益氣養(yǎng)陰祛瘀方對干燥綜合征頜下腺細胞AQP5及M3R表達的影響*

秦 源林崇澤孫 晗李志宇王新昌

（1.浙江中醫(yī)藥大學，浙江 杭州 310053；2.浙江省新華醫(yī)院，浙江 杭州 310053）

·研究報告·

益氣養(yǎng)陰祛瘀方對干燥綜合征頜下腺細胞AQP5及M3R表達的影響*

秦 源1林崇澤1孫 晗1李志宇1王新昌2△

（1.浙江中醫(yī)藥大學，浙江 杭州 310053；2.浙江省新華醫(yī)院，浙江 杭州 310053）

目的 觀察益氣養(yǎng)陰祛瘀方含藥血清對干燥綜合征（SS）患者頜下腺細胞AQP5及M3R表達的影響。方法 制備不同劑量SD大鼠益氣養(yǎng)陰祛瘀方含藥血清，再分別給予以下處理：空白組（僅含RPMI1640培養(yǎng)液），空白血清組（10%空白血清+RPMI1640培養(yǎng)液），分別予含5%、10%、15%、20%不同濃度的含藥血清+ RPMI1640培養(yǎng)液組，共6組。培養(yǎng)細胞24 h后，分別以倒置相差顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡觀察細胞，Western blot檢測細胞中AQP5及M3R蛋白表達水平。結(jié)果 益氣養(yǎng)陰祛瘀方含藥血清作用后，激光共聚焦顯微鏡觀察抗體標記細胞的熒光強度明顯增強。Western blot檢測AQP5與M3R的蛋白表達均有上調(diào)。含藥血清組中的AQP5及M3R蛋白的表達明顯高于空白血清組，且10%、15%含藥血清組高于5%含藥血清組（P＜0.05），但與20%相差不大（P＞0.05）。結(jié)論 益氣養(yǎng)陰祛瘀方可以上調(diào)頜下腺細胞中AQP5及M3R蛋白的表達，而且與之成一定的劑量依賴關系。

干燥綜合征 益氣養(yǎng)陰祛瘀方 含藥血清 水通道蛋白AQP5 M3R

干燥綜合征（SS）是一種以淋巴細胞大量侵犯人體的外分泌腺，尤以唾液腺及淚腺為主，導致其分泌功能降低的自身免疫性疾病?；颊咧饕憩F(xiàn)為眼干、口干等癥狀，同時伴有內(nèi)臟多系統(tǒng)損害，臨床表現(xiàn)多種多樣，目前該病的發(fā)病機制尚不十分明確。臨床治療多依賴于激素，治療初期效果尚可，但是長期運用效用下降，最主要的是用藥帶來的副作用令人擔憂。本課題組一直致力于益氣養(yǎng)陰祛瘀方對SS治療作用的研究，我們前期的工作表明，該方不僅能很好的整體調(diào)節(jié)了SS患者和自發(fā)性SS動物模型NOD小鼠的免疫功能，而且對SS患者口、眼干燥的臨床癥狀和對NOD小鼠的唾液分泌量、頜下腺損傷指數(shù)以及局部免疫炎癥微環(huán)境也有明顯的改善作用［1-3］。本實驗主要采用血清藥理學方法，探討益氣養(yǎng)陰祛瘀方對患者頜下腺細胞中AQP5及M3R的表達作用，對于深入研究中藥方劑對外分泌腺腺體分泌功能的作用機制，以及尋求SS治療方法方面具有重要意義?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雌性SD大鼠共16只，SPF級，體質(zhì)量190~200 g，由浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2012-0002，飼養(yǎng)環(huán)境：溫度（23±2）℃，相對濕度（55±10）%。

1.2 試藥與儀器 益氣養(yǎng)陰祛瘀方：生地黃24 g，玄參15 g，麥冬15 g，石斛12 g，白芍12 g，黃芪24 g，丹參30 g，益母草15 g。由浙江中醫(yī)藥大學附屬新華醫(yī)院藥劑科制備濃縮煎劑。頜下腺細胞由大連中科院提供。RPMI1640培養(yǎng)液（美國Gibco公司），F(xiàn)BS胎牛血清（美國Gibco公司），青霉素-鏈霉素溶液（100X碧云天），PBS緩沖液（杭州諾森德生物技術有限公司），0.25%胰酶（含0.02%的EDTA），一抗兔抗人AQP5抗體（abcam公司），一抗兔抗人M3R抗體（美國Santa Cruz公司），二抗羊抗兔IgG抗體（美國Santa Cruz公司），二抗羊抗兔IgG抗體FITC（美國Santa Cruz公司），SDS-PAGE凝膠配置試劑盒（碧云天），RIPA快速裂解液、PMSF（碧云天），預染蛋白分子量標準（碧云天），戊巴比妥鈉（浙江中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供）。二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo Fisher），離心機（Thermo Fisher），熒光倒置顯微鏡 （OLYMPUS），激光共聚焦顯微鏡（OLYMPUS），SW-CJ-2F型雙人雙面超凈化工作臺（蘇州凈化設備有限司），液氮罐（美國），SDS-PAGE電泳儀（美國BioRad）。

