UHPLC-Q-TOF MS和化學(xué)計(jì)量學(xué)方法分析川芎硫磺熏蒸前后化學(xué)成分的變化

蔡 皓，喬鳳仙，裴 科，段 煜，范愷磊，劉 曉，徐洋洋，汪小琦

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210023；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)家教育部中藥炮制規(guī)范化及標(biāo)準(zhǔn)化工程研究中心，江蘇 南京 210023；3.山西中醫(yī)藥大學(xué)制藥與食品工程學(xué)院，山西 太原 030024)

UHPLC-Q-TOF MS和化學(xué)計(jì)量學(xué)方法分析川芎硫磺熏蒸前后化學(xué)成分的變化

蔡 皓1,2，喬鳳仙1,2，裴 科3，段 煜1,2，范愷磊1,2，
劉 曉1,2，徐洋洋1,2，汪小琦1

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210023；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)家教育部中藥炮制規(guī)范化及標(biāo)準(zhǔn)化工程研究中心，江蘇 南京 210023；3.山西中醫(yī)藥大學(xué)制藥與食品工程學(xué)院，山西 太原 030024)

采用UHPLC-Q-TOF MS結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法分析川芎硫磺熏蒸前后化學(xué)成分的變化。選取19批未經(jīng)硫磺熏蒸川芎飲片、11批實(shí)驗(yàn)室自制硫磺熏蒸川芎飲片和9批市售硫磺熏蒸川芎飲片作為實(shí)驗(yàn)樣品，制備供試品溶液進(jìn)樣后，應(yīng)用PeakView1.2軟件依據(jù)一級(jí)質(zhì)譜的精確質(zhì)荷比和二級(jí)質(zhì)譜的碎片信息進(jìn)行成分解析，并結(jié)合MarkerView1.2.1軟件進(jìn)行主成分分析(PCA)和t檢驗(yàn)，鑒定其中的共有成分和差異性成分。結(jié)果表明，在PCA分析中，正負(fù)離子模式下的未硫熏和硫熏川芎樣品均可被明顯地區(qū)分開(kāi)，主成分之間存在明顯的差異；t檢驗(yàn)結(jié)果也顯示二者之間存在大量的差異性成分，同時(shí)鑒定出部分差異性成分，并進(jìn)一步推測(cè)了其可能的轉(zhuǎn)化方式。本實(shí)驗(yàn)可為研究硫磺熏蒸對(duì)川芎質(zhì)量的影響提供客觀參考，并為控制硫磺熏蒸在中藥材和飲片加工過(guò)程中的過(guò)度應(yīng)用和確保中醫(yī)臨床用藥的安全提供理論依據(jù)。

UHPLC-Q-TOF MS；化學(xué)計(jì)量學(xué)；川芎；硫磺熏蒸；t檢驗(yàn)；主成分分析(PCA)；成分轉(zhuǎn)化；差異性成分

川芎始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為傘形科植物川芎LigusticumchuanxiongHort.的干燥根莖，其性辛、溫，歸肝、膽和心包經(jīng)，具有活血行氣和祛風(fēng)止痛的功效[1]，臨床主要用于治療氣滯血瘀所導(dǎo)致的胸痹心痛、胸脅刺痛、跌撲腫痛、月經(jīng)不調(diào)、經(jīng)閉痛經(jīng)、癥瘕腹痛、頭痛和風(fēng)濕痹痛等，是中醫(yī)處方的常用中藥，也是眾多中成藥的重要原材料[2]。川芎的成分主要包括苯酞類、酚酸類和生物堿類等，其中苯酞類化合物具有明顯的舒張血管、改善微循環(huán)、抑制血小板聚集、拮抗動(dòng)脈粥樣硬化的形成以及抗實(shí)驗(yàn)性腦缺血等方面的藥理活性[3-4]，這與川芎活血行氣和祛風(fēng)止痛的傳統(tǒng)功效密切相關(guān)。

硫磺熏蒸是中藥材及飲片的傳統(tǒng)養(yǎng)護(hù)方法之一，可以達(dá)到殺菌、防蟲(chóng)和防霉的效果，有利于中藥材及飲片的保存。已有研究表明，中藥材及飲片經(jīng)過(guò)硫磺熏蒸后，性狀多有改變，且由于二氧化硫是一種強(qiáng)還原劑，可能與含有羥基和酮基等基團(tuán)的成分發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致有效成分含量的變化或化學(xué)結(jié)構(gòu)的改變[5-6]。川芎作為藥典規(guī)定的71種二氧化硫殘留量限度為150 mg/kg的中藥品種之一，對(duì)其硫磺熏蒸前后化學(xué)成分變化的分析和鑒定極具代表性和研究?jī)r(jià)值。

