HPLC-ESI-LTQ-Orbitrap分析芪歸銀方中黃酮成分體內(nèi)代謝過(guò)程

于小杰，岳貴娟，薛 夢(mèng)，張 嬌，劉明玉，梁莉靖，劉 湉，馬 群

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102；2.秦皇島市第一醫(yī)院藥學(xué)部，河北 秦皇島 066000)

HPLC-ESI-LTQ-Orbitrap分析芪歸銀方中黃酮成分體內(nèi)代謝過(guò)程

于小杰1,2，岳貴娟1，薛 夢(mèng)1，張 嬌1，劉明玉1，
梁莉靖1，劉 湉1，馬 群1

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102；2.秦皇島市第一醫(yī)院藥學(xué)部，河北 秦皇島 066000)

為進(jìn)一步明確芪歸銀方的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，采用HPLC-ESI-LTQ-Orbitrap技術(shù)對(duì)大鼠灌胃芪歸銀方后血清中黃酮類活性成分進(jìn)行表征，并通過(guò)鑒別其尿液及糞便中的代謝物對(duì)結(jié)果進(jìn)行佐證。從含藥血清中鑒定出8個(gè)黃酮類化合物，其中，芹菜素-6,8-二葡萄糖苷和芹菜素以原型入血，芒柄花素、木犀草素、毛蕊異黃酮、5,7,4′-三羥基黃酮醇-7-O-β-D-葡萄糖苷、木犀草素-7-O-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-葡萄糖苷等6個(gè)化合物以Ⅱ相代謝產(chǎn)物入血；從尿液中鑒定出9個(gè)黃酮類成分，包括6個(gè)入血成分的相應(yīng)代謝產(chǎn)物；從糞便中檢出3個(gè)黃酮類化合物的原型形式，未檢測(cè)到與入血成分相同的成分。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，芪歸銀方中的黃酮類入血成分大部分是經(jīng)腎臟代謝排出，這可為闡明芪歸銀方延緩耐藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供依據(jù)。

芪歸銀方；黃酮類成分；代謝過(guò)程；HPLC-ESI-LTQ-Orbitrap

隨著抗生素的廣泛及不合理應(yīng)用，耐藥菌感染形勢(shì)日趨嚴(yán)峻，現(xiàn)已成為嚴(yán)重危害人類健康的重要公共衛(wèi)生問(wèn)題?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)單憑抗生素的不斷升級(jí)、多藥聯(lián)用等手段，已不能很好地控制耐藥菌感染[1]。目前，許多中藥或其復(fù)方的抗菌作用已被醫(yī)學(xué)界所認(rèn)可。中藥或其復(fù)方的抗菌作用不是單一的抑制或殺滅細(xì)菌，而是通過(guò)抗菌、免疫調(diào)節(jié)、消除細(xì)菌耐藥性等途徑形成多方位組合作用[2]，在抗感染治療上有著一定的優(yōu)勢(shì)。在應(yīng)用抗生素的基礎(chǔ)上聯(lián)合應(yīng)用中藥，不僅可達(dá)到協(xié)同抗菌的效果，還有延緩或者逆轉(zhuǎn)細(xì)菌耐藥性的作用[3-5]。

本課題組基于中醫(yī)對(duì)感染性疾病的認(rèn)識(shí)，并結(jié)合多年臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，開發(fā)了由黃芪、金銀花、當(dāng)歸、青篙、虎杖5味中藥組成的芪歸銀方，該方具有益氣補(bǔ)血扶正、解表透邪外出、清氣血解熱毒的功效，可延緩銅綠假單胞菌耐藥，并與頭孢他啶、亞胺培南等抗生素有協(xié)同抗菌作用，在治療耐藥菌感染方面取得了良好效果[6-10]。但該復(fù)方的化學(xué)成分復(fù)雜，很難確定其通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)、多途徑發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)，這嚴(yán)重限制了其進(jìn)一步開發(fā)和臨床應(yīng)用。本課題組在前期研究[11]中采用LC/MS技術(shù)對(duì)芪歸銀方中的化學(xué)成分進(jìn)行了分析，共鑒定出59種化合物，其中黃酮類化合物有28個(gè)。據(jù)此推測(cè)黃酮類成分可能是芪歸銀方治療耐藥菌感染的主要成分之一。

