優(yōu)點,已被臨床廣泛應(yīng)用于膠質(zhì)瘤的動物模型制作中[7-8]。雖然通過C6所致制作出的動脈模型具有較前的免疫原性,對于腫瘤的免疫學(xué)研究存在一定的缺陷,但其對于腫瘤內(nèi)血管的生長卻敏感性較高,因此在對于評價腫瘤內(nèi)部血管再生情況,常應(yīng)用C6模式[9-10]。因此,本研究將C6膠質(zhì)瘤模型作為觀察模型。

    3.2 CD34及MVD評價價值 雖然近年來醫(yī)學(xué)技術(shù)有著飛速的發(fā)展,但是對于惡性腫瘤的發(fā)生機(jī)制,仍未完全明確。但近年來臨床研究顯示,惡性腫瘤組織內(nèi)部細(xì)胞因子可顯著升高,且可伴有血管及淋巴管增生[11-12]。因此有學(xué)者認(rèn)為,惡性腫瘤的發(fā)生及發(fā)展與體內(nèi)多種細(xì)胞因子升高及血管及淋巴管增生可能與均存在顯著的關(guān)系[13-15]。

    而在本研究所選取的觀察的指標(biāo)中,MVD計數(shù)可通過直視觀察對組織內(nèi)血管密度情況進(jìn)行分析,最為直觀的評價腫瘤組織內(nèi)血管情況的指標(biāo)。而CD34屬鈣黏蛋白,生理情況下,其僅分布于造血干細(xì)胞膜及血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi),而局部血管再生后,也可使得局部血管內(nèi)皮細(xì)胞含量升高,使得表達(dá)情況明顯升高[16-17]。因此其可作為評價血管再生情況最可靠的標(biāo)記物之一。因此本研究將MVD計數(shù)及CD34作為觀察指標(biāo),以評價膠質(zhì)瘤組織內(nèi)的血管再生情況。

    而本研究在分析硫酸多聚糖WSS25對大鼠C6膠質(zhì)瘤模型內(nèi)血管再生情況前,對模型內(nèi)血管再生情況進(jìn)行分析,結(jié)果顯示:觀察組腦組織中MVD計數(shù)及CD34陽性表達(dá)率均明顯高于對照組(P<0.05)。由此可見,腦膠質(zhì)瘤動物模型內(nèi),血管再生情況顯著。

    3.3 硫酸多聚糖WSS25作用分析 硫酸多聚糖WSS25為提取自中藥天麻的藥物有效成分,目前臨床研究顯示,其具有著一定的抗癌細(xì)胞生長及抗血管生成的作用,因此本研究將其應(yīng)用于膠質(zhì)瘤的動物模型中,以探討其在膠質(zhì)瘤中的作用。通過本研究結(jié)果可見:在接受硫酸多聚糖WSS25干預(yù)的膠質(zhì)瘤動脈腦組織標(biāo)本中,其MVD計數(shù)均明顯低于對照組,且CD34陽性表達(dá)率明顯低于未干預(yù)組(P<0.05)??梢?,在應(yīng)用了硫酸多聚糖WSS25干預(yù)后,大鼠C6膠質(zhì)瘤模型中的血管降低,且可刺激血管生長的CD34因子的陽性表達(dá)率也顯著的下降。有研究表明,硫酸多聚糖WSS25可在一定程度上降低動物模型內(nèi)血管的再生情況,且其機(jī)制可能與抑制CD34因子有關(guān)[18-21]。

    綜上所述,大鼠C6膠質(zhì)瘤模型腦組織中血管及淋巴管均明顯增生,且經(jīng)硫酸多聚糖WSS25干預(yù)后,腦組織中血管及淋巴管可顯著降低,其作用機(jī)制可能與CD34密切相關(guān)。

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    (收稿日期:2016-11-15) (本文編輯:程旭然)

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