超高效液相色譜與飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用(ultra-high-performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight mass spectrometry, UHPLC-Q-TOF MS)是目前醫(yī)藥科研分析領(lǐng)域中應(yīng)用較好的定性分析技術(shù)，它同時(shí)具備高靈敏度和高分辨率的優(yōu)勢(shì)，二者的結(jié)合不僅可以使不同化學(xué)成分能夠更好地相互區(qū)分，并且能夠檢測(cè)到精確的質(zhì)荷比數(shù)據(jù)，獲得的信息較傳統(tǒng)方法更為豐富，在沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)的情況下也能獲得關(guān)于化合物結(jié)構(gòu)的重要提示，因此是目前分析中藥復(fù)雜系統(tǒng)的最有力工具之一[7-14]。本研究擬采用UHPLC-Q-TOF MS技術(shù)，以未硫熏川芎和硫熏川芎為研究對(duì)象，應(yīng)用PeakView1.2軟件對(duì)其質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行深入分析，并結(jié)合MarkerView1.2.1軟件，進(jìn)一步應(yīng)用主成分分析(principal component analysis, PCA)和t檢驗(yàn)等化學(xué)計(jì)量學(xué)方法，探討硫磺熏蒸對(duì)川芎中化學(xué)成分的影響，以期盡可能全面地從化學(xué)成分的角度闡明硫磺熏蒸對(duì)川芎質(zhì)量影響的科學(xué)內(nèi)涵，為臨床安全用藥提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜儀：日本Shimadzu公司產(chǎn)品，配有LC-30AD 二元液相泵，SIL-30SD自動(dòng)進(jìn)樣器，DGU-20A5R 在線脫氣機(jī)，CTO-30A柱溫箱；Triple TOF 5600+系統(tǒng)：美國(guó)AB Sciex公司產(chǎn)品，配有電噴霧離子源ESI；SPE固相萃取小柱：德國(guó)CNW公司產(chǎn)品；AG 285型電子天平：瑞士Mettler Toledo公司產(chǎn)品；Multi Reax全能型振蕩器：德國(guó)Heidolph公司產(chǎn)品；HH系列數(shù)顯恒溫水浴鍋：江蘇金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠產(chǎn)品；KQ-500型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；R-210型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：瑞士Buchi公司產(chǎn)品；TGL-16B型離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品；超純水制備儀：南京易普易達(dá)科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；Millipore超純水器：美國(guó)Millipore公司產(chǎn)品。

乙腈，甲醇：均為質(zhì)譜純，德國(guó)Merck公司產(chǎn)品；甲酸：質(zhì)譜純，德國(guó)CNW公司產(chǎn)品；實(shí)驗(yàn)用水：Millipore超純水；其余所用試劑均為色譜純。

1.2 飲片

川芎飲片收集于其道地產(chǎn)區(qū)及各大藥房，實(shí)驗(yàn)前按照2010版《中國(guó)藥典》一部附錄ⅨU“二氧化硫殘留量的測(cè)定法”項(xiàng)下規(guī)定進(jìn)行檢測(cè)，其中19批為未硫磺熏蒸飲片，9批為硫磺熏蒸飲片。在19批未硫磺熏蒸飲片中隨機(jī)取11批飲片，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室自熏，作為對(duì)照自制硫磺熏蒸飲片，即20～30號(hào)硫磺熏蒸飲片依次為9～19號(hào)未硫磺熏蒸飲片對(duì)應(yīng)的實(shí)驗(yàn)室自制硫磺熏蒸飲片。

自制硫磺熏蒸飲片的具體工藝：取100 g川芎飲片，厚度約為2～4 mm，均勻加入10 mL超純水，覆蓋保鮮膜并于室溫下悶潤(rùn)；取10 g硫磺于蒸發(fā)皿中，點(diǎn)燃后放于自制硫熏容器的最下層，將悶潤(rùn)好的飲片均勻鋪散于不銹鋼籠屜上，并將籠屜置于距離硫磺30 cm左右處硫熏容器的中層，緊密蓋上蓋子，保持密閉24 h后取出飲片，置于40 ℃烘箱中干燥12 h。自制容器的下部側(cè)邊均勻留有8個(gè)直徑約為0.5 cm的小孔，可避免容器內(nèi)氧氣燃盡而自動(dòng)熄滅。