本實(shí)驗(yàn)擬采用HPLC-ESI-LTQ-Orbitrap技術(shù)分析鑒定大鼠灌胃芪歸銀方后，其血清中的黃酮類成分及其代謝產(chǎn)物，通過(guò)分析尿液及糞便中的代謝物，推測(cè)其代謝途徑，希望為進(jìn)一步闡明芪歸銀方抗菌、抗感染的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent Zorbax SB-C18色譜柱(4.6 mm×150 mm×5 μm)：美國(guó)Agilent公司產(chǎn)品；KH-250型速控超聲波清洗器：昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司產(chǎn)品；旋渦混合儀(XW-80A)：海門市其林貝爾儀器制造有限公司產(chǎn)品；超速離心機(jī)(Sartorius1-14)：美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；LC-20AT高效液相色譜儀：日本島津公司產(chǎn)品，配有LC-20AT溶劑輸液泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、SPD-M20A檢測(cè)器、柱溫箱、LC-solution色譜工作站；HPLC-ESI-LTQ-Orbitrap：美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品，配有四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、離子阱-軌道阱質(zhì)量分析器、ThermoXcaliber2.1工作站。

SD大鼠：由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供；甲醇、甲酸、乙酸乙酯：分析純，北京化工廠產(chǎn)品；屈臣氏蒸餾水：廣州屈臣氏食品飲料有限公司產(chǎn)品；乙腈：色譜純，美國(guó)Fisher公司產(chǎn)品。

1.2 血清樣品的制備及代謝物的收集

SD大鼠常規(guī)飼養(yǎng)一周后，隨機(jī)分為空白組和給藥組，每組8只。給藥組大鼠以芪歸銀提取物灌胃(含生藥8 g/mL)，每次2 mL，每日2次，共給藥3天；空白組大鼠以0.9%生理鹽水灌胃，灌胃次數(shù)和鹽水體積與給藥組相同，末次灌胃前12 h禁食不禁水，末次灌胃1 h后從腹主動(dòng)脈采血。將不同組別血液于4 ℃以2 500 r/min離心25 min，取上清液，將各組大鼠血清混合后再次離心，收集不同組別血清，于-80 ℃保存，備用。

分別收集不同組別大鼠末次給藥前12 h內(nèi)的尿液和糞便，其中，尿液以2 500 r/min離心25 min后，取上清液，備用；糞便經(jīng)干燥后保存，備用。

1.3 樣品前處理

血清樣品預(yù)處理：取200 μL含藥血清和空白血清，分別加入600 μL乙腈，渦旋振蕩3 min，以14 300 r/min離心30 min，靜置后取上清液，氮?dú)獯抵?0 μL，轉(zhuǎn)移至內(nèi)套管中，備用。

尿液樣品預(yù)處理：分別取10 mL不同組別大鼠尿液，蒸干后加入適量甲醇，超聲溶解，離心后取上清液，蒸干，加入100 μL甲醇溶解，離心，收集上清液，備用。

糞便樣品預(yù)處理：分別取100 mg不同組別大鼠糞便，研磨后加入20 mL甲醇超聲溶解，過(guò)濾后收集濾液，減壓蒸干，然后加入1 mL甲醇超聲溶解，離心，收集上清液，蒸干，再加入100 μL甲醇溶解，離心后收集上清液，備用。

1.4 分析方法

1.4.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18柱(4.6 mm×150 mm×5 μm)；柱溫：30 ℃；流速：0.8 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm；流動(dòng)相：A為乙腈，B為0.1%甲酸水溶液；梯度洗脫程序：0～15 min(2%～3%A)，15～22 min(3%～17%A)，22～32 min(17%～18%A)，32～42 min(18%～25%A)，42～52 min(25%～32%A)，52～60 min(32%～63%A)，60～65 min(63%～100%A)。

