黃芩素和LY294002對人肝癌細胞系SMMC-7721細胞增殖和凋亡的影響研究

汪 楓，喻小蘭，夏紀毅，王曉燕，唐 利，曹 勇，唐小平，夏國棟

·論著·

黃芩素和LY294002對人肝癌細胞系SMMC-7721細胞增殖和凋亡的影響研究

汪 楓1，喻小蘭2，夏紀毅3，5，王曉燕3，唐 利3，曹 勇3，唐小平3，夏國棟4*

目的 探討黃芩素和LY294002對人肝癌細胞系SMMC-7721細胞增殖和凋亡的影響。方法 2015年3月—2016年1月，取人肝癌細胞系SMMC-7721，制備細胞懸液。加入黃芩素(1、2、5、10、20、50、100、200、300 μmol/L，分別命名為A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9組)或LY294002(1、2、5、10、20、30 μmol/L，分別命名為B1、B2、B3、B4、B5、B6組)，設(shè)定空白對照組和二甲基亞砜(DMSO)對照組，采用CCK8試劑盒檢測各組細胞增殖水平；采用20 μmol/L黃芩素(C1組)單獨處理，20 μmol/L黃芩素聯(lián)合10 μmol/L LY294002(C2組)處理人肝癌細胞系SMMC-7721，設(shè)定空白對照組和DMSO組，采用流式細胞術(shù)檢測各組細胞周期；采用2、5、10、20 μmol/L黃芩素(分別命名為D1、D2、D3、D4組)處理人肝癌細胞系SMMC-7721，設(shè)定空白對照組和DMSO組，采用顯微攝影檢測各組細胞數(shù)量；采用20 μmol/L黃芩素(E1組)單獨處理，20 μmol/L黃芩素聯(lián)合10 μmol/L LY294002(E2組)處理人肝癌細胞系SMMC-7721，設(shè)定空白對照組和DMSO組，采用流式細胞術(shù)檢測各組早期凋亡和晚期凋亡情況；采用20 μmol/L黃芩素(F1組)、10 μmol/L LY294002(F2組)或20 μmol/L黃芩素聯(lián)合10 μmol/L LY294002(F3組)處理人肝癌細胞系SMMC-7721，設(shè)定空白對照組和DMSO組，采用實時熒光定量PCR(Real-time PCR)法檢測細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)1/2、周期素D1(CyclinD1)、糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(AKT) mRNA表達水平；采用20 μmol/L黃芩素(G1組)、10 μmol/L LY294002(G2組)或20 μmol/L黃芩素聯(lián)合10 μmol/L LY294002(G3組)處理人肝癌細胞系SMMC-7721，設(shè)定空白對照組和DMSO組，采用Western blotting法檢測磷酸化ERK1/2(P-ERK1/2)、CyclinD1、磷酸化GSK-3β(P-GSK-3β)、磷酸化AKT(P-AKT)表達水平。結(jié)果 A8組、A9組、B6組細胞增殖水平低于空白對照組、DMSO對照組(P<0.05)。C2組G0/G1期、G2/M期細胞比例高于空白對照組、DMSO組，S期細胞比例低于空白對照組、DMSO組(P<0.05)。D4組細胞數(shù)量少于空白對照組、DMSO組(P<0.05)?？瞻讓φ战M、DMSO組、E1組、E2組早期凋亡和晚期凋亡比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。F3組ERK1/2、CyclinD1、GSK-3β、AKT mRNA表達水平均低于空白對照組、DMSO組(P<0.05)。G3組P-ERK1/2、CyclinD1、P-GSK-3β、P-AKT表達水平低于空白對照組、DMSO組(P<0.05)。結(jié)論 黃芩素和LY294002可抑制人肝癌細胞系SMMC-7721細胞增殖，但不影響其凋亡。

肝腫瘤；細胞增殖；細胞凋亡；黃芩素；LY294002；人肝癌細胞系SMMC-7721

汪楓，喻小蘭，夏紀毅，等.黃芩素和LY294002對人肝癌細胞系SMMC-7721細胞增殖和凋亡的影響研究[J].中國全科醫(yī)學，2017，20(3)：323-330.[www.chinagp.net]

WANG F,YU X L,XIA J Y,et al.Effects of baicalein and LY294002 on proliferation and apoptosis of human hepatocellular carcinoma cell line SMMC-7721[J].Chinese General Practice，2017，20(3)：323-330.