各批次川芎飲片經(jīng)北京大學(xué)藥學(xué)院天然藥物及仿生藥物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室屠鵬飛教授鑒定為傘形科植物川芎LigusticumchuanxiongHort.的干燥根莖。川芎飲片的編號(hào)、批號(hào)及類型列于表1。

1.3 供試品溶液的制備

取川芎飲片，粉碎，過(guò)3號(hào)篩，精密稱定1.25 g，置于圓底燒瓶中，精密加入40倍量的95%乙醇，回流提取2 h，過(guò)濾；向殘?jiān)屑尤?0倍量純水，回流提取2 h，過(guò)濾；混合兩次提取液并用純水定容至100 mL，搖勻，以13 000 r/min離心10 min，取上清液，過(guò)0.45 μm微孔濾膜。取500 μL續(xù)濾液，上樣于SPE固相萃取小柱(SPE柱使用前需用3 mL 100%甲醇緩慢活化，然后不斷減小甲醇比例沖洗柱子，直至甲醇比例為10%)，依次以3 mL 10%甲醇、3 mL 50%甲醇、3.5 mL 100%甲醇為流動(dòng)相，收集濾液，定容至10 mL；混勻后以13 000 r/min離心10 min，取上清液，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

表1 川芎樣品的編號(hào)、批號(hào)及類型Table 1 Number, batch, and type of Chuanxiong Rhizoma Samples

1.4 實(shí)驗(yàn)條件

1.4.1 色譜條件 Agilent Eclipse Plus C18色譜柱(100 mm×2.1 mm×3.5 μm)，前置Agilent C18預(yù)柱；柱溫為35 ℃；流速為0.3 mL/min；進(jìn)樣量為3 μL；流動(dòng)相：A為0.01%甲酸水溶液， B為乙腈；梯度洗脫程序：0.1～12 min(5%B～50%B)，12～18 min(50%B)，18～28 min(50%B～100%B)，28～30 min(100%B)。

1.4.2 質(zhì)譜條件 TOF MS條件：質(zhì)量掃描范圍m/z100～1 500；離子化電壓5 500.00 V/-4 500.00 V；去簇電壓60 V/-60 V；補(bǔ)償電壓10 V/-10 V；霧化氣壓力379 kPa；輔助加熱氣壓力379 kPa；氣簾氣壓力276 kPa；離子化溫度500.00 ℃。

Product 條件：質(zhì)量掃描范圍m/z50～1 000，高靈敏度掃描；去簇電壓60 V/-60 V；補(bǔ)償電壓20 V/-20 V；離子釋放延遲67；離子釋放寬度25。質(zhì)譜配備有自動(dòng)校正系統(tǒng)，設(shè)定每3 h自動(dòng)校正一次。

1.5 數(shù)據(jù)分析

1.5.1 數(shù)據(jù)庫(kù)的建立 檢索傘形科藁本屬植物的相關(guān)文獻(xiàn)，建立包含中藥川芎中所含化學(xué)成分的分子式、分子質(zhì)量和化學(xué)名稱等信息的盡可能全面的數(shù)據(jù)庫(kù)，計(jì)算其在正離子模式下的常見(jiàn)離子[M+H]+、[M+NH4]+、[2M+H]+和負(fù)離子模式下的常見(jiàn)離子[M-H]-、[M+COOH]-、[2M-H]-等多種離子形態(tài)的精確質(zhì)荷比數(shù)值。同時(shí)借助ChemSpider或Chemical Book等下載各個(gè)化合物的.mol文件，或者用ChemBio Draw Ultra 12.0軟件畫(huà)出其結(jié)構(gòu)式并存儲(chǔ)為.mol文件。