1.4.2 色譜條件 電噴霧(ESI)離子源，正、負(fù)離子模式；霧化電壓：正離子模式4.0 kV，負(fù)離子模式3.0 kV；鞘氣流速：30 arb；毛細(xì)管溫度：350 ℃；毛細(xì)管電壓：25 V；霧化室溫度：300 ℃；管透鏡電壓：-110 V；質(zhì)量掃描范圍：m/z100～1 200。

2 結(jié)果與討論

2.1 化學(xué)成分識(shí)別

分別對(duì)血清樣品、尿液樣品、糞便樣品進(jìn)行檢測(cè)，得到不同組別各樣品的色譜圖，示于圖1～3。通過(guò)對(duì)譜圖中化學(xué)成分的色譜保留時(shí)間、精確分子質(zhì)量、多級(jí)碎片離子等信息的解析，并結(jié)合文獻(xiàn)[11-12]中已鑒定出的芪歸銀提取物中的化學(xué)成分，對(duì)含藥血清、尿液、糞便中的芪歸銀化學(xué)成分進(jìn)行鑒定，結(jié)果列于表1～3。

圖1 空白組(a)和給藥組(b)含藥血清的總離子流色譜圖Fig.1 TIC of the blank group (a) and drug group (b) of medicated serum

圖2 空白組(a)和給藥組(b)尿液的總離子流色譜圖Fig.2 TIC of the blank group (a) and drug group (b) of urine

圖3 空白組(a)和給藥組(b)糞便的總離子流色譜圖 Fig.3 TIC of the blank group (a) and drug group (b) of feces

從含藥血清中共鑒定出8個(gè)黃酮類化合物，分別為芒柄花素、芹菜素-6,8-二葡萄糖苷、木犀草素、毛蕊異黃酮、5,7,4′-三羥基黃酮醇-7-O-β-D-葡萄糖苷、木犀草素-7-O-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-葡萄糖苷和芹菜素。

從尿液中共鑒定出9個(gè)黃酮類化合物，分別為芒柄花素、芹菜素-6,8-二葡萄糖苷、毛蕊異黃酮、木犀草素-7-O-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-葡萄糖苷、芹菜素、芹菜素-6-葡萄糖基-8-阿拉伯糖苷、芹菜素-6-戊烯氧基-8-葡萄糖苷、芹菜素-6-葡萄糖苷-8-戊烯氧基。

從糞便中共鑒定出3個(gè)黃酮類化合物，分別為芹菜素-6-葡萄糖基-8-阿拉伯糖苷、芹菜素-6-戊烯氧基-8-葡萄糖苷和蘆丁。

表3 糞便中黃酮類化合物的質(zhì)譜信息Table 3 Mass spectrometry information of flavonoids in feces

2.2 代謝途徑推測(cè)

分析對(duì)比含藥血清、尿液及糞便中的芪歸銀化學(xué)成分，對(duì)其中6種入血成分可能的代謝途徑進(jìn)行推斷。

芒柄花素：在血清質(zhì)譜圖中，t=18.55 min時(shí)，檢測(cè)到m/z443分子離子峰；在尿液質(zhì)譜圖

中，t=57.69 min時(shí)，檢測(cè)到m/z267分子離子峰。結(jié)合多級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，推測(cè)可能為芒柄花素與葡萄糖醛酸結(jié)合后以Ⅱ相代謝產(chǎn)物的形式入血。由于其極性增大，保留時(shí)間縮短，因此經(jīng)體內(nèi)代謝后，以原型的形式經(jīng)尿液排出體外[13-15]，其代謝途徑示于圖4。

注：a.芪歸銀提取物；b.含藥血清：c.尿液圖4 芒柄花素的代謝途徑Fig.4 Metabolic pathway of formononetin

芹菜素-6,8-二葡萄糖苷：在血清質(zhì)譜圖中，t=21.93 min時(shí)，檢測(cè)到m/z593分子離子峰；在尿液質(zhì)譜圖中，t=21.93 min時(shí)，檢測(cè)到m/z593分子離子峰。結(jié)合多級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，推測(cè)可能為芹菜素-6,8-二葡萄糖苷以原型的形式入血，經(jīng)體內(nèi)代謝，以原型的形式經(jīng)尿液排出體外[16]，其代謝途徑示于圖5。