肝癌(liver cancer)是指發(fā)生于肝臟的惡性腫瘤，病死率僅次于胃癌、食管癌，其包括原發(fā)性肝癌和轉(zhuǎn)移性肝癌兩種，人們?nèi)粘Ｕf的肝癌多指原發(fā)性肝癌，其發(fā)病率高、轉(zhuǎn)移早、預(yù)后差，目前尚無有效的治療方法[1-3]。細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)1/2、磷酸肌醇3-激酶(PI-3K)/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(AKT)和糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)信號通路的失調(diào)與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其調(diào)控癌細胞的增殖和凋亡：ERK1/2是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族的成員之一，與癌細胞惡性增殖、分化和侵襲轉(zhuǎn)移息息相關(guān)，細胞受刺激后，通過G蛋白偶聯(lián)受體、生長因子受體或酪氨酸蛋白激酶受體，經(jīng)大鼠肉瘤蛋白(Ras)/快速反應(yīng)肉瘤蛋白(Raf)/ERK激酶(MEK)/ERK級聯(lián)信號激活ERK，ERK1/2通過磷酸化調(diào)節(jié)某些轉(zhuǎn)錄因子的活性如Elk1、EtsI、c-myc、Tal、信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子(STATS)等，抑制Myb，間接激活原癌基因c-fos和c-jun，促進轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白1(activator protein-1，AP-1)活性，調(diào)節(jié)癌細胞的惡性增殖和侵襲轉(zhuǎn)移；PI-3K/AKT信號通路是調(diào)節(jié)癌細胞惡性增殖、分化、凋亡和侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵信號通路，LY294002是PI-3K的特異性抑制劑，能完全抑制p110亞基的催化活性；GSK-3β是調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路的重要激酶，在胞質(zhì)中與結(jié)腸腺瘤性息肉病蛋白(adenomatous polyposis coli，APC)、軸抑制蛋白(Axin)形成降解復(fù)合物后，使β-catenin磷酸化并降解，在細胞質(zhì)內(nèi)保持低水平，當GSK-3β磷酸化后會失活，β-catenin會在細胞質(zhì)內(nèi)聚集然后轉(zhuǎn)運至細胞核，刺激與癌細胞惡性增殖、分化、凋亡和侵襲轉(zhuǎn)移等相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和表達[4-9]。黃芩素和LY294002均可抑制癌細胞增殖，促進癌細胞凋亡，但二者在肝癌中的作用機制還未得到完全闡明。本研究探討了黃芩素和LY294002對癌細胞的作用機制，報道如下。

