探討人類白細胞B27檢測方法改良及應用價值

王新元 祝靚 許諾

摘要：目的 探討人類白細胞B27（HLA-B27）檢測方法的改進，及其實際應用的可靠性。方法 選擇2014年5月～2016年4月門診及住院患者379例，患者檢測人類白細胞B27應用原有方法及改進方法，進行對比試驗。記錄兩種方法檢測結(jié)果，將檢測結(jié)果分陰性組、陽性組和不確定組，共三組。對不確定結(jié)果由第三方權(quán)威檢測機構(gòu)加以確定。結(jié)果 兩組結(jié)果顯示，結(jié)果陰性組303例，方法學改進前后符合率100%。陽性組63例，方法改進前后符合率100%。不確定組13例，對此13例患者標本，再送至第三方權(quán)威檢測機構(gòu)加以確定。結(jié)果陽性6例，確定結(jié)果與方法改進后完全符合（6例/6例）。陰性7例，確定結(jié)果與改進方法學檢測結(jié)果符合6例，僅有1例不符合（7例/6例）。結(jié)論 人類白細胞B27檢測方法的改進，在實際工作中具有可操作性，檢測結(jié)果可靠性好、準確率高，有效提高了人類白細胞B27的臨床輔助診斷價值。

關(guān)鍵詞：人類白細胞B27；方法學；診斷價值

我們在人類白細胞B27檢測中，借助于聚合酶鏈反應技術(shù)[1]。引進的小型儀器及技術(shù)，投資較小、特異性高、分辨率高。適應的基層臨床診斷的需要。在實際引用技術(shù)中，我們進行的預試驗，反復論證方法學的科學性及準確性。經(jīng)過1年多的探索，我們進行了大量對比試驗，對于不確定結(jié)果送至第三方檢測機構(gòu)進行確定。探索出在人類白細胞B27（HLA-B27）中白細胞提取階段，就方法學改進，做了以下3點探索及體會。

1 方法學改進

1.1提純白細胞 DNA離心力改進 HLA-B27中DNA的提取是整個實驗成功與否的關(guān)鍵。我們使用不同離心力，反復實驗，得到最適合的離心力是3800 rpm/g，同樣達到的沉淀白細胞的目的。原來的推薦離心力是8000 rpm/g，在混勻白細胞時候，由于離心力偏高，凝集成塊的白細胞團塊，在進一步提純時，難以打散混勻。離心力在3800 rpm/g時，同樣可以達到沉淀白細胞的作用，而在下一步打散混勻白細胞團塊時，又能較快達到的混勻白細胞的目的。當離心力低于3800rpm/g時，沉淀白細胞的效果不佳。

1.2檢測管的改進 由原來連蓋式的按壓式離心管，改為非連蓋式的螺旋帽子帶墊圈EP管。連蓋式的離心管檢測時，由于混勻力度要求，連蓋開蓋時，經(jīng)常出現(xiàn)開蓋側(cè)漏現(xiàn)象，甚至脫蓋現(xiàn)象。造成檢測成分量減少、污染及試劑比例成分的改變。影響檢測結(jié)果，甚至檢測結(jié)果難以判斷。我們引進了螺旋式帽子帶墊圈的EP管，為無酶無熱原無菌椎形管，由于螺旋式帽子帶墊圈，防滲漏、防污染、防止了檢測成分的丟失，確保結(jié)果的可靠性。

1.3漩渦混勻器的改進 混勻效果直接關(guān)系到人類白細胞B27中DNA的提取的效果。我們使用原普通漩渦混勻器，主要是手持檢測管進行混勻，手感力度把握不準，混勻時間持續(xù)較長，影響了白細胞沉淀物的混勻效果。改用了插入式漩渦混勻器，可把檢測管插入振蕩孔內(nèi)，無需手持可長時間、力度均勻地充分混勻，達到實驗要求。

2 討論

2.1 HLA-B27是一種免疫抗原 HLA-B27抗原是一種免疫遺傳標志抗原，為顯性遺傳的。在免疫系統(tǒng)中主要負責細胞間的相互識別，誘導免疫反應和調(diào)節(jié)免疫應答。HLA-B27分子可以和一些自身肽鏈結(jié)合，形成免疫復合體在自身細胞膜上表達后，能被相應的CD8+T細胞識別，從而導致T細胞對自身靶細胞的殺傷，造成組織變性、器官受損。