毛蕊異黃酮：在血清質(zhì)譜圖中，t=24.61 min時(shí)，檢測(cè)到m/z459分子離子峰；在尿液質(zhì)譜圖中，t=24.79 min時(shí)，檢測(cè)到m/z283分子離子峰。結(jié)合多級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，推測(cè)可能為毛蕊異黃酮以葡萄糖醛酸結(jié)合物的形式入血，極性增大，保留時(shí)間縮短，經(jīng)過(guò)一系列代謝過(guò)程后，以原型的形式經(jīng)尿液排出體外[14-15]，其代謝途徑示于圖6。

木犀草素-7-O-葡萄糖苷：在血清質(zhì)譜圖中，t=37.37 min時(shí)，檢測(cè)到m/z461分子離子峰；在尿液質(zhì)譜圖中，t=27.35 min時(shí)，檢測(cè)到m/z447分子離子峰。結(jié)合多級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，推測(cè)可能為木犀草素-7-O-葡萄糖苷與甲基結(jié)合后以Ⅱ相代謝產(chǎn)物的形式入血，經(jīng)體內(nèi)代謝，以原型的形式經(jīng)尿液排出體外[16-17]，其代謝途徑示于圖7。

注：a.芪歸銀提取物；b.含藥血清：c.尿液圖5 芹菜素-6,8-二葡萄糖苷的代謝途徑Fig.5 Metabolic pathway of apigenin-6,8-di-C-glu

注：a.芪歸銀提取物；b.含藥血清：c.尿液圖6 毛蕊異黃酮的代謝途徑Fig.6 Metabolic pathway of calycosin

山奈酚-3-O-葡萄糖苷：在血清質(zhì)譜圖中，t=38.45 min時(shí)，檢測(cè)到m/z461分子離子峰；在尿液質(zhì)譜圖中，t=22.07 min時(shí)，檢測(cè)到m/z463分子離子峰。結(jié)合多級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，推測(cè)可能為山奈酚-3-O-葡萄糖苷以與甲基結(jié)合后以Ⅱ相代謝產(chǎn)物的形式入血，經(jīng)體內(nèi)代謝，以羥基結(jié)合物的形式排出體外[18]，其代謝途徑示于圖8。

芹菜素：在血清質(zhì)譜圖中，t=43.36 min時(shí)，檢測(cè)到m/z269分子離子峰；在尿液質(zhì)譜圖中，t=43.51 min時(shí)，檢測(cè)到m/z269分子離子峰。結(jié)合多級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，推測(cè)可能為芹菜素以原型入血，經(jīng)體內(nèi)代謝后，以原型的形式經(jīng)尿液排出體外[16]，其代謝途徑示于圖9。

血清中檢測(cè)到的木犀草素和5,7,4′-三羥基黃酮醇-7-O-β-D-葡萄糖苷，在尿液及糞便中均未檢測(cè)到其原型及可能的代謝產(chǎn)物，這可能因?yàn)樵摶衔镌诖x過(guò)程中水解為小分子化合物，或經(jīng)其他代謝途徑排出。

注：a.芪歸銀提取物；b.含藥血清：c.尿液圖7 木犀草素-7-O-葡萄糖苷代謝途徑Fig.7 Metabolic pathway of luteolin-7-O-glucoside

3 結(jié)論

中藥成分復(fù)雜多樣，很難確定其通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)、多途徑發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)。一般認(rèn)為，以適當(dāng)途徑給藥后，中藥在體內(nèi)經(jīng)過(guò)吸收、分布、代謝等過(guò)程，最終入血成分才可能是其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。因此，分析給藥后的入血成分及其代謝產(chǎn)物，尋找成分間的相互作用規(guī)律，可以為藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供依據(jù)。