1 材料與方法

1.1 研究材料 人肝癌細胞系SMMC-7721購自中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所；黃芩素購自Sigma公司，純度為99%，充分溶解于二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)中，儲存液濃度為5 000 μg/L(DMSO的終濃度≤0.2%)，4 ℃避光保存，使用前用細胞培養(yǎng)基稀釋成實驗所需的濃度；LY294002購自Alexis公司；Trizol試劑購于Invitrogen公司；細胞周期試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Fermentas公司；GAPDH、辣根過氧化物酶山羊抗兔IgG(H+L)及辣根過氧化物酶山羊抗小鼠IgG(H+L)購自碧云天生物科技有限公司；ERK1/2、周期素D1(CyclinD1)、GSK-3β、AKT、磷酸化ERK1/2(P-ERK1/2)、磷酸化GSK-3β(P-GSK-3β)、磷酸化AKT(P-AKT)引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，對應(yīng)一抗購自CST公司；CCK8(Cell Counting Kit-8)試劑盒購自上海拓然生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 CCK8試劑盒檢測細胞增殖水平 2015年3月—2016年1月，取人肝癌細胞系SMMC-7721，制備細胞懸液；將細胞懸液接種至96孔板中，100 μl/孔，加入黃芩素(1、2、5、10、20、50、100、200、300 μmol/L，分別命名為A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9組)或LY294002(1、2、5、10、20、30 μmol/L，分別命名為B1、B2、B3、B4、B5、B6組)；37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h；加入10 μl CCK8混勻；培養(yǎng)4 h，生成結(jié)晶甲瓚(Formazan)；測定450 nm處吸光度(OD值)即細胞增殖水平：采用雙波長進行測定，檢測波長450～490 nm，參比波長600～650 nm。設(shè)定空白對照組：在不含細胞懸液的培養(yǎng)基中加入CCK8，測定450 nm處OD值；DMSO對照組：在不含細胞懸液且加入DMSO的培養(yǎng)基中加入CCK8，測定450 nm處OD值。實驗獨立重復(fù)3次。

1.2.2 流式細胞術(shù)檢測細胞周期 將人肝癌細胞系SMMC-7721接種于12孔板，分別采用20 μmol/L黃芩素(C1組)單獨處理，20 μmol/L黃芩素聯(lián)合10 μmol/L LY294002(C2組)處理人肝癌細胞系SMMC-7721，設(shè)定空白對照組和DMSO組(加入用于溶解黃芩素所需要的等體積DMSO)，24 h后收集細胞，室溫磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，加入1 ml 70%預(yù)冷乙醇溶液固定過夜，12 000 r/min離心5 min(離心半徑10 cm)，去除乙醇溶液，PBS重懸，加入核糖核酸酶(ribonuclease，RNase)至終濃度為100 mg/L，37 ℃水浴30 min，加入碘化丙啶(propidium iodide，PI)至終濃度為50 mg/L，4 ℃避光染色30 min，利用細胞周期試劑盒、采用激發(fā)波長為488 nm的紅色熒光檢測細胞周期。結(jié)果采用細胞周期擬合軟件進行分析，記錄亞二倍體峰，即G0/G1期、S期、G2/M期細胞比例。實驗獨立重復(fù)3次。

1.2.3 顯微攝影檢測細胞數(shù)量 采用2、5、10、20 μmol/L黃芩素(分別命名為D1、D2、D3、D4組)處理人肝癌細胞系SMMC-7721，設(shè)定空白對照組和DMSO組，24 h后低倍鏡(×100)下選取9個視野計數(shù)細胞數(shù)量。

