白細(xì)胞介素10和γ干擾素基因表達(dá)在大鼠肝移植排斥反應(yīng)診斷中的意義

張杰　張環(huán)　唐滔　李康　閻玉礦

【摘要】 目的：研究探討白細(xì)胞介素10和γ干擾素基因表達(dá)在大鼠肝移植排斥反應(yīng)診斷中的意義。方法：以成年、健康的二級(jí)雌性SD大鼠、Wistar大鼠為研究對(duì)象，體重為（250±20）g，實(shí)施肝移植手術(shù)，術(shù)后采用RT-PCT技術(shù)對(duì)大鼠白細(xì)胞介素10（IL-10）和γ干擾素基因（IFN-γ）表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，并以組織病理學(xué)結(jié)果為急性排斥反應(yīng)的診斷標(biāo)準(zhǔn)，將大鼠分為排斥組與非排斥組，對(duì)比觀察兩組大鼠的IL-10與血清IFN-γ含量及移植肝臟內(nèi)IL-10與IFN-γ基因表達(dá)情況。結(jié)果：同系移植組肝移植后肝細(xì)胞、組織、結(jié)構(gòu)輕微變化，同種異體移植組則變化顯著，嚴(yán)重紊亂。同系移植組血清IL-10含量最高，顯著高于同種異體移植組與對(duì)照組（P<0.05）；同種異體移植組IFN-γ含量最高，顯著高于同系移植組與對(duì)照組（P<0.05）。同系移植組肝臟IL-10 mRNA表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組與同種異體移植組（P<0.05）；同種異體移植組IFN-γmRNA表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組與同系移植組（P<0.05）。結(jié)論：大鼠肝移植手術(shù)后發(fā)生排斥反應(yīng)的IL-10表達(dá)顯著降低，IFN-γ表達(dá)顯著增高，兩者表達(dá)的變化可作為早期診斷肝移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)的診斷指標(biāo)，為臨床診斷提供依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】 肝移植； 大鼠； IL-10； IFN-γ

Significance of Gene Expression of Interleukin 10 and γ Interferon in the Diagnosis of Rejection in Rat Liver Rransplantation/ZHANG Jie，ZHANG Huan，TANG Tao，et al.//Medical Innovation of China，2017，14（02）：017-020

【Abstract】 Objective：To study and probe into the significance of gene expression of interleukin 10 and γ interferon in the diagnosis of rejection in rat liver transplantation.Method：The adult and healthy two female SD rats and Wistar rats were selected as research objects，the body weight was （250±20）g，liver transplantation was carried out，and the expression of interleukin 10（IL-10） and γ interferon gene（IFN-γ） was detected by

RT-PCT after operation，and according to the diagnostic criteria of acute rejection were studied by histopathological results，the rats were divided into rejection group and non rejection group.Then，the contents of IL-10 and serum IFN-γ and the expression of IL-10 and IFN-γ in liver transplantation of two groups were compared.Result：After liver transplantation，the liver cells，tissues and structures in the isograft group were slightly changed，and the allograft group were changed significantly，and the serious disturbance.The level of serum IL-10 in the isograft group were significantly higher than those of the allograft group and the control group（P<0.05）.The content of IFN-γ in the allograft group was highest，which was significantly higher than those of isograft group and the control group（P<0.05）.The expression level of mRNA IL-10 in liver in the isograft group was significantly higher than those in the control group and the allograft group（P<0.05）.The expression level of IFN-γ mRNA in liver in the allograft grou was significantly higher than those in the control group and the isograft group（P<0.05）.Conclusion：The expression of IL-10 is significantly decreased after liver transplantation in rats，and the expression of IFN-γ is significantly increased，and the changes of expression of IL-10 and IFN-γ could be used as a diagnostic index for early diagnosis of acute rejection after liver transplantation.

【Key words】 Liver transplantation； Rat； IL-10； IFN-γ

First-authors address：Longgang Central Hospital of Shenzhen，Shenzhen 518116，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.02.005

