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    Sanger測(cè)序法和突變擴(kuò)增阻滯系統(tǒng)法檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌EGFR基因19、21號(hào)外顯子突變的臨床價(jià)值比較

    2017-02-17 01:52:04王建華李紀(jì)鵬金明威李珊鳳
    浙江醫(yī)學(xué) 2017年2期
    關(guān)鍵詞:外顯子基因突變測(cè)序

    王建華 李紀(jì)鵬 金明威 李珊鳳

    Sanger測(cè)序法和突變擴(kuò)增阻滯系統(tǒng)法檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌EGFR基因19、21號(hào)外顯子突變的臨床價(jià)值比較

    王建華 李紀(jì)鵬 金明威 李珊鳳

    目的 比較Sanger測(cè)序法和突變擴(kuò)增阻滯系統(tǒng)(ARMS)法檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)EGFR基因19、21號(hào)外顯子突變的臨床價(jià)值。方法收集經(jīng)病理組織學(xué)確診的NSCLC患者肺部原發(fā)或轉(zhuǎn)移癌標(biāo)本102例,其中石蠟包埋組織75例,病理活檢標(biāo)本27例;采用Sanger測(cè)序法和ARMS法檢測(cè)上述標(biāo)本EGFR基因19、21號(hào)外顯子突變情況,分析其與患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系。結(jié)果ARMS法突變檢出率為48.0%(49/102),高于Sanger測(cè)序法的32.3%(31/96),兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。病理活檢組織ARMS法突變檢出率為57.1%(12/21),明顯高于Sanger測(cè)序法的23.8%(5/21),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);石蠟包埋組織ARMS法和Sanger測(cè)序法突變檢出率分別為49.3%(37/75)和34.7%(26/75),兩者比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。女性患者EGFR基因突變檢出率68.0%高于男性患者的28.8%,未吸煙患者突變檢出率65.5%高于吸煙患者的27.7%,腺癌患者突變檢出率62.3%高于鱗癌患者的26.8%,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05);但EGFR基因突變檢出率和有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及年齡比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。結(jié)論EGFR基因19、21號(hào)外顯子突變好發(fā)于女性、未吸煙患者和腺癌患者,Sanger測(cè)序法對(duì)大組織樣本及未知突變檢測(cè)更有優(yōu)勢(shì),ARMS法對(duì)病理活檢、微小樣本及要求靈敏度高的樣本檢測(cè)更為適合,結(jié)合2種方法檢測(cè)結(jié)果更為全面可靠。

    非小細(xì)胞肺癌 表皮生長(zhǎng)因子受體 基因突變 外顯子 Sanger測(cè)序 ARMS法

    【Key words】Non-small lung cancerEpidermal growth receptorGene mutation Exon Sanger sequencing Amplification refractory mutation system assay

    肺癌是我國(guó)發(fā)病率及病死率最高的惡性腫瘤之一,其中80%以上為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC),患者5年生存率不足20%[1]。研究發(fā)現(xiàn)表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域存在突變的肺癌患者對(duì)靶向藥物具有高度敏感性[2]。EGFR基因突變是臨床藥物治療選擇的一個(gè)重要因素[3-4],突變主要集中在EGFR基因19、21號(hào)外顯子上。晚期肺癌患者主要采用放療加化療加靶向藥物治療模式[5],因而需要明確EGFR基因突變類(lèi)型及其相關(guān)臨床病理學(xué)特征以便篩選出受益的優(yōu)勢(shì)人群。本文通過(guò)Sanger測(cè)序法和突變擴(kuò)增阻滯系統(tǒng)(amplification refractory mutation system,ARMS)法對(duì)102例NSCLC患者組織標(biāo)本進(jìn)行EGFR基因突變檢測(cè),比較不同腫瘤組織標(biāo)本的EGFR基因中19、21號(hào)外顯子突變情況及其臨床病理學(xué)特征,為臨床選擇最佳治療方案提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    1 對(duì)象和方法