1.2.4 流式細胞術(shù)檢測早期凋亡和晚期凋亡 分別采用20 μmol/L黃芩素(E1組)單獨處理，20 μmol/L黃芩素聯(lián)合10 μmol/L LY294002(E2組)處理人肝癌細胞系SMMC-7721，設(shè)定空白對照組和DMSO組，24 h后按照Annexin V/PI試劑盒說明書操作即細胞處理后，收集懸浮細胞，PBS洗2次，加入400 μl 1×Binding Buffer重懸細胞，加入5 μl Annexin V-異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)混勻，室溫避光孵育15 min，加入10 μl PI染色液至終濃度為50 μg/ml混勻，避光孵育5 min，采用流式細胞儀檢測細胞早期、晚期凋亡數(shù)目。結(jié)果采用Cell Quest軟件進行分析。實驗獨立重復(fù)3次。1.2.5 實時熒光定量PCR(Real-time PCR)法檢測ERK1/2、CyclinD1、GSK-3β、AKT mRNA表達水平 嚴格按照實驗所用試劑盒說明書操作，采用20 μmol/L黃芩素(F1組)、10 μmol/L LY294002(F2組)、20 μmol/L黃芩素聯(lián)合10 μmol/L LY294002(F3組)處理人肝癌細胞系SMMC-7721，設(shè)定空白對照組和DMSO組，去掉培養(yǎng)基，PBS沖洗2次，采用Trizol試劑提取總RNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈，采用Real-time PCR法檢測凋亡相關(guān)因子(ERK1/2、CyclinD1、GSK-3β、AKT)mRNA表達水平。ERK1/2上游引物為5′-AATCACACGGTAGACACTGAAATGCC-3′，下游引物為5′-CATCATCCCATCTAAAATGTCCCCTG-3′；CyclinD1上游引物為5′-TACGGUCAUGUCCAAAGUTAT-3′，下游引物為5′-CAGACGCACGGCTTTGACCTTCTT-3′；GSK-3β上游引物為5′- GCCCTGAGGGCCCGAACTGTTACT-3′，下游引物為5′- ATUGUUGGACAUGACCGGAAC-3′；AKT上游引物為5′-AGCGACGTGGCTATTGTGAAG-3′，下游引物為5′-GCCATCATTCTTGAGGAGGAAGT-3′；內(nèi)參GAPDH上游引物為5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游引物為5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。1.2.6 Western blotting法檢測P-ERK1/2、CyclinD1、P-GSK-3β、P-AKT表達水平 嚴格按照實驗所用試劑盒說明書操作，采用20 μmol/L黃芩素(G1組)、10 μmol/L LY294002(G2組)或20 μmol/L黃芩素聯(lián)合10 μmol/L LY294002(G3組)處理人肝癌細胞系SMMC-7721，設(shè)定空白對照組和DMSO組，24 h后用預(yù)冷的PBS沖洗細胞2～3次，加入蛋白酶抑制劑和裂解液，冰浴20 min，使細胞全部裂解，12 000 r/min離心5 min(離心半徑10 cm)，取上清液，收集細胞總蛋白。取5 μl變性的蛋白樣本進行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，用電轉(zhuǎn)儀將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)入聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗(P-ERK1/2、CyclinD1、P-GSK-3β稀釋比例為1∶1 000，P-AKT稀釋比例為1∶500，內(nèi)參GAPDH稀釋比例為1∶2 000)4 ℃孵育過夜。1×TBST漂洗2次，20 min/次，HRP辣根過氧化物酶山羊抗兔IgG(H+L)及HRP辣根過氧化物酶山羊抗小鼠IgG(H+L)(二抗稀釋比例均為1∶2 000)室溫孵育1 h，1×TBST漂洗2次，5 min/次，凝膠成像儀成像后進行灰度分析，計算相關(guān)蛋白的表達水平。實驗獨立重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 黃芩素或LY294002對人肝癌細胞系SMMC-7721細胞增殖的影響 空白對照組、DMSO對照組及A1～A9組細胞增殖水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；其中A8組、A9組細胞增殖水平低于空白對照組、DMSO對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表1)?？瞻讓φ战M、DMSO對照組及B1～B6組細胞增殖水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；其中B6組細胞增殖水平低于空白對照組、DMSO對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表2)。

2.2 黃芩素或LY294002對人肝癌細胞系SMMC-7721細胞周期的影響 空白對照組、DMSO組、C1組、C2組G0/G1期、S期、G2/M期細胞比例比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；其中C2組G0/G1期、G2/M期細胞比例高于空白對照組、DMSO組，S期細胞比例低于空白對照組、DMSO組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表3、圖1)。

Table 1 Effect of baicalin on the proliferation of human hepatocellular carcinoma cell line SMMC-7721

組別細胞增殖空白對照組2214±0231DMSO對照組2158±0215A1組2139±0454A2組2019±0518A3組1847±0428A4組1081±0416A5組0838±0384A6組0668±0494A7組0526±0571A8組0333±0359abA9組0213±0561abF值12214P值0008