本工作采用HPLC-ESI-LTQ-Orbitrap技術(shù)對(duì)芪歸銀含藥血清中的黃酮成分進(jìn)行表征，通過(guò)尿液及糞便中的代謝產(chǎn)物進(jìn)行入血成分的代謝途徑推測(cè)。從含藥血清中鑒定出8個(gè)黃酮類化合物，其中芒柄花素、毛蕊異黃酮、木犀草素-7-O-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-葡萄糖苷以Ⅱ相代謝產(chǎn)物的形式入血，芹菜素-6,8-二葡萄糖苷和芹菜素以原型入血，這6個(gè)入血成分經(jīng)體內(nèi)代謝，最終經(jīng)尿液排出。含藥血清中檢測(cè)到的木犀草素和5,7,4′-三羥基黃酮醇-7-O-β-D-葡萄糖苷，在尿液及糞便中均未檢測(cè)到其原型及可能的代謝產(chǎn)物，推測(cè)其在代謝過(guò)程中可能水解為小分子化合物或經(jīng)其他代謝途徑排出。通過(guò)對(duì)芪歸銀方中黃酮類成分的體內(nèi)代謝過(guò)程進(jìn)行較為系統(tǒng)的分析，發(fā)現(xiàn)芪歸銀方中黃酮類入血成分大部分是經(jīng)腎臟代謝排出，這可為闡明芪歸銀方延緩耐藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供依據(jù)。

注：a.芪歸銀提取物；b.含藥血清：c.尿液圖8 山奈酚-3-O-葡萄糖苷代謝途徑Fig.8 Metabolic pathway of kaempferol-3-O-glrcoside

注：a.芪歸銀提取物；b.含藥血清：c.尿液圖9 芹菜素的代謝途徑Fig.9 Metabolic pathway of apigenin

[1] 劉清泉，孔令博，高潔，等. 扶正透邪法干預(yù)多重耐藥菌株感染的理論及實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中國(guó)醫(yī)院用藥評(píng)價(jià)與分析，2011，11(9):773-774.

LIU Qingquan, KONG Lingbo, GAO Jie, et al. Theoretical and experimental study on the reatment principle of Fuzheng Quxie for multiple drug-resistant infection[J]. Evaluation and Analysis of Drug-use in Hospitals of China, 2011, 11(9): 773-774(in Chinese).

[2] 李睿明，雷朝霞. 細(xì)菌耐藥性對(duì)抗策略——中藥延緩、逆轉(zhuǎn)細(xì)菌耐藥性,治療耐藥細(xì)菌感染的研究[J]. 醫(yī)學(xué)與哲學(xué):臨床決策論壇版，2006:45-47.

LI Ruiming, LEI Chaoxia. Tactics for prewtion of bacterad resistance:research on theeffcts of Chineses traditional medicine to delay and counter of bacterial resistance,and bacterial infection therapy[J]. Medicine and Philosophy, 2006: 45-47(in Chinese).

[3] 程嘉藝，柴紀(jì)嚴(yán)，柴瑞華. 扶正顆粒抗菌作用的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中醫(yī)研究,2008,21(1):22-25.

CHENG Jiayi, CHAI Jiyan, CHAI Ruihua. Experimental study on the antibacterial effect of Fuzheng granule[J]. Traditional Chinese Medicinal Research, 2008, 21(1): 22-25(in Chinese).

[4] 曹穎. 雙黃連及清開靈對(duì)產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌抑菌作用的研究[D]. 北京：北京中醫(yī)藥大學(xué)，2011.

[5] 朱小明，楊家卿，張昌峰，等. 黃連解毒湯抗銅綠假單胞菌生物被膜及與阿奇霉素協(xié)同抗菌作用[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18(11):155-158.

ZHU Xiaoming, YANG Jiaqing, ZHANG Chang-feng, et al. The in vitro effects of Huanglian jiedu decoction against pseudomonas aeruginosa biofilms and its synergism with azithromycin on planktonic pseudomonas aeruginosa[J]. Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae, 2012, 18(11): 155-158(in Chinese).

