多組織陽性對照蠟塊的制作及應(yīng)用

馬曉菁

摘要：目的 建立多組織對照，使免疫組化染色陽性對照獲取更方便，結(jié)果更可靠。方法 選擇正常的闌尾、扁桃體、胰腺、肝臟組織制作成石蠟塊，然后選擇4～6 mm直徑的空心管在組織塊上打孔，分別包埋于一個(gè)蠟塊中建立多組織對照蠟塊。預(yù)先切取對照片干燥后保存?zhèn)溆?，常?guī)免疫組化染色。結(jié)果 染色后不同組織呈不同分布或表達(dá)，且對照組織中至少有一個(gè)組織顯示陽性。結(jié)論 此多組織對照蠟塊可用于常見的多種抗體的對照，相比于不設(shè)置對照，結(jié)果更可靠；相比于單組織對照和組織芯片，也更為方便實(shí)用。

關(guān)鍵詞：免疫組化；質(zhì)量控制；陽性對照；多組織對照

根據(jù)免疫組化技術(shù)的特點(diǎn)，在染色過程中設(shè)立對照是進(jìn)行染色質(zhì)量控制的重要措施之一，Dr.Hector Battifora首次提出免疫組化的多組織對照的概念，經(jīng)過多次改良和優(yōu)化，形成多組織對照蠟塊（Multi-tissue control blocks）[1-4]。經(jīng)過多次嘗試單組織陽性對照蠟塊、組織芯片和多組織對照蠟塊，發(fā)現(xiàn)多組織對照蠟塊具有結(jié)果可靠、使用方便等優(yōu)點(diǎn)?，F(xiàn)將最常用的闌尾、扁桃體、胰腺、肝臟組織制作成多組織對照蠟塊，下文將詳細(xì)介紹制作過程和陽性對照設(shè)計(jì)。

1 資料與方法

1.1材料 選取本科室手術(shù)標(biāo)本中的正常闌尾、扁桃體、胰腺、肝臟組織進(jìn)行常規(guī)的取材，脫水浸蠟和包埋制成蠟塊。

1.2多組織對照蠟塊的制作 選取4～6 mm直徑的空心管在已經(jīng)制作好的蠟塊上打孔，存放于離心管里備用。然后將上述四類組織組織按順序放入預(yù)熱的蠟塊模具，組織面朝下緊貼并黏附于模具，使四塊組織位于同一平面，然后灌注蠟，加上塑料包埋盒，再將模具置于加熱臺上，使組織與蠟融合，最后置于冷卻臺，冷卻后取出蠟塊即可。

1.3多組織對照蠟塊的使用 蠟塊制作完成后按常規(guī)連續(xù)切片，厚度3～4 μm，裱貼于正離子玻片靠近標(biāo)簽的一端，干燥后可以疊放在一起，需要時(shí)隨時(shí)取用。若需長時(shí)間保存可烤片后放入4℃冰箱。常規(guī)免疫組化染色時(shí)，就將檢測組織裱在對照組織的旁邊，然后同時(shí)進(jìn)行烤片、脫蠟以及免疫組化染色。

1.4免疫組化染色方法 選用全自動的Ventana Benchmark XT免疫組化染色儀，整張玻片都能覆蓋，也可用于手工染色，同時(shí)滴加抗體。

1.5陽性結(jié)果的判斷和設(shè)計(jì) 介紹部分廣泛使用的抗體在闌尾、扁桃體、胰腺、肝臟中的表達(dá)，見表1。

2 結(jié)果

陽性對照染色理想，不同抗體在不同組織中具有不同的染色強(qiáng)度和定位，即使同一組織也有強(qiáng)弱不同的表達(dá)，體現(xiàn)了組織抗原含量的變化，且四個(gè)位點(diǎn)至少有一個(gè)位點(diǎn)呈現(xiàn)陽性反應(yīng)，其余組織則可作為陰性對照。且由于是在同一張玻片上染色，便于讀片醫(yī)生可以做出更為可靠的判斷。