    1.1 對(duì)象 收集2013年10月至2015年5月在本院就診且經(jīng)病理組織學(xué)確診的NSCLC患者肺部原發(fā)或轉(zhuǎn)移癌標(biāo)本102例,其中男52例,女50例;年齡36~85歲,中位年齡65歲;石蠟包埋組織75例,病理活檢標(biāo)本27例;病理分型依據(jù)肺癌WHO分型標(biāo)準(zhǔn):腺癌61例,鱗癌41例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移87例,未轉(zhuǎn)移15例。樣本入組標(biāo)準(zhǔn):5~10μm石蠟切片要求不少于10片,石蠟塊中組織區(qū)域占30%及以上,新鮮組織細(xì)胞不少于0.5g。

    1.2 主要儀器及試劑 Mastercycler nexus梯度PCR儀(德國(guó)Eppendorf公司),ABI3500測(cè)序儀(美國(guó)ABI公司)、ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)、日立雙光束紫外分光光度計(jì)U-2900(日本日立公司)、石蠟組織DNA提取試劑盒(56404)(QIAamp DNA FFPE Tissue Kit)(德國(guó)Qiagen公司),人類(lèi)EGFR基因3種突變檢測(cè)試劑盒ADx-EG04(熒光PCR法)(廈門(mén)艾德生物公司),2×Taq PCR Master Mix擴(kuò)增試劑盒(KT-201)(北京天根生化科技有限公司),瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒普通離心柱型(DP209-02)(北京天根生化科技有限公司),Bigdye terminator V3.1(美國(guó)ABI公司),擴(kuò)增合成引物(上海生工生物工程有限公司)。

    1.3 研究方法 石蠟或新鮮組織裝入1.5ml EP管,分別按照石蠟組織DNA提取試劑盒和新鮮組織DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)操作提取DNA,紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度,提取的目的DNA在-20℃保存。

    1.3.1 Sanger測(cè)序法 采用2×Taq PCR Master Mix試劑盒分別擴(kuò)增EGFR基因19、21號(hào)外顯子,引物擴(kuò)增序列設(shè)計(jì)見(jiàn)表1,由上海生工生物工程有限公司合成。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體積為50μl,包括目的DNA 2μl、2×PCR反應(yīng)緩沖液25μl、正反向引物(10μM)各2μl,ddH2O補(bǔ)足至50μl。循環(huán)參數(shù):94℃預(yù)變性5min;94℃30s,55℃30s,72℃1min,共35個(gè)循環(huán);72℃延伸5min。反應(yīng)結(jié)束后,取50μl擴(kuò)增后產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳,切膠回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,于-20℃保存,以進(jìn)行后續(xù)的操作。采用Bigdye terminator V3.1試劑盒進(jìn)行測(cè)序反應(yīng),反應(yīng)總體積為 5μl,Bigdye 0.2μl,5×Bigdye sequence buffer 1μl,正反向引物0.5μl,PCR純化產(chǎn)物 1μl,用ddH2O補(bǔ)足到5μl。測(cè)序反應(yīng)程序?yàn)?6℃ 1min;96℃10s,50℃5s,60℃4min,共30個(gè)循環(huán);60℃保溫。測(cè)序產(chǎn)物純化程序?yàn)?μl 125mM EDTA(pH 8.0)加入15μl無(wú)水乙醇,避光4℃靜置15min,4℃3 800g離心30min,倒置安放離心1min,加入70%無(wú)水乙醇70μl,離心15min,重新洗1次離心8min,倒置離心5s,靜置安放,待乙醇蒸發(fā)干凈。加入10μl HiDi溶解DNA,95℃變性5min,4℃10min,在ABI3500基因測(cè)序儀上進(jìn)行雙向測(cè)序,測(cè)序結(jié)果用Blast軟件對(duì)比分析。在高質(zhì)量測(cè)序峰圖的前提下進(jìn)行結(jié)果判讀,野生型為高質(zhì)量單峰;突變型為測(cè)序峰圖中出現(xiàn)套峰或雙峰,序列出現(xiàn)缺失或錯(cuò)義。