1.3 中藥含藥血清制備 SD大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，隨機分為正常組和益氣養(yǎng)陰祛瘀方組，每組8只。正常組以同等量的生理鹽水灌胃，中藥組以益氣養(yǎng)陰祛瘀方灌胃，連續(xù)7 d。每天觀察小鼠的生長情況。動物給藥量為益氣養(yǎng)陰祛瘀方9.2 g/kg。在最后一次給藥2 h后，10%戊巴比妥腹腔注射麻醉，腹主動脈取血（取血前禁食不禁水12 h），室溫下靜置2 h后4000 r/min離心10 min，分離血清至EP管中，56℃水浴滅活30 min，0.22 μm微孔濾膜過濾，分裝后-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 頜下腺細胞的培養(yǎng)和含藥血清處理 HSG細胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清和抗生素的RPMI1640培養(yǎng)液中。1~2 d更換培養(yǎng)液，以倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)，覆蓋瓶壁面積達70%~80%時，以0.25%胰酶消化，制成細胞懸液，分瓶繼續(xù)培養(yǎng)，每周傳代1~2次。HSG細胞經(jīng)常規(guī)接種后，24 h后待細胞貼壁并生長良好，換用含0.5%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基饑餓24 h使細胞同步化于靜止期。分別給予以下處理：空白組（僅含RPMI1640培養(yǎng)液），空白血清組（含10%的空白血清+RPMI1640培養(yǎng)液），分別予5%、10%、15%、20%濃度含藥血清+RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞，共6組。以倒置顯微鏡觀察細胞生長狀況，培養(yǎng)24 h后收集細胞。

1.5 標本采集與檢測 1）激光共聚焦觀察細胞。收集細胞，以含1%BSA的PBS緩沖液清洗細胞，4%的多聚甲醛（PFA）固定細胞1 h后，用含1%BSA的PBS緩沖液清洗細胞3次，每次5 min，以去除多余的PFA溶液，一抗4℃孵育過夜，同樣方法清洗細胞3次后，加入熒光二抗標記，室溫下1 h。以PBS清洗后，將其置于激光共聚焦下觀察。2）Western Blot法檢測頜下腺細胞中AQP5及M3R蛋白含量表達。收集細胞，以PBS緩沖液清洗細胞3次，加入含PMSF的RIPA細胞快速裂解液，置于冰上裂解30 min，輕輕將裂解好的細胞用細胞刮刮至一邊，并將其移入EP管中，4℃下10000 r/min離心10 min，收集上清液，以BCA法檢測上清液中蛋白濃度；每管按4∶1比例加入5×SDS上樣緩沖液，100℃煮沸5 min變性；10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜；5%脫脂奶粉室溫封閉90 min，加入一抗AQP5、M3R抗體（均為1∶1000）孵育過夜，膜以TBST清洗3次，然后加入羊抗兔IgG（1∶10000）孵育2 h，再次洗膜后獲取圖像并做分析。

1.6 統(tǒng)計學處理 應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析。計量資料均以（）表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 細胞形態(tài)學觀察 見圖1。HSG細胞邊界外廓清楚，呈梭形、多邊形、薄橢圓形，形態(tài)不一，胞質(zhì)豐富，視野下有少量空泡顆粒，細胞之間相互融合，呈現(xiàn)“鋪石路樣”形態(tài)。進入對數(shù)生長期后，增殖速度加快，排列緊密。含藥血清干預后細胞形態(tài)無明顯改變，相對清晰，細胞量稍微減少，空泡顆粒減少，隨著含藥血清濃度的增加細胞表面在一定程度上有少量磨砂樣改變。

圖1 HSG細胞形態(tài)學觀察（100倍）

2.2 激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果 見圖2。含藥血清干預細胞后，以激光共聚焦顯微鏡進行觀察，細胞內(nèi)AQP5、M3R熒光強度明顯增強，10%含藥血清組所標記的明顯高于空白血清組。

圖2 HSG細胞激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果（FITC免疫熒光染色，200倍）

2.3 HSG細胞AQP5及M3R蛋白表達 見表1，圖3。用Western blot法測定益氣養(yǎng)陰祛瘀藥誘導下的HSG細胞AQP5及M3R蛋白表達情況。AQP5蛋白表達5%含藥血清組高于空白組，10%含藥血清組高于5%血清組，15%含藥血清組高于空白組，并且高于5%、10%含藥血清組（P＜0.05）；同樣M3R蛋白表達趨勢與AQP5一致，15%含藥血清組分別高于10%、5%含藥血清組和空白血清組（P＜0.05）。