2.2 HLA-B27臨床診斷價值 目前已知40多種疾病的發(fā)生被認為與人體特定的HLA表型有關(guān)有關(guān)。最典型的是HLA-B27與血清反應為陰性的關(guān)節(jié)炎疾病的強關(guān)聯(lián)性，主要是強直性脊椎炎（AS）、瑞特（Reiter's）綜合癥、反應性關(guān)節(jié)炎等。其發(fā)病率分別為90.2%、78.8%、70.2%。HLA-B27陽性的人顯示有很高的發(fā)病率[2-3]。AS是一種慢性免疫性疾病，病因到目前為止，尚未完全闡明。AS患者多見于青壯年男性，可導致脊柱強直、疼痛，嚴重者功能喪失，給患者及其家庭帶來沉重的負擔。多數(shù)有遺傳、感染、環(huán)境等也有較大相關(guān)性，尤其是遺傳因素。AS是常染色體顯性遺傳，家庭性是其重要特征。因此，對AS患者來說，進行HLA-B27的診斷能對患者在疑似強直性脊椎炎的確診有重要幫助，是目前對AS最主要、最有價值的診斷指標。同時，對骨關(guān)節(jié)有關(guān)患者疾病也具有的一定的診斷及鑒別診斷價值。

2.3 HLA-B27檢測方法 目前實驗室檢測HLA-B27方法主要有微量細胞毒法、酶聯(lián)免疫吸附法、流式細胞儀法等。微量細胞毒法使用設(shè)備簡單，但敏感性較差；酶聯(lián)免疫吸附法因抗體效價問題，使其結(jié)果重復性不高；流式細胞儀法是目前普遍使用的方法，全自動流式細胞儀[5]，敏感性高，損傷簡便，但其高昂的投入，更適合在大型綜合性醫(yī)院。對于普通的醫(yī)院，我們找到與之相適應的檢測方法，服務和方便廣大患者。我們引進了經(jīng)典的白細胞提取，聚合酶鏈反應（PCR），凝膠電泳技術(shù)，仍后在紫外成像儀上觀察條帶判斷結(jié)果的技術(shù)。

2.4方法學的可行性 隨著人們生活水平及健康意識的提高，人們更加關(guān)注的自己的身體是否健康。人類白細胞B-27主要人群是骨關(guān)節(jié)有關(guān)患者疾病的診斷及鑒別診斷。主要檢測人類是否患有強直性脊椎炎的主要指標[4]。其檢測在臨床上越來越普及，為此我們引進了多步法檢測HLA-B27。即經(jīng)典的白細胞提取，聚合酶鏈反應（PCR）[1]，凝膠電泳技術(shù)，仍后在紫外成像儀上觀察條帶判斷結(jié)果的技術(shù)。我們對379例患者人類白細胞B27進行檢測。應用原有方法及改進方法，進行對比試驗。總符合率高，僅有1例不符合。不符合原因可能與tap酶污染等影響因素有關(guān)。

2.5方法學的優(yōu)化 經(jīng)典檢測方法的優(yōu)勢是結(jié)果可靠準確，結(jié)果易于觀察。缺點是人為提取白細胞DNA，人為因素影響白細胞DNA提取的效果，每一個環(huán)節(jié)都至關(guān)重要。選擇近兩年來門診及住院患者379例，應用原有方法及改進方法，檢測HLA-B27，對檢測結(jié)果進行分組分析。分陰性組、陽性組和不確定組，共三組。結(jié)果陰性組及陽性組363例，方法學改進前后符合率100%。不確定組13例，經(jīng)第三方權(quán)威檢測機構(gòu)加以確定。僅有一例不符合。通過實驗結(jié)果的分析比對，方法學的改良，保證了人類白細胞B-27抗原中DNA的提取效果這個關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。確保了人類白細胞B-27的純度及含量，為PCR擴增提供前提條件，有效提高了人類白細胞B27試驗結(jié)果的準確性。為臨床醫(yī)生提供更加準確、可靠的檢測結(jié)果，進一步提高HLA B27了臨床輔助診斷價值的可信度。

參考文獻：

[1]WANG Ping-jion，SUN Ling-di，MEI Chuan-zhong，et al.Application of PCR-SBT method in HLA-B27detection in AS Patlents[J].Chin J Lab Diagn，November，2015，19：1898-1890.

[2]托婭，張軍力.內(nèi)蒙古地區(qū)疑似強直性脊柱炎患者HLA-B27抗原陽性率觀察[J].分子診斷與治療雜志，2013（05）.

[3]楊霄鵬，惠玲.人類白細胞抗原B27的實驗室診斷[J].分子診斷與治療雜志，2015，7（4）：276-280.

[4]林蔚，肖平，吳祖常.HLA-B2抗原檢測在強直性脊柱炎診斷中的意義[J].國標檢驗醫(yī)學雜志，2015，36，（2）：371-372.

[5]沈靜，張肖，瑜剛，等.SSP-PCR法與流式細胞檢測HLA-B27的相關(guān)性比較[J].國際檢驗醫(yī)學雜志，2014，35（1）：70.

編輯/周蕓霏