1.5.2 軟件應(yīng)用及參數(shù)的設(shè)定 將未硫熏和硫熏川芎樣品的原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入PeakView軟件中，通過(guò)分析比較各個(gè)化合物由總離子流圖提取到的二級(jí)碎片與其.mol文件所對(duì)應(yīng)的碎片之間的匹配度，以及其誤差大小，來(lái)推斷所含有的成分；應(yīng)用MarkerView 軟件對(duì)未硫熏和硫熏川芎樣品的原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行峰匹配、峰對(duì)齊和濾噪處理。主要參數(shù)設(shè)置如下：最短保留時(shí)間2.00 min；最小譜峰寬度25 ppm；最小譜峰寬度掃描次數(shù)6 scans；噪聲閾值100；保留時(shí)間閾值0.50 min；質(zhì)量閾值10.0 ppm；最大峰數(shù)8 000。借助于MarkerView軟件對(duì)原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析和組間t檢驗(yàn)分析，得出其PCA得分圖和載荷圖以及p值的分布圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 典型的總離子流圖

未硫熏和硫熏川芎樣品在正離子和負(fù)離子模式下的UHPLC-Q-TOF MS總離子流圖示于圖1、圖2。結(jié)合兩圖可以看出，未硫熏和硫熏川芎樣品在正負(fù)離子模式下均存在一定的差異(如正離子模式下的16～17 min處和負(fù)離子模式下的6 min處)，但并不明顯。由于中藥成分的復(fù)雜性，很多成分難以在30 min內(nèi)完全分離，特別是許多具有差異性的成分很可能隱藏和包埋在同一個(gè)色譜峰的下面，所以單純依靠總離子流圖中的色譜峰尋找未硫熏和硫熏川芎樣品的差異性成分是不充分和不完全的。因此，本實(shí)驗(yàn)結(jié)合多元數(shù)據(jù)分析(PCA)以及t檢驗(yàn)的方法，提取更多的差異性成分，并對(duì)其結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化的機(jī)理進(jìn)行推導(dǎo)。

圖1 正離子模式下未硫熏川芎(a)和硫熏川芎(b)的總離子流圖Fig.1 TIC of sun-dried (a) and sulfur-fumigated (b) Chuanxiong Rhizoma in positive ion mode

圖2 負(fù)離子模式下未硫熏川芎(a)和硫熏川芎(b)的總離子流圖Fig.2 TIC of sun-dried (a) and sulfur-fumigated (b) Chuanxiong Rhizoma in negative ion mode

2.2 成分鑒定

按照1.5 節(jié)的相關(guān)步驟和思路，將PeakView軟件中的質(zhì)荷比、質(zhì)量偏差、同位素匹配度、結(jié)構(gòu)匹配度等參數(shù)與ChemSpider等數(shù)據(jù)庫(kù)關(guān)聯(lián)后，進(jìn)行化合物的比對(duì)和成分鑒定。正負(fù)離子模式下所鑒定出的成分分別列于附表1和附表2中(由于篇幅所限，請(qǐng)登錄http:∥www.jcmss.com.cn/CN/volumn/current.shtml下載附表)。

2.3 PCA分析

非監(jiān)督方法是按照樣本的特性對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分類，把具有相似特性的數(shù)據(jù)歸為一類，用相應(yīng)的可視化技術(shù)進(jìn)行表達(dá)，主成分分析是其中應(yīng)用最廣泛的一種。PCA得分圖是將樣品的特征信息量壓縮，在低維空間顯示樣品之間的關(guān)聯(lián)性。相似的樣本在坐標(biāo)圖中聚在一起，有差異的樣本則會(huì)分散在不同的區(qū)域，據(jù)此能夠?qū)⒋嬖诔煞植町惖母鹘M實(shí)驗(yàn)樣品進(jìn)行分類。本實(shí)驗(yàn)中正負(fù)離子模式下川芎樣品的主成分分析得分圖示于圖3。

本實(shí)驗(yàn)提取了兩個(gè)主要的成分來(lái)體現(xiàn)硫熏(包括市售硫熏和實(shí)驗(yàn)室自熏)和未硫熏樣品的差異，其中主成分1是體現(xiàn)差異最大的成分。從圖3中可見(jiàn)，未硫熏樣品和硫熏樣品的主成分1處于橫坐標(biāo)的兩側(cè)，可以明顯地將二者區(qū)分。實(shí)驗(yàn)室自熏樣品和市售硫熏樣品也存在一定的差異，體現(xiàn)在主成分2上。這主要是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)室自熏樣品是采用市售未硫熏飲片經(jīng)過(guò)潤(rùn)濕后再進(jìn)行硫磺熏制的，而市售的硫熏飲片大多是將原藥材在產(chǎn)地新鮮采摘后就立即進(jìn)行硫磺熏制的(有些甚至是反復(fù)熏蒸)。因此，實(shí)驗(yàn)室自制的硫熏樣品和市售的硫熏樣品在化學(xué)成分上有一定的相似性，但也存在一定的差異性，兩者在PCA得分圖上所體現(xiàn)出來(lái)的差異說(shuō)明了多元數(shù)據(jù)分析的準(zhǔn)確性和客觀性。