表1 各組AQP5、M3R蛋白表達水平比較（分，）

表1 各組AQP5、M3R蛋白表達水平比較（分，）

與空白組比較，*P＜0.05；與空白血清組比較，△P＜0.05；與5%含藥血清組比較，★P＜0.05。

組別 n AQP5 M3R空白組 0.805±0.049 1.519±0.099空白血清組 0.855±0.001 1.526±0.075 5%含藥血清組 0.927±0.094*1.729±0.067*△10%含藥血清組 1.104±0.149*△1.778±0.109*△15%含藥血清組 1.165±0.056*△★1.898±0.094*△★20%含藥血清組 1.144±0.154*△★1.887±0.082*△★

圖3 AQP5、M3R蛋白表達

3 討 論

本次實驗采取血清藥理學方法，以益氣養(yǎng)陰祛瘀方為依托，干預SS患者頜下腺細胞，觀察AQP5和M3R的表達情況。血清藥理學方法是由日本學者田代真一最早提出的，經(jīng)過數(shù)十年的驗證和不斷完善，目前已被廣泛的運用。但是口服給藥劑量的多少仍然是比較棘手的問題，因為含藥血清在體外環(huán)境中，濃度已被稀釋，反應體系濃度達不到在機體內(nèi)條件下的藥物濃度，在這種情況下，很可能會出現(xiàn)假陰性。另中藥成分很復雜，配伍更是千變?nèi)f化，除了有效成分外，還有很多雜質(zhì)，如鞣質(zhì)，電解質(zhì)等，加上藥物的酸堿度也有可能會對體外的細胞、器官或組織等產(chǎn)生一些的影響，制約著體外研究的進行［4］，這是此次實驗中也應當考慮的問題，為此本研究設置了多組對照，期望盡量減少外來因素干擾實驗。

水通道蛋白（AQP）是廣泛存在于原核和真核細胞膜上轉(zhuǎn)運水的特異孔道，是主體內(nèi)在蛋白（MIP）家族的成員，到目前為止，發(fā)現(xiàn)的哺乳動物AQP家族已有13個成員（AQP0～AQP12），且廣泛表達于各個器官，它們功能上有著微妙的差異，但是在蛋白質(zhì)序列上又有著同源性［5］。AQP的分布具有特異性，它參與人體多種生理功能的調(diào)節(jié)，對維持人體正常生理狀態(tài)具有重要作用［6］。AQP5是最早被確定分布在唾液腺泡細胞的一種蛋白，分布于腺泡腔的頂膜、側(cè)膜、閏管和導管上皮細胞中，構(gòu)成涎腺唾液分泌的主要通道，與其他亞型一樣具有水轉(zhuǎn)運的特性［7］。有人研究［8］發(fā)現(xiàn)AQP5在腺泡頂膜表達減少，而基側(cè)膜表達則增強，這種表達部位的“易向”可能是AQP5將水分子從腺泡細胞頂膜向基側(cè)膜逆向轉(zhuǎn)運的結(jié)果，使唾液分泌減少。本研究觀察經(jīng)中藥干預細胞前后，激光共聚焦顯微鏡下細胞內(nèi)標記表達AQP5的熒光強度有所增加，結(jié)合免疫印跡實驗證實的AQP5蛋白表達有明顯上調(diào)，說明該方對AQP5通道的調(diào)節(jié)確實是有效的，但是否像上述所說是存在AQP5蛋白的移位，尚待進一步研究。李菁等［9］發(fā)現(xiàn)，SS患者唇腺中AQP5蛋白在腺泡細胞腔面的分布下調(diào)，表明腺泡細胞腔面AQP5的表達與唾液流率存在正相關，腺泡細胞腔面AQP5的表達與淋巴細胞浸潤灶評分呈負相關，提示在唇腺中浸潤的淋巴細胞分泌的炎性因子所形成的微環(huán)境，可能是導致腺泡細胞腔面AQP5表達減少的原因之一，這和我們之前推測各種炎性因子與SS之間存在的緊密聯(lián)系相印證，在之后的實驗中我們將進行具體驗證。SS患者唾液腺中已發(fā)現(xiàn)諸多影響唾液流率降低因素，包括有促進炎癥進展細胞因子IL、TNF、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）、凋亡抑制因子（Survivin）、巨噬細胞炎癥蛋白趨化因子（MIP）等。目前證實，在SS患者受累外分泌腺的淋巴細胞浸潤灶中高表達細胞因子可最終導致腺泡破壞，由此目前也陸續(xù)有一些針對這類細胞因子的拮抗劑被嘗試用來治療SS［10］。