肝移植已經(jīng)成為了肝臟外科手術(shù)的成熟技術(shù)，對(duì)大部分的終末期肝病患者來說是唯一一種有效治療方式[1]。通過免疫治療劑的應(yīng)用獲得一定的成功，但是因浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞與其他炎癥細(xì)胞所造成的急性排斥反應(yīng)仍然是肝移植術(shù)后患者生存的危險(xiǎn)因素[2]。相關(guān)研究顯示，在排斥反應(yīng)中IFN-γ對(duì)移植物損傷有支配作用，同時(shí)還受到其他因子的影響，如IL-10等[3-4]?；诖耍狙芯刻接懥薎L-10和IFN-γ基因表達(dá)在大鼠肝移植排斥反應(yīng)診斷中的意義，為早期診斷肝移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)提供依據(jù)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 以成年、健康、活潑的二級(jí)雌性SD大鼠、Wistar大鼠（SPF級(jí)）為研究對(duì)象，體重為180～250 g，平均（230±20）g，所有大鼠均從廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)買，許可證號(hào)SCXK（粵）2013-0034。均飼養(yǎng)在清潔、恒溫的環(huán)境下，維持12 h晝夜節(jié)律，按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與使用原則進(jìn)行。供體與受體大鼠在術(shù)前禁食8～12 h，自由飲水。

1.2 試劑與儀器 APC Rat Anti-Human IL-10（貨號(hào)554707）和APC Rat Anti-Mouse IFN-γ（貨號(hào)554413）均來源于BD Biosciences公司；總蛋白提取試劑盒（貨號(hào)37901）、RNA提取試劑盒（貨號(hào)74104）、QIAamp DNA Mini Kit（51304）均來源于Qiagen公司。10%多聚甲醛、光學(xué)顯微鏡、冷凍離心機(jī)、凝膠成像系統(tǒng)、超低溫冰箱等。

1.3 方法 對(duì)大鼠進(jìn)行肝移植，采用改良Kamada二袖套法[5]，不進(jìn)行靜脈分流。受體體重略高于供體體重。實(shí)驗(yàn)分組：（1）對(duì)照組，選正常SD大鼠，僅將腹部正中切開，單純行膽道外引流，然后關(guān)腹，術(shù)后與移植組處理相同；（2）同系移植組，供體和受體均為SD大鼠；（3）同種異體移植組，SD大鼠為受體，Wistar大鼠為供體。每組10只（指手術(shù)成功排除術(shù)后腹腔感染出血，引流管脫落、細(xì)菌培養(yǎng)呈陽性，最終用于實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)的大鼠）。術(shù)后7 d將大鼠處死，采集樣本并檢測(cè)[6]。

手術(shù)操作：（1）供體手術(shù)。術(shù)前0.5 h給予大鼠皮下注射0.02 mg阿托品，腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/kg），于腹正中位置切口進(jìn)腹，靜脈注射2 mL肝素生理鹽水（經(jīng)陰莖背靜脈注射），將肝臟向下牽引。對(duì)第二肝門實(shí)施解剖：肝臟周韌帶進(jìn)行游離，將左膈肌靜脈縫扎。對(duì)肝下下腔靜脈進(jìn)行解剖，將切斷的右腎上腺靜脈進(jìn)行結(jié)扎。游離右腎肝下下腔靜脈，游離右腎靜脈結(jié)扎切斷。進(jìn)行第一肝門解剖：對(duì)膽總管游離，剪開前壁，插入膽管支架管到肝側(cè)，用5-0絲線進(jìn)行固定，對(duì)膽管遠(yuǎn)端離斷。分離結(jié)扎并將肝固有動(dòng)脈切斷，游離肝門靜脈到脾靜位置進(jìn)行結(jié)扎然后剪斷。適當(dāng)注入15 mL灌注液，經(jīng)肝門靜脈對(duì)肝臟灌洗，速度控制在3～4 mL/min，低壓，避免肝臟腫脹。在左腎靜脈以下將下腔靜脈剪斷，讓灌洗液流出，使供肝在短時(shí)間內(nèi)達(dá)到冷缺血狀態(tài)。灌注的同時(shí)對(duì)胃底向左側(cè)微微牽拉，將肝食管韌帶內(nèi)血管交通支充分暴露，然后結(jié)扎切斷，等到肝臟變?yōu)橥咙S色以后將肝下下腔靜脈、門靜脈剪斷，盡可能的留長(zhǎng)殘端。對(duì)肝輕輕下牽，使用眼科剪將肝上下腔靜脈剪下，避免有膈肌組織。將肝取出放置在0～4 ℃保存液。修整供肝：建立起肝下下腔靜脈、門靜脈袖套管，然后使用7-0帶針線對(duì)肝上下腔靜脈左側(cè)、右側(cè)縫吊1針。（2）受體手術(shù)：于術(shù)前0.5 h給予大鼠皮下注射0.02 mg阿托品，吸入乙醚，麻醉后臥位固定，背部墊高，采用供體相同切口，對(duì)肝周韌帶進(jìn)行游離，靠近膈肌將左膈肌靜脈結(jié)扎切斷。第一肝門分離出膽總管：結(jié)扎切斷膽總管，分離肝固有動(dòng)脈然后實(shí)施結(jié)扎切斷，將門靜脈至左右支分叉處分離。對(duì)肝下下腔靜脈實(shí)施分離，連同軟組織進(jìn)行腎上腺靜脈結(jié)扎。離斷肝后韌帶到達(dá)膈下，將肝下下腔靜脈用血管夾阻斷。采用Satinsky鉗貼膈肌夾閉肝上下腔靜脈，將肝上下腔靜脈、門靜脈左右分支與肝下下腔靜脈剪斷，取出受體肝臟。原位肝移植：將供體肝取出并置于原位，對(duì)位置進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，7-0預(yù)置縫線連續(xù)縫合然后開房等到肝上下腔靜脈，各葉輕撥復(fù)位，避免肝葉充盈不均或者出現(xiàn)瘀血，無肝期結(jié)束。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 病理學(xué)觀察 取大鼠右前葉肝組織，使用10%多聚甲醛進(jìn)行固定，24～48 h后進(jìn)行脫水、透明與包埋切片，進(jìn)行HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察[7]。