圖3 正離子(a)和負(fù)離子(b)模式下川芎主成分分析得分圖Fig.3 PCA score plot of Chuanxiong Rhizoma in positive (a) and negative (b) ion modes

圖3中對(duì)類別差異產(chǎn)生影響的離子貢獻(xiàn)大小在其載荷圖(PCA loading plot)中以其離原點(diǎn)的距離表示，正負(fù)離子模式下對(duì)應(yīng)的載荷圖示于圖4。圖中每個(gè)點(diǎn)代表對(duì)分類有貢獻(xiàn)的成分，對(duì)其分類影響越大的離子在載荷圖中距離原點(diǎn)的距離越遠(yuǎn)，可被認(rèn)為是區(qū)別各組的標(biāo)志物。

在MarkerView 軟件中應(yīng)用t檢驗(yàn)進(jìn)行組與組之間的比較，可得到各離子的p值分布圖(Log (fold change) versusp-value plot)，示于圖5。圖中越貼近X軸越靠近X軸兩端的離子是組間差異越大的離子。針對(duì)p值低于0.05的離子，推斷其可能的來(lái)源和裂解方式，并進(jìn)一步在PeakView軟件中導(dǎo)出其相應(yīng)的.mol文件與對(duì)應(yīng)的各個(gè)碎片進(jìn)行匹配，選取在置信區(qū)間范圍內(nèi)的相應(yīng)差異成分。圖5中p<0.05成分的鑒定結(jié)果分別在表2和表3中列出。表中，t>0，表明硫熏后峰強(qiáng)度減??；t<0，表明硫熏后峰強(qiáng)度增大。

通過(guò)對(duì)川芎硫磺熏蒸后差異性成分可能的變化途徑進(jìn)行推測(cè)和驗(yàn)證，確定了部分成分的轉(zhuǎn)化途徑和所得成分，列于表4。轉(zhuǎn)化途徑主要為α-羥基和酚羥基的硫酯化和亞硫酯化、內(nèi)酯類化合物單個(gè)或者多個(gè)內(nèi)酯鍵的水解以及兩者的復(fù)合轉(zhuǎn)化。本課題組前期研究所得的液相色譜指紋圖譜中，硫熏樣品比未硫熏樣品明顯多出的一個(gè)色譜峰位于阿魏酸和咖啡酸之間，因其出峰位置有多個(gè)紫外最大吸收波長(zhǎng)，故推測(cè)該色譜峰并非單一成分，很可能是多個(gè)成分形成的峰包；根據(jù)成分的極性和相對(duì)出峰順序以及本實(shí)驗(yàn)所鑒定的成分，推斷其可能是香莢蘭酸、洋川芎內(nèi)酯H或其同分異構(gòu)體的硫酯化物或水解產(chǎn)物以及鄰苯二甲酸二丁酯內(nèi)酯鍵水解后的產(chǎn)物。洋川芎內(nèi)酯H的硫酯化物的二級(jí)質(zhì)譜碎片匹配及結(jié)構(gòu)推導(dǎo)示于圖6。

圖5 正離子(a)和負(fù)離子(b)模式下川芎各離子的p值分布圖Fig.5 Log (fold change) versus p-value plot of Chuanxiong Rhizoma in positive (a) and negative (b) ion modes