    表1 EGFR基因19、21號(hào)外顯子PCR擴(kuò)增引物序列

    1.3.2 ARMS法 將收集的樣本根據(jù)人類(lèi)EGFR基因突變檢測(cè)試劑盒(熒光PCR法)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行突變檢測(cè),每次檢測(cè)程序都作陽(yáng)性和陰性質(zhì)控對(duì)照。每個(gè)8連管孔中待測(cè)樣本DNA濃度調(diào)整為:石蠟包埋切片樣本2~3ng/μl(即每單個(gè)反應(yīng)管添加DNA量為10~15ng),病理活檢組織0.4~1ng/μl(即每單個(gè)反應(yīng)管添加DNA量為2~5ng),樣品DNA使用TE(pH 8.0)稀釋?zhuān)珹BI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測(cè)。PCR擴(kuò)增參數(shù)為:95℃預(yù)變性5min;95℃25s,64℃20s,72℃20s,共15個(gè)循環(huán);93℃25s,60℃35s,72℃20s,共26個(gè)循環(huán)。根據(jù)試劑說(shuō)明書(shū)對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行判斷:突變檢測(cè)管中FAM信號(hào)擴(kuò)增曲線(xiàn)的Ct值<29,則樣品為陽(yáng)性;若FAM擴(kuò)增信號(hào)曲線(xiàn)的Ct值≥29,則樣品為陰性。

    1.3.3 EGFR基因突變與臨床病理特征的關(guān)系 以ARMS法檢測(cè)結(jié)果為前提,對(duì)EGFR基因突變與臨床病理特征(包括性別、年齡、有無(wú)吸煙、組織類(lèi)型及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)的關(guān)系進(jìn)行分析。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)或配對(duì)χ2檢驗(yàn)。

    2 結(jié)果

    2.1 2種方法突變檢出情況比較 ARMS法成功檢測(cè)102例標(biāo)本,其中49例(48.0%)為EGFR突變;Sanger測(cè)序法成功檢測(cè)96例標(biāo)本,其中31例(32.3%)為EGFR突變;ARMS法突變檢出率高于Sanger測(cè)序法,兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表2。ARMS法檢出的49例突變標(biāo)本中,29例為19號(hào)外顯子缺失突變,20例為21號(hào)外顯子的錯(cuò)義突變,見(jiàn)圖1。Sanger測(cè)序法檢出的31例突變標(biāo)本中,17例為19號(hào)外顯子缺失突變,14例為21號(hào)外顯子錯(cuò)義突變,見(jiàn)圖2。

    表2 2種方法檢測(cè)EGFE基因19、21號(hào)外顯子突變結(jié)果比較

    圖1 ARMS法檢測(cè)EGFR基因19、21號(hào)外顯子突變結(jié)果

    圖2 Sanger測(cè)序法檢測(cè)EGFR基因19、21號(hào)外顯子突變結(jié)果

    2.2 2種方法檢測(cè)不同組織標(biāo)本突變檢出情況比較為較好比較2種方法,排除Sanger測(cè)序法測(cè)序失敗的6例病理活檢標(biāo)本。對(duì)病理活檢標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果顯示,ARMS法突變檢出率為57.1%(12/21),明顯高于Sanger測(cè)序法的23.8%(5/21),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.842,P<0.05);對(duì)石蠟包埋組織的檢測(cè)結(jié)果顯示,ARMS法突變檢出率為49.3%(37/75),Sanger測(cè)序法突變檢出率為34.7%(26/75),兩者比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.311,P>0.05)。

    2.3 EGFR基因突變檢出率與臨床病理特征的關(guān)系女性患者EGFR基因突變檢出率明顯高于男性患者,未吸煙患者EGFR基因突變檢出率明顯高于吸煙患者,腺癌患者EGFR基因突變檢出率明顯高于鱗癌患者,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05);但EGFR基因突變檢出率和有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及年齡比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05),見(jiàn)表3。

    表3 EGFR基因突變檢出率與臨床病