[6] 孔令博，劉清泉，楊琦，等. 芪歸銀方對(duì)抗生素體外抑制多重耐藥銅綠假單胞菌作用的影響[J]. 世界中醫(yī)藥，2014，9(3):288-290.

KONG Lingbo,LIU Qingquan, YANG Qi, et al. Study on the effect of Qiguiyin decoction and antibiotics inhibiting multi-drug resistant pseudomonas aeruginosa in vitro[J]. World Chinses Medicine, 2014, 9(3):288-290(in Chinese).

[7] 高潔，劉清泉，田金洲，等. 芪歸銀方對(duì)耐亞胺培南銅綠假單胞菌耐藥作用的影響[J]. 中醫(yī)雜志，2012，53(16):1 408-1 411.

GAO Jie, LIU Qingquan, TIAN Jinzhou, et al. Effect of Qiguiyin formula on the imipenem-resisting pseudomonas aeruginosa[J]. Journal of Traditional Chinese Medicine, 2012, 53(16): 1 408-1 411(in Chinese).

[8] 孔令博，劉清泉，邱澤計(jì)，等. 扶正透邪方聯(lián)合抗生素體外干預(yù)多重耐藥銅綠假單胞菌研究[J]. 中國(guó)中醫(yī)急癥，2011，20(4):582-584.

KONG Lingbo, LIU Qingquan, QIU Zeji, et al. Study on the bacteriostasis of multidrug resistant pseudomonas aeruginosa by fuzhengtouxie decoction cooperating with antibiotics in vitro[J]. Journal of Emergency in Traditional Chinese Medicine, 2011, 20(4): 582-584(in Chinese).

[9] 孔令博，劉清泉，王蘭，等. 芪歸銀方對(duì)多重耐藥銅綠假單胞菌感染大鼠淋巴細(xì)胞增殖的影響[J]. 中醫(yī)雜志，2013，54(18):1 585-1 587.

KONG Lingbo, LIU Qingquan, WANG Lan, et al. Effect of Qiguiyin formula on the lymphocyte proliferation in rats with multidrug-resistant pseudomonas aeruginosa infection[J]. Journal of Traditional Chinese Medicine, 2013,54(18): 1 585-1 587(in Chinese).

[10]KONG L B, MA Q, GAO J, et al. Effect of Qiguiyin decoction, on multidrug-resistant pseu-domonas aeruginosa infection in rats[J]. Chinese Journal of Integrative Medicine, 2015, 21(12): 916-921.

[11]YU X, ZHANG J, LIU Q, et al. Chemical profiling of fifty constituents in Qi-gui-yin granule (QGY) by on-line high-performance liquid chromatography coupled with ESI-LTQ-Orbitrap mass spectrometer[J]. Research Journal of Chemistry & Environment, 2013, 17(11): 16-27.

[12]QIAO X. Characterization of phenolic compounds in the Chinese herbal drugArtemisiaannuaby liquid chromatography coupled to electrospray ionization mass spectrometry[J]. Journal of Pharmaceutical & Biomedical Analysis, 2008, 47(3): 516-525.

[13]王茜. 茵陳術(shù)附湯在大鼠體內(nèi)藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究[D]. 上海：上海中醫(yī)藥大學(xué),2013.

[14]姜鵬. 復(fù)肝方多成分在大鼠體內(nèi)藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究[D]. 上海：上海中醫(yī)藥大學(xué),2013.

[15]陳龍虎. 基于不同層次的復(fù)方鱉甲軟肝片藥效物質(zhì)辨識(shí)及相關(guān)問(wèn)題探討[D]. 成都：成都中醫(yī)藥大學(xué),2013.

[16]陳艷琰. 基于“十八反”的中藥配伍禁忌理論基礎(chǔ)研究——芫花-甘草配伍毒效表征與物質(zhì)基礎(chǔ)研究[D]. 南京：南京中醫(yī)藥大學(xué),2014.

[17]王媛. 木姜子枝葉化學(xué)成分及生物活性研究[D]. 西安：陜西科技大學(xué),2013.