化合物Compound分子式Formulam/z保留時(shí)間tR/min[M+1]+tp3-正丁烯基苯酞C12H12O2188.083738.62189.096.223.1388×10-7藁本內(nèi)酯C12H14O2190.0993813.39191.13.272.3300×10-3洋川芎內(nèi)酯AC12H16O2192.1150311.31193.133.163.1300×10-3阿魏酸C12H18O2194.130685.42195.135.522.8451×10-6洋川芎內(nèi)酯F;(3S)-3-Butyl-4-hydroxyphthalide;C12H14O3206.094298.64207.14.743.1029×10-55-羥基正丁基苯酞;7-羥基正丁基苯酞川芎酚C13H14O3218.0942911.58219.17163.262.3700×10-33-正丁烯基-4,5-二羥基苯酞C12H12O4220.073566.37221.1888-2.511.6700×10-2洋川芎內(nèi)酯D;4,7-Dihydroxy-3-butylphthalideC12H14O4222.089217.95223.09692.084.4680×10-2洋川芎內(nèi)酯H;洋川芎內(nèi)酯I;(3S,3aR,6S)-(-)-C12H16O4224.104865.97225.1124.91.9477×10-56-羥基新蛇床內(nèi)酯-10酮;ChuanxiongnolideR2芹菜素C15H10O5270.0528212.94271.06053.421.5300×10-3鄰苯二甲酸二丁酯C16H22O4278.1518110.40279.09362.461.8880×10-2孕酮C21H30O2314.2245812.5315.23162.985.1100×10-3歐當(dāng)歸內(nèi)酯AC24H28O4380.1987617.84381.205914.341.0938×10-16ChuanxiongnolideA;ChuanxiongnolideBC24H28O5396.1936713.86397.20082.332.5440×10-2WallichilideC25H32O5412.2249718.14413.23222.034.9880×10-2ChuanxiongdiolideR1C26H32O5424.2249720.01425.2149-10.182.7813×10-12川芎三萜C39H54O5602.3971324.04603.531615.558.3208×10-18

表3 負(fù)離子模式下鑒定出的川芎中差異性化學(xué)成分(p<0.05)Table 3 Components identified with significant differences from Chuanxiong Rhizoma in negative ion mode (p<0.05)

表4 川芎硫磺熏蒸后差異性成分可能的轉(zhuǎn)化途徑Table 4 Possible transformation pathways of components with significant differences from Chuanxiong Rhizoma after sulfur-fumigation

圖6 洋川芎內(nèi)酯H的硫酯化物的二級(jí)質(zhì)譜碎片匹配及結(jié)構(gòu)推導(dǎo)Fig.6 MS/MS spectrum with assigned fragment structures of senkyunolide H sulfite

3 結(jié)論

本研究采用UHPLC-Q-TOF MS和化學(xué)計(jì)量學(xué)方法研究了川芎硫磺熏蒸前后化學(xué)成分的變化。通過(guò)PCA分析發(fā)現(xiàn)，正負(fù)離子模式下，未硫熏和硫熏川芎樣品均可被明顯地區(qū)分，主成分之間存在明顯差異，t檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了兩者之間存在大量差異性成分。通過(guò)對(duì)差異性成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析，對(duì)其可能的變化途徑進(jìn)行推測(cè)，驗(yàn)證了部分成分的轉(zhuǎn)化途徑和轉(zhuǎn)化所得的成分。實(shí)驗(yàn)所建立的研究模式可為中藥材和飲片及其他復(fù)雜體系成分的鑒定和差異性成分的研究提供方法借鑒，研究結(jié)果可為硫磺熏蒸對(duì)川芎質(zhì)量的影響提供客觀參考，并為控制硫磺熏蒸在中藥材和飲片加工過(guò)程中的過(guò)度運(yùn)用和確保中醫(yī)臨床用藥的安全提供理論依據(jù)。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典2015年版(一部)[S]. 北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：40.

[2] 李松林，林鴿，鐘凱聲，等. 應(yīng)用HPLC-DAD-MS聯(lián)用技術(shù)研究中藥川芎指紋圖譜[J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào)，2004，39(8)：621-626.

LI Songlin, LIN Ge, CHUNG Hoising, et al. Study on fingerprint of Rhizome Chuanxiong by HPLC-DAD-MS[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2004, 39(8): 621-626(in Chinese).

[3] 彭仕華，周同惠. 丁基苯酞的體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化研究[J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào)，1996，31(10)：780-784.

PENG Shihua, ZHOU Tonghui. Investigation oninvivometabolism ofn-butyl phthalide[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 1996, 31(10): 780-784(in Chinese).

[4] 徐皓亮，馮亦璞. 丁基苯酞對(duì)大鼠血栓形成及血小板功能的影響[J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào)，2001，36(5)：329-333.

XU Haoliang, FENG Yipu. Effects of 3-N-butylphthalide on thrombosis formation and platelet function in rats[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2001, 36(5): 329-333(in Chinese).

[5] 劉靜靜，劉曉，李松林，等. 硫磺熏蒸中藥材及飲片的研究現(xiàn)狀[J]. 中草藥，2010，41(8)：1 403-1 406.