1.4.2 血清IL-10和IFN-γ含量檢測(cè) 從下腔靜脈無菌采集2 mL血樣，將血清分離，使用ELISA試劑盒檢測(cè)，操作按照試劑盒說明進(jìn)行[8]。

1.4.3 移植肝臟IL-10和IFN-γ基因表達(dá)檢測(cè) 提取肝組織mRNA，采用RT-PCT技術(shù)對(duì)大鼠白細(xì)胞介素10（IL-10）和γ干擾素基因（IFN-γ）表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，β-actin為內(nèi)參照基因，采用凝膠成像系統(tǒng)照相，采用Bio-Image分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量測(cè)定，計(jì)算目的條帶吸光度/內(nèi)參區(qū)帶比值，為目的mRNA相對(duì)含量[9]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用 字2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 術(shù)后病理檢測(cè)結(jié)果比較 同系移植組10只大鼠肝臟細(xì)胞有輕度變性濁腫，組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)輕度缺血再灌注損傷，血竇輕度充血擴(kuò)張，膽管上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，肝小葉結(jié)構(gòu)基本正常。同種異體移植組肝細(xì)胞變性嚴(yán)重，壞死肝細(xì)胞多，血竇出現(xiàn)顯著充血擴(kuò)張，可見匯管區(qū)、中央靜脈周圍以淋巴細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，累及肝實(shí)質(zhì)，膽管有明顯炎癥，膽管上皮細(xì)胞有胞漿空泡變性、甚至脫落、消失，肝小葉結(jié)構(gòu)嚴(yán)重紊亂。

2.2 各組血清IL-10和IFN-γ含量比較 同系移植組血清IL-10含量最高，顯著高于同種異體移植組與對(duì)照組（P<0.05）；同種異體移植組IFN-γ含量最高，顯著高于同系移植組與對(duì)照組（P<0.05）。見表1。

2.3 移植肝臟IL-10和IFN-γ基因表達(dá)檢測(cè)結(jié)果 同系移植組肝臟IL-10 mRNA表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組與同種異體移植組（P<0.05），同種異體移植組IFN-γmRNA表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組與同系移植組（P<0.05），見圖1。

3 討論

現(xiàn)階段，在肝移植術(shù)后移植物喪失功能的主要原因在于肝移植排斥反應(yīng)[10]。肝移植手術(shù)患者術(shù)后約有65%在1年內(nèi)發(fā)生急性排斥反應(yīng)，出現(xiàn)慢性排斥或者不可逆損傷[11]。急性排斥多發(fā)生在肝移植術(shù)后數(shù)天到數(shù)月，其中發(fā)生在1個(gè)月的比例占到了80%～90%[12]。排斥反應(yīng)涉及到免疫調(diào)節(jié)因子與效應(yīng)細(xì)胞，是機(jī)體內(nèi)部諸多細(xì)胞共同作用的結(jié)果[13]。排斥反應(yīng)以局部組織炎癥為主，表現(xiàn)為炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、缺血再灌注損傷、促炎因子出現(xiàn)聚集、實(shí)質(zhì)細(xì)胞壞死等[14]。盡管臨床上運(yùn)用多種手段來抑制排斥反應(yīng)的發(fā)生，如供體特異性抗原輸注、免疫抑制劑以及供刺激分子阻斷等，但是肝移植排斥反應(yīng)的發(fā)生率仍較高[15-16]。