[18]李淑嬌. 當(dāng)歸-紅花配伍協(xié)同增效作用與相關(guān)機(jī)制研究[D]. 南京：南京中醫(yī)藥大學(xué),2015.

Metabolic Processes of Flavonoids in Qi-gui-yingranule(QGY) Based on HPLC-ESI-LTQ-Orbitrap

YU Xiao-jie1,2, YUE Gui-juan1, XUE Meng1, ZHANG Jiao1,LIU Ming-yu1, LIANG Li-jing1, LIU Tian1, MA Qun1

(1.SchoolofChinesePharmacy,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100102,China;2.PharmaceuticalDepartment,FirstHospitalofQinhuangdao,Qinghuangdao066000,China)

With the extensive use of the antibiotics, especially abuse, the serious problem of bacterial resistance has happened commonly in clinic, and the multi-drug resistant pseudomonas aeruginosa infection has always been the focus and difficulty in clinical anti-infection treatment. After years of clinical trials, it is confirmed that some traditional Chinese medicine have significant antibacterial effect, and can delay or reverse drug-resistant in combination with antibiotics. Qi-gui-yin (QGY)，composing of five kinds of traditional Chinese medicine (Astragalus, Angelica Lonicera, Artemisia apiacea, Polygonum cuspidatum), is mainly used for the treatment of multi-drug resistant pseudomonas aeruginosa infection, and is certified to have significant synergistic antibacterial effect with imipenem and ceftazidime. Due to the complexity of chemical composition，pharmacodynamic material basis of QGY is not very clear. In order to futher clarify pharmacodynamic material basis of Qi-gui-yingranule(QGY), HPLC-ESI-LTQ-Orbitrap was used to investigate flavonoids constitutes in serum, urine and feces of rats. In previous studies, the chemical compositions of QGY were analyzed by LC-ESI-MS/MS. By comparing the retention time, accurate molecular weight and MS/MS fragmentation with standards and related literatures, 59 compounds were identified or tentatively characterized in QGY, including flavonoids, phenylpropanoid, anthraquinones, isoflavans, isoflavones, saponins and other compounds. Among them, there were 28 flavonoids with the most types, which suggested that the flavonoids were the major constituents of QGY, and would be the medicinal compositions in treatment of resistance bacterial infection. In this work, the metabolic processes of flavonoids in QGY were mainly studied. 8 flavonoids were identified from medicated serum. Among them, Apigenin-6,8-di-C-glu and Apigenin passed into blood with original structure, while the orther 6 compounds were phase Ⅱ metabolites (formononetin, calycosin, luteolin-7-O-glucoside, kaempferol-3-O-glrcoside, luteolin and 5,7,4′-trihydroxy-flavonol-7-O-β-D-glucopyranoside). 9 flavonoids were identified in urine, 3 compounds in feces. Among them, 6 serum compounds′metabolites were found in urine, including formononetin, calycosin, luteolin-7-O-glucoside, kaempferol-3-O-glrcoside, apigenin and apigenin-6,8-di-C-glu, but no one in feces. The prototype or metabolities of luteolin and 5,7,4′-trihydroxy-flavonol-7-O-β-D-glucopyranoside could not been found in urine and feces, which may be hydrolyzed into small molecular compound in the metabolic process or given off via other metabolic pathways. In this study, it can be found that most of the flavonoids constitutes in serum were excreted through kidney. In sum, the bioactive ingredients in QGY were elaborated preliminarily.

Qi-gui-yingranule(QGY); flavonoids; metabolic processes; HPLC-ESI-LTQ-Orbitrap

2016-07-11;

2016-12-08

科學(xué)技術(shù)部“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)(2013ZX09102026)資助

于小杰(1988—)，女(漢族)，碩士研究生，從事中藥新藥與質(zhì)量控制研究。E-mail: yuxiaojie213@163.com

馬 群(1971—)， 女(漢族)，研究員，從事中藥體內(nèi)過(guò)程分析及質(zhì)量控制研究。E-mali: maqun99@163.com

O657.63

A

1004-2997(2017)01-0116-11

10.7538/zpxb.2017.38.01.0116