LIU Jingjing, LIU Xiao, LI Songlin, et al. Current situation in studies on traditional Chinese medicinal materials and Yinpian by sulfur-fumigated process[J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs, 2010, 41(8): 1 403-1 406(in Chinese).

[6] LI S L, SONG J Z, CHOI F F K, et al. Chemical profiling ofRadixPaeoniaeevaluated by ultra performance liquid chromatography/photo-diode-array/quadrupole time-of-flight mass spectrometry[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2009, 49(2): 253-266.

[7] 黃昆，王文輝，李寶才，等. 超高效液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用在藥物研究領(lǐng)域的應(yīng)用[J]. 光譜實(shí)驗(yàn)室，2009，26(4)：922-930.

HUANG Kun, WANG Wenhui, LI Baocai, et al. Applications of combined ultra-high performance liquid chromatography (UPLC) and mass spectrometry (MS) in the field of drug research[J]. Chinese Journal of Spectroscopy Laboratory, 2009, 26(4): 922-930(in Chinese).

[8] 練杭蕓，徐王彥君，梁乾德，等. UPLC-QTOF MS法比較赤芍、白芍煎液化學(xué)成分差異[J]. 質(zhì)譜學(xué)報(bào)，2014，35(3)：269-278.

LIAN Hangyun, XU Wangyanjun, LIANG Qiande, et al. Chemical comparison between decoctions ofRadixPaeoniaeRubraandRadixPaeoniaeAlbaby UPLC-QTOF MS[J]. Journal of Chinese Mass Spectrometry Society, 2014, 35(3): 269-278(in Chinese).

[9] 侯婭，馬陽(yáng)，鄒立思，等. 基于UPLC-Triple-TOF-MS/MS技術(shù)分析不同產(chǎn)地太子參的差異化學(xué)成分[J]. 質(zhì)譜學(xué)報(bào)，2015，36(4)：359-366.

HOU Ya, MA Yang, ZOU Lisi, et al. Difference of chemical compositions inPseudostellariaeRadixfrom different origins by UPLC-Triple TOF-MS/MS[J]. Journal of Chinese Mass Spectrometry Society, 2015, 36(4): 359-366(in Chinese).

[10]王靜哲，劉震，馬立滿，等. 基于UPLC-Q-TOF MS分析加工炮制對(duì)玄參化學(xué)成分的影響[J]. 質(zhì)譜學(xué)報(bào)，2016，37(1)：1-9.

WANG Jingzhe, LIU Zhen, MA Liman, et al. Changes of chemical constituents inScrophulariaeRadixduring processing based on UPLC-Q-TOF MS[J]. Journal of Chinese Mass Spectrometry Society, 2016, 37(1): 1-9(in Chinese).

[11]張小平，蔣可志，呂惠卿，等. HPLC-Q-TOF MS鑒定條葉榕根莖乙酸乙酯提取物中的主要化學(xué)成分[J]. 質(zhì)譜學(xué)報(bào)，2015，36(4)：310-320.

ZHANG Xiaoping, JIANG Kezhi, LV Huiqing, et al. Identification and characterization of major chemical compounds in the ethyl acetate extract fromFicuspandurataHance Aerial Roots by HPLC-Q-TOF MS[J]. Journal of Chinese Mass Spectrometry Society, 2015, 36(4): 310-320(in Chinese).

[12]宋燕燕，李敏，吳柱樟，等. 采用UPLC-Q-TOF MS技術(shù)分析壇紫菜中脂質(zhì)成分[J]. 質(zhì)譜學(xué)報(bào)，2015，36(5)：425-433.

SONG Yanyan, LI Min, WU Zhuzhang, et al. Rapid identification of lipid compositions fromPorphyrahaitanensisby UPLC-Q-TOF MS[J]. Journal of Chinese Mass Spectrometry Society, 2015, 36(5): 425-433(in Chinese).

[13]馬強(qiáng)，白樺，王超，等. 超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜法快速篩查化妝品中18 種香豆素類化合物[J]. 分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2014，33(3)：248-255.

MA Qiang, BAI Hua, WANG Chao, et al. Rapid screening of 18 coumarin compounds in cosmetics by ultra performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry[J]. Journal of Instrumental Analysis, 2014, 33(3): 248-255(in Chinese).

[14]董靜，王弘，萬(wàn)樂(lè)人，等. 高效液相色譜/電噴霧-離子阱-飛行時(shí)間質(zhì)譜分析鑒定中藥虎杖中的主要化學(xué)成分[J]. 色譜，2009，27(4)：425-430.