移植肝活檢組織病理學(xué)得到了廣泛地應(yīng)用，是當(dāng)前用于診斷肝移植術(shù)排斥反應(yīng)最可靠的方法，但是對(duì)移植肝會(huì)造成一定損傷[17]。在免疫學(xué)與分子生物學(xué)的檢查技術(shù)的應(yīng)用發(fā)展下，分子生物學(xué)用于急性排斥反應(yīng)診斷得到應(yīng)用，國(guó)外已檢測(cè)到肝移植急性排斥中多種細(xì)胞因子的表達(dá)[18]，但結(jié)果不盡相同，存在較大的差別，對(duì)急性排斥反應(yīng)的診斷價(jià)值也并未確定。所以對(duì)無創(chuàng)性、特異性與敏感性較好的肝移植急性排斥反應(yīng)診斷方法進(jìn)行探索是非常重要的。

Th1/Th2型細(xì)胞因子的動(dòng)態(tài)平衡在免疫排斥/耐受中起著重要的調(diào)節(jié)作用。IFN-γ與IL-2由Th1型細(xì)胞所分泌，對(duì)同種抗原特異性細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞與遲發(fā)型超敏反應(yīng)具有促進(jìn)作用，進(jìn)而啟動(dòng)排斥反應(yīng)，IL-4與IL-10由Th2型細(xì)胞分泌，主要參與體液免疫，在移植耐受中起到了重要的作用。

IFN-γ對(duì)Th1細(xì)胞的分化具有促進(jìn)作用，同時(shí)抑制Th2型細(xì)胞的增殖與分化，誘導(dǎo)促炎因子分泌，誘發(fā)炎癥因子的各種效應(yīng)[19]。研究發(fā)現(xiàn)，IFN-γ對(duì)巨噬細(xì)胞進(jìn)入移植物具有誘導(dǎo)作用，激活巨噬細(xì)胞，增加CTL的活性，并上調(diào)移植物的MHC表達(dá)量，促使血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的黏附因子表達(dá)，對(duì)排斥反應(yīng)有促進(jìn)作用。通過本研究發(fā)現(xiàn)，同種異體移植組IFN-γ含量、IFN-γmRNA表達(dá)水平最高，強(qiáng)于同系移植組。

人類IL-10基因位于1號(hào)染色體，約195 kbp，包含有外顯子5個(gè)，IL-10受體基因啟動(dòng)子中有諸多的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，對(duì)其介導(dǎo)的免疫反應(yīng)具有影響。諸多研究證實(shí)，IL-10對(duì)排斥反應(yīng)具有抑制作用，主要機(jī)制在于對(duì)Th1型細(xì)胞的增殖、相應(yīng)細(xì)胞因子分泌具有抑制作用，包括抑制TH1型細(xì)胞分泌IL-12、IL-2、與IFN-γ；可抑制T淋巴細(xì)胞激活；抑制單核巨噬細(xì)胞活化等；抑制Th2型細(xì)胞產(chǎn)生IL-4、IL-5等。胡維昱等[9]對(duì)肝移植患者術(shù)后3個(gè)月內(nèi)的外周血與穿刺組織采用免疫組織化學(xué)法、酶聯(lián)免疫吸附法對(duì)IL-10表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)無排斥的患者表達(dá)量更高，發(fā)生急性排斥患者則表達(dá)量減少。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，同系移植組血清IL-10含量、IL-10表達(dá)水平最高，同種異體移植組與之相比更弱。研究結(jié)果與前者一致，認(rèn)為IL-10對(duì)排斥反應(yīng)有抑制作用、免疫耐受。但是也有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，IL-10對(duì)T淋巴細(xì)胞增強(qiáng)具有刺激作用，會(huì)增加移植物血管病，促進(jìn)排斥反應(yīng)發(fā)生[20]。因此IL-10表達(dá)對(duì)肝移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)的影響還有待進(jìn)一步的研究。

綜上所述，大鼠肝移植手術(shù)后發(fā)生排斥反應(yīng)與IL-10、IFN-γ表達(dá)具有相關(guān)性，兩者表達(dá)的變化可作為早期診斷肝移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)的診斷指標(biāo)，為臨床診斷提供依據(jù)。

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（收稿日期：2016-11-09） （本文編輯：程旭然）