注：DMSO=二甲基亞砜；與空白對照組比較，aP<0.05；與DMSO對照組比較，bP<0.05

Table 2 Effect of LY294002 on the proliferation of human hepatocellular carcinoma cell line SMMC-7721

組別細胞增殖空白對照組4234±0042DMSO對照組3634±0031B1組3881±0011B2組3578±0015B3組3321±0143B4組2554±0011B5組2178±0121B6組1697±0074abF值14234P值0004

注：與空白對照組比較，aP<0.05；與DMSO對照組比較，bP<0.05

Table 3 Effect of baicalin on cell cycle of human hepatocellular carcinoma cell line SMMC-7721

組別G0/G1期S期G2/M期空白對照組5546±2143771±101683±215DMSO組5616±1873725±132658±321C1組7568±1541870±151561±101C2組8128±221ab1049±162ab822±141abF值9454806311372P值002600380001

注：與空白對照組比較，aP<0.05；與DMSO組比較，bP<0.05

2.3 黃芩素對人肝癌細胞系SMMC-7721細胞數(shù)量的影響 空白對照組、DMSO組、D1～D4組細胞數(shù)量比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；其中D4組細胞數(shù)量少于空白對照組、DMSO組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表4、圖2)。

2.4 黃芩素或LY294002對人肝癌細胞系SMMC-7721早期凋亡和晚期凋亡的影響 空白對照組、DMSO組、E1組、E2組早期凋亡和晚期凋亡比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見表5、圖3)。

Table 4 Effect of baicalin on the cell amount of human hepatocellular carcinoma cell line SMMC-7721

組別細胞數(shù)量空白對照組4214±0018DMSO組3473±0044D1組3461±0074D2組3590±0025D3組3651±0043D4組2474±0025abF值8763P值0035

注：與空白對照組比較，aP<0.05；與DMSO組比較，bP<0.05

Table 5 Effects of baicalin or LY294002 on early apoptosis and late apoptosis of human hepatocellular carcinoma cell line SMMC-7721

組別早期凋亡晚期凋亡空白對照組440±008353±009DMSO組379±005307±006E1組374±006219±003E2組358±003214±005F值82429665P值04630384

2.5 黃芩素或LY294002對人肝癌細胞系SMMC-7721細胞增殖相關(guān)因子ERK1/2、CyclinD1、GSK-3β、AKT mRNA表達水平的影響 空白對照組、DMSO組、F1～F3組ERK1/2、CyclinD1、GSK-3β、AKT mRNA表達水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；其中F3組ERK1/2、CyclinD1、GSK-3β、AKT mRNA表達水平均低于空白對照組、DMSO組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表6)。

2.6 黃芩素或LY294002對人肝癌細胞系SMMC-7721細胞增殖相關(guān)蛋白P-ERK1/2、CyclinD1、P-GSK-3β、P-AKT表達水平的影響 空白對照組、DMSO組、G1～G3組P-ERK1/2、CyclinD1、P-GSK-3β、P-AKT表達水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；其中G3組P-ERK1/2、CyclinD1、P-GSK-3β、P-AKT表達水平低于空白對照組、DMSO組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表7)。

Table 6 Effects of baicalin or LY294002 on the expression levels of the correlation factors of cell proliferation as ERK1/2,CyclinD1,GSK-3β and AKT mRNA in human hepatocellular carcinoma cell line SMMC-7721

組別ERK1/2CyclinD1GSK-3βAKT空白對照組126±008124±004126±004128±002DMSO組132±006122±008119±005129±004F1組084±008086±004081±009104±009F2組075±009069±004074±008081±007F3組034±005ab036±005ab039±002ab039±003abF值12748117831629411343P值<0001<0001<00010002

注：與空白對照組比較，aP<0.05；與DMSO組比較，bP<0.05；ERK=細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶，CyclinD1=周期素D1，GSK-3β=糖原合成酶激酶-3β，AKT=絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶

Table 7 Effects of baicalin or LY294002 on the expression of P-ERK1/2,CyclinD1,P-GSK-3β,P-AKT and in human hepatocellular carcinoma cell line SMMC-7721

組別P-ERK1/2CyclinD1P?GSK-3βP-AKT空白對照組118±008115±004119±004114±012DMSO組121±006118±009123±005121±021G1組085±009079±005083±009101±022G2組066±009068±004067±009082±028G3組034±004ab036±005ab044±004ab043±001abF值13475126551334812212P值<0001<0001<0001<0001

注：與空白對照組比較，aP<0.05；與DMSO組比較，bP<0.05；P-ERK1/2=磷酸化ERK1/2，P-GSK-3β=磷酸化GSK-3β，P-AKT=磷酸化AKT

注：DMSO=二甲基亞砜

圖1 流式細胞術(shù)檢測黃芩素或LY294002對人肝癌細胞系SMMC-7721細胞周期的影響

Figure 1 Effect of baicalein or LY294002 on cell cycle of human hepatocellular carcinoma cell line SMMC-7721 detected by flow cytometry

圖2 顯微攝影檢測黃芩素對人肝癌細胞系SMMC-7721細胞數(shù)量的影響

圖3 流式細胞術(shù)檢測黃芩素或LY294002對人肝癌細胞系SMMC-7721早期凋亡和晚期凋亡的影響

Figure 3 Effect of baicalein or LY294002 on early apoptosis and late apoptosis of human hepatocellular carcinoma cell line SMMC-7721 by flow cytometry detection

3 討論

原發(fā)性肝癌是臨床上常見的惡性腫瘤之一，據(jù)統(tǒng)計，全世界每年新發(fā)肝癌患者約60萬，居惡性腫瘤的第五位[10]。針對肝癌的治療方式眾多，但療效欠佳，嚴重影響患者的生存質(zhì)量[11]。中藥對肝癌等腫瘤的治療作用逐漸被人們認可，并取得較好的治療效果[12]。黃芩素提取于唇形科植物高黃芩，具有抗感染、抗腫瘤、抗氧化、抗微生物和解熱等作用，主要用于降低腦血管阻力，改善腦血循環(huán)以及抑制乳腺癌等腫瘤增殖、侵襲、生長等[13]。而LY294002是PI-3K信號通路抑制劑，在腫瘤增殖、凋亡中發(fā)揮重要作用[14]。但黃芩素和LY294002在肝癌中的具體作用和機制尚未闡明。