DONG Jing, WANG Hong, WAN Leren, et al. Identification and determination of major constituents inPolygonumcuspidatumSieb. et Zucc. by high performance liquid chromatography/electrospray ionization-ion trap-time-of-flight mass spectrometry[J]. Chinese Journal of Chromatography, 2009, 27(4): 425-430(in Chinese).

Investigation on Differences of Chemical Constituents between Sun-Dried and Sulfur-FumigatedChuanxiongRhizomaBased on UHPLC-Q-TOF MS and Chemometric Analysis

CAI Hao1,2, QIAO Feng-xian1,2, PEI Ke3, DUAN Yu1,2, FAN Kai-lei1,2, LIU Xiao1,2, XU Yang-yang1,2, WANG Xiao-qi1

(1.SchoolofPharmacy,NanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210023,China;2.EngineeringCenterofStateMinistryofEducationforStandardizationofChineseMedicineProcessing,NanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210023,China; 3.InstituteofPharmaceuticalandFoodEngineering,ShanxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Taiyuan030024,China)

Sulfur-fumigation has been used around the world for centuries in the food industry to inhibit oxidation of the light-colored fruits or vegetables, and this sulfur-based preservative approach has also been employed in postharvest handling of the medicinal herbs to preserve color and freshness, and to protect against insects and molds over the last several decades in China. However, more and more recent reports about sulfur-fumigation show that it can cause the chemical transformations of the original bioactive components (the sulfur dioxide obtained from the heating of sulfur, as a strong reducing agent, may react with the ketonic group and hydroxyl radical-containing components of the medicinal herbs), affect the efficacies and the pharmacokinetics of the medicinal herbs and their extracts or preparations, and more seriously it can even lead to a toxic reaction in the liver and kidneys. Therefore, the influence on the intrinsic quality ofChuanxiongRhizomacaused by sulfur-fumigation needs to be investigated systematically. In this paper, the differences of chemical constituents between sun-dried and sulfur-fumigatedChuanxiongRhizomawere investigated based on UHPLC-Q-TOF MS and chemometric analysis. The samples of 19 batches of sun-driedChuanxiongRhizoma, 11 batches of lab-prepared sulfur-fumigatedChuanxiongRhizoma, and 9 batches of industrial sulfur-fumigatedChuanxiongRhizomawere taken as the research objects. The sample solutions were prepared by the optimized extraction method. After injection of the prepared sample solutions, PeakView1.2 software was applied to analyze the mass spectrometric data and to identify the constituents based on the accuratem/zvalues of Q-TOF MS and the fragments of Q-TOF MS2. Meanwhile, MarkerView1.2.1 software was combined to develop the principal component analysis andt-test statistical analysis to identify as more common components and components with significant differences as possible. The results showed that the samples of sun-dried and sulfur-fumigatedChuanxiongRhizomacould be classified clearly both in positive and negative ion modes by the means of principal component analysis, and there were obvious statistical differences existed among the principal components. What’s more, the results oft-test also demonstrated that there were a large number of constituents with statistical differences existed between sun-dried and sulfur-fumigatedChuanxiongRhizoma, and parts of them were identified and their possible transformation pathways were further proposed. The study can provide the objective reference for the influence of sulfur-fumigation on the quality ofChuanxiongRhizoma, and the theoretical basis for the control of excessive use of sulfur-fumigation in the processing of Chinese medicinal herbs and for the ensurance of safety and effectiveness of clinical medication in Chinese medicine.

UHPLC-Q-TOF MS; chemometric analysis;ChuanxiongRhizoma; sulfur-fumigation;t-test; principal component analysis (PCA); composition transformation; components with significant differences

2016-09-02;

2016-11-28

國(guó)家自然科學(xué)基金(81673600，81173546，30940093)；江蘇省國(guó)際科技合作計(jì)劃項(xiàng)目(BZ2011053)；國(guó)家藥典委員會(huì)項(xiàng)目；江蘇省普通高校研究生科研創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目(KYLX_0975)；江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程項(xiàng)目(2011ZYX2-001)資助

蔡 皓(1966—)，男(漢族)，副研究員，碩士生導(dǎo)師，從事中藥分析及中藥質(zhì)量控制研究。E-mail: haocai_98@126.com

O657.63

A

1004-2997(2017)01-0127-11

10.7538/zpxb.2017.38.01.0127