3 討論

3.1單組織陽性對照蠟塊制作簡單，雖然組織獲取方便，但由于標(biāo)記覆蓋面不夠廣，往往需要準(zhǔn)備大量用于各種標(biāo)記類型的組織蠟塊，且單組織陽性對照蠟塊通常是使用已知抗原表達(dá)較強(qiáng)的組織，相對于抗原表達(dá)較弱的檢測組織就容易產(chǎn)生假陰性的結(jié)果。且陽性對照的設(shè)置必須考慮免疫組化染色的檢測下限（1ow limitofdetection，LLOD）[7]，LLOD是指在已知的可低表達(dá)某一抗原蛋白的組織或細(xì)胞成分中觀察的陽性反應(yīng)，所以多組織蠟塊可以很好的避免判斷為假陰性的風(fēng)險(xiǎn)。所以位于紐約羅切斯特大學(xué)醫(yī)學(xué)中心的生物染色委員會（The biological Stain commission.University of Rochester Medical Center， Rochester，NY）和很多專家建議使用低表達(dá)的對照組織以保證染色系統(tǒng)足夠的靈敏度檢測低抗原水平的組織和減少假陰性結(jié)果產(chǎn)生的風(fēng)險(xiǎn)[8-10]。當(dāng)然，最理想的是使用細(xì)胞蠟塊和多肽類陽性對照，但前期成本昂貴，制作繁瑣[11]，可以作為下一步研究的方向。多組織對照標(biāo)記覆蓋面廣，闌尾、扁桃體、胰腺、肝臟四種組織的對照能覆蓋100余種抗體，且取材也非常方便。同一種抗體在不同的組織中有不同的表達(dá)，以此可以減少假陽性的風(fēng)險(xiǎn)。

3.2雖然組織芯片抗體覆蓋面最廣，且高通量的特點(diǎn)也使檢測的準(zhǔn)確性更高，同時(shí)更為節(jié)約組織[12-13]，但組織芯片操作太過繁瑣，對制作過程要求高，包埋容易形成空泡，且由于組織量太小，細(xì)胞數(shù)量少，大量連續(xù)切片陽性率不穩(wěn)定，同一平面經(jīng)常無法切全，而如果使用專業(yè)設(shè)備制作組織芯片又加大了工作成本，不利于日常操作。多組織對照蠟塊克服了組織芯片組織量太少的不足，操作成本及便利性提高，按常規(guī)制作包埋就可取得理想的效果。

3.3多組織對照蠟塊一般選擇四個(gè)對照組織，兼顧抗體覆蓋面和實(shí)際操作，更為方便?？梢詫Υ罅繕?biāo)記進(jìn)行檢測，組織獲取方便，制作工具和方法也十分簡便，且與待檢組織于同張玻片上同時(shí)檢測，達(dá)到了實(shí)驗(yàn)條件的一致性，保證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和科學(xué)性，多組織蠟塊可以很好的避免判斷為假陰性的風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)也較好地達(dá)到了對免疫組化進(jìn)行質(zhì)控的目的。

3.4根據(jù)抗體表達(dá)強(qiáng)度的差異，如 CD34在骨髓造血干細(xì)胞得表達(dá)量很大，而對于皮膚腫瘤來說，僅隆突性皮膚纖維肉瘤可表現(xiàn) CD34強(qiáng)陽性染色，而在其他類型的皮膚腫瘤中 CD34表達(dá)較弱。因此可根據(jù)該類疾病的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)專門用于一類疾病的多組織蠟塊，該方法可對疾病的診斷和分類有較大的指導(dǎo)意義。此外對于需要定量分析的抗體，如臨床上 HER-2免疫組化染色，多組織陽性對照能提供能代表“0-3+”染色結(jié)果的信息使其判讀更為精確標(biāo)準(zhǔn)。

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編輯/翟辰萬