本研究結(jié)果顯示，A8組、A9組細胞增殖水平低于空白對照組、DMSO對照組，D4組細胞數(shù)量少于空白對照組、DMSO組，B6組細胞增殖水平低于空白對照組、DMSO對照組，說明黃芩素與LY294002均可顯著抑制人肝癌細胞系SMMC-7721細胞增殖。C2組G0/G1期、G2/M期細胞比例高于空白對照組、DMSO組，S期細胞比例低于空白對照組、DMSO組，說明黃芩素與LY294002聯(lián)合作用可抑制人肝癌細胞系SMMC-7721細胞周期?？瞻讓φ战M、DMSO組、E1組、E2組早期凋亡和晚期凋亡無差異，說明黃芩素與LY294002不影響人肝癌細胞系SMMC-7721細胞凋亡。細胞周期的超?？焖俎D(zhuǎn)換或檢查點的破壞將導致失控的肝癌細胞生長，引起肝癌的發(fā)生發(fā)展。細胞周期中發(fā)揮關(guān)鍵作用的是CyclinD1，當CyclinD1表達水平異常升高可導致G1期至S期轉(zhuǎn)換速度增加，進而促進腫瘤的進展[15-16]。而本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)3組CyclinD1 mRNA表達水平均低于空白對照組、DMSO組，G3組CyclinD1表達水平低于空白對照組、DMSO組，說明黃芩素和LY294002聯(lián)合作用肝癌細胞后，可通過抑制CyclinD1表達進而導致細胞周期G1/S期發(fā)生改變，抑制肝癌細胞增殖。ERK通過磷酸化反應(yīng)可調(diào)節(jié)某些轉(zhuǎn)錄因子的活性，促進P-ERK入核增多，使其下游因子c-fos表達水平增加，進而促進c-fos和c-jun二聚化形成AP-1，引起致癌作用[17-19]。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)3組ERK1/2 mRNA表達水平均低于空白對照組、DMSO組，G3組P-ERK1/2表達水平低于空白對照組、DMSO組，證實黃芩素和LY294002聯(lián)合作用肝癌細胞后可通過下調(diào)ERK表達水平抑制P-ERK1/2，進而進一步抑制肝癌細胞增殖。PI-3K/AKT作為重要的信號通路，AKT磷酸化后，可增加腫瘤細胞的運動能力，增強對生長因子受體的調(diào)節(jié)，降低細胞間的黏附力，參與細胞增殖和凋亡，可抑制腫瘤細胞凋亡，發(fā)揮抗凋亡作用。LY294002是PI-3K的特異性抑制劑，能完全抑制PI-3K的活性，進而發(fā)揮抗腫瘤作用[14,20]。既往研究證實，黃芩素可通過調(diào)控PI-3K以及ERK信號通路發(fā)揮抗癌作用[13]。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)3組AKT mRNA表達水平均低于空白對照組、DMSO組，G3組P-AKT表達水平低于空白對照組、DMSO組，說明黃芩素和LY294002聯(lián)合作用肝癌細胞后可調(diào)控PI-3K/AKT信號通路。P-GSK-3β可導致核因子(NF)-κB活化，進入細胞核，進而促進腫瘤細胞DNA轉(zhuǎn)錄，導致腫瘤細胞增殖[21]。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)3組GSK-3β mRNA表達水平均低于空白對照組、DMSO組，G3組P-GSK-3β表達水平低于空白對照組、DMSO組，說明黃芩素和LY294002聯(lián)合作用于肝癌細胞后可抑制P-GSK-3β。綜上，黃芩素和LY294002可抑制肝癌細胞的增殖，黃芩素和LY294002聯(lián)合作用可調(diào)控細胞周期關(guān)鍵蛋白CyclinD1表達，抑制P-ERK1/2、P-GSK-3β、P-AKT，進而抑制肝癌細胞周期G1/S期的轉(zhuǎn)變。

本研究尚存在一定的局限性，目前僅在細胞水平證實了黃芩素和LY294002對肝癌的作用，但尚未在動物模型中深入研究其作用和相關(guān)機制，且具體治療效果還有待于臨床評估。

綜上所述，黃芩素和LY294002可抑制人肝癌細胞系SMMC-7721細胞增殖，但不影響其凋亡。本研究為肝癌治療方式的選擇提供新的選擇和理論依據(jù)。

作者貢獻：夏國棟進行實驗設(shè)計與實施、資料收集整理、撰寫論文、成文并對文章負責；夏紀毅負責對具體細節(jié)進行修正，汪楓、喻小蘭、王曉燕、唐利、曹勇、唐小平進行實驗實施、評估。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：崔麗紅)

Effects of Baicalein and LY294002 on Proliferation and Apoptosis of Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line SMMC-7721

WANGFeng1,YUXiao-lan2,XIAJi-yi3,5,WANGXiao-yan3,TANGLi3,CAOYong3,TANGXiao-ping3,XIAGuo-dong4*

1.DepartmentofEducationalAdministration,theAffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou646000,China2.DepartmentofObstetricsandGynecology，theAffiliatedTCMHospitalofSouthWestMedicalUniversity,Luzhou646000,China3.DepartmentofExperimentalMedicineCenter,theAffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou646000,China4.DepartmentofGastroenterology,theAffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou646000,China5.DepartmentoftheScienceandTechnology,SouthwestMedicalUniversity,Luzhou646000,China

*Correspondingauthor:XIAGuo-dong,Associateprofessor;E-mail:xjyi0615@163.com

Objective To study the effects of baicalein and LY294002 on proliferation and apoptosis of human hepatocellular carcinoma cell line SMMC-7721.Methods From March 2015 to January 2016,human hepatocellular carcinoma cell line SMMC-7721 was cultured in vitro to produce cell suspension.The cells were treated by baicalein(1,2,5,10,20,50,100,200,300 μmol/L,and were respectively named A1,A2,A3,A4,A5,A6,A7,A8,and A9 group),or LY294002(1,2,5,10,20,30 μmol/L,and were respectively named B1,B2,B3,B4,B5,and B6 group).The blank control group and DMSO control group were set up,and the cell proliferation level of SMMC-7721 was measured by CCK8 kit;20 μmol/L baicalein alone(C1 group) or combined with 10 μmol/L LY294002(C2 group) was added to SMMC-7721,the blank control group and DMSO group were set up,and the cell cycle was detected by flow cytometry;2,5,10,20 μmol/L baicalein(D1,D2,D3,D4 group were named respectively) was added to SMMC-772,the blank control group and DMSO group were set up,and the cell amount in each group was analyzed by microscopy;20 μmol/L baicalein alone(E1 group) or combined with 10 μmol/L LY294002(E2 group) was added to SMMC-7721,the blank control group and DMSO group were set up,and the early and late apoptosis in each group were measured by flow cytometry;20 μmol/L baicalein alone(F1 group),10 μmol/L LY294002 alone(F2 group) or combination of these two(F3 group) was added to SMMC-7721,the blank control group and DMSO group were set up,and the expression level of ERK1/2,CyclinD1,GSK-3β,AKT mRNA was detected by real-time fluorescence quantification PCR(Real-time PCR);20 μmol/L baicalein alone(G1 group),10 μmol/L LY294002 alone(G2 group) or combination of these two(G3 group) was added to SMMC-7721,the blank control group and DMSO control group were set up,and the expression level of P-ERK1/2,CyclinD1,P-GSK-3β,and P-AKT was analyzed by Western blotting method.Results The cell proliferation level in A8 group,A9 group and B6 group was lower than that in blank control group and DMSO control group(P<0.05).The cell ratio at G0/G1and G2/M period in C2 group was higher than that in blank control group and DMSO group,while the ratio at S period was lower than that in blank control group and DMSO group(P<0.05).The cell amount in D4 group was fewer than that in blank control group and DMSO group(P<0.05).There was no significant difference in early and late apoptosis among blank control group,DMSO group,E1 group and E2 group(P>0.05).The expression level of ERK1/2,CyclinD1,GSK-3β,AKT mRNA in F3 group was lower than that in blank control group and DMSO group(P<0.05).The expression level of P-ERK1/2,CyclinD1,P-GSK-3β and P-AKT in G3 group was lower than that in blank control group and DMSO group(P<0.05).Conclusion Baicalein and LY294002 can inhibit the cell proliferation of human hepatocellular carcinoma cell line SMMC-7721,but they cannot influence its apoptosis.

Liver neoplasms;Cell proliferation;Apoptosis;Baicalein;LY294002;Human liver cancer cell line SMMC-7721

四川省科技廳-瀘州市人民政府-瀘州醫(yī)學院2014年聯(lián)合科研項目(14JC01383-LH53)

R 735.7

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2017.03.012

2016-08-19；

2016-12-01)

1.646000 四川省瀘州市，西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院教務(wù)部

2.646000 四川省瀘州市，西南醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院婦產(chǎn)科

3.646000 四川省瀘州市，西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院醫(yī)學實驗中心

4.646000 四川省瀘州市，西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院消化內(nèi)科

5.646000 四川省瀘州市，西南醫(yī)科大學科技處

*通信作者：夏國棟，副教授；E-mail：xjyi0615@163.com