此次的研究我們猜想SS與M3R也存在不可分割的聯(lián)系，這源于有人發(fā)現(xiàn)M3R抗體是存在于SS患者血清中的一種自身抗體，它可以阻斷乙酰膽堿能神經(jīng)信號的有效傳遞，引起腺上皮細胞的分泌功能低下。當腺體受到刺激時，就會釋放乙酰膽堿和神經(jīng)肽等物質(zhì)，結(jié)合并激活M3R，從而引起頜下腺的損傷、血流反應變慢和唾液輸出量的減少，同時亦可阻斷腺泡內(nèi)AQP5的正常分布，導致涎腺分泌減少，同時還可激活磷脂酶C信號傳導通路，增加腺體局部NO水平，破壞涎腺組織結(jié)構(gòu)［11-13］。M3R屬于G蛋白偶聯(lián)受體超家族，是由460~590個氨基酸組成的一種單鏈跨膜糖蛋白，該家族目前有M1R～5R 5個成員，在體內(nèi)主要參與肌肉收縮調(diào)節(jié)、呼吸、運動、體溫調(diào)節(jié)、學習、記憶等重要的生理功能，是體內(nèi)重要的受體之一［14］。目前諸多研究表明，M3R在外分泌腺腺體功能中有著舉足輕重的地位，其在外分泌腺如唾液腺和淚腺中表達，能調(diào)節(jié)唾液腺和淚腺的副交感神經(jīng)活動，從而影響外分泌腺體的分泌功能。本研究發(fā)現(xiàn)，益氣養(yǎng)陰祛瘀方藥可以調(diào)節(jié)M3R通道，抑制腺體激發(fā)過程中乙酰膽堿的分泌，從而有效保護腺體損傷，防止SS的發(fā)生。

總的說來，M3R和AQP5可調(diào)節(jié)水分子轉(zhuǎn)運，主要維持外分泌腺腺體的正常分泌與輸出，當SS導致唾液腺嚴重破壞時，M3R和AQP5在各個部位分布情況亦會隨之發(fā)生改變，導致機體水轉(zhuǎn)運失代償，從而引起唾液分泌與輸出減少。有實驗研究也表明，使用M3毒蕈堿乙酰膽堿受體的激動劑西維美林處理腺體組織或細胞后，可以促使AQP5與脂質(zhì)筏從胞內(nèi)囊泡轉(zhuǎn)移至細胞頂膜（管腔側(cè)細胞膜）［15］，通過增加膜上蛋白的數(shù)量而快速調(diào)節(jié)對水的通透［16］。本次實驗發(fā)現(xiàn)了益氣養(yǎng)陰祛瘀方可以調(diào)節(jié)AQP5、M3R通道的作用，從而改善腺體的水分分布，維持其正常的生理功能。至于中藥方劑如何具體作用于通道，以及治療SS機制如何，將進一步研究。

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Study on the Influence of Yiqiyangyin Quyu Formulae on AQP5 and M3R Expression of Sjogren's Syndrome Submandibular Gland Cells

QIN Yuan，LIN Chongze，SUN Han，et al.
Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine，Zhejiang，Hangzhou 310053，China.

Objective：To investigate Yiqiyangyin Quyu Formulae contained serum′s influence on AQP5 and M3R expression in submandibular gland cells of the patients with Sjogren′s syndrome.Methods：Different doses of SD rats Yiqiyangyin Quyu Formulae contained serum were prepared，and then given the following treatment：blank group（only contained RPMI1640 culture），blank serum+10%RPMI1640 group，medicated serum with 5%，10%，15%and 20%different concentrations+RPMI1640 culture groups，a total of six groups.After 24 hours of cell cultivation，cells were observed respectively by inverted phase contrast microscope and laser confocal microscope.AQP5 and M3R protein expression levels in cells were detected by Westernblot.Results：With the effect of Yiqiyangyin Quyu Formulae contained serum，fluorescence intensity of antibody-labeled cells was significantly enhanced observed with the laser scanning confocal microscopy.AQP5 and M3R protein expression were up-regulated detected by Western blot.AQP5 and M3R protein expression in serum contained group was significantly higher than that of the blank serum group，and the value of 10%，15%groups was higher than that of 5% dosing group（P＜0.05），with no statistically significant difference with 20%dosing group（P＞0.05）.Conclusion：Yiqiyangyin Quyu Formulae can up-regulate the expression of AQP5 and M3R protein in submandibular gland cells in a certain dose-dependent manner.

Sjogren′s syndrome；Yiqiyangyin Quyu Formulae；Containing serum；Aquaporin AQP5；M3R

R285.5

A

1004-745X（2017）01-0005-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.01.002

2016-05-05）

國家自然科學基金資助項目（81473646）

△通信作者（電子郵箱：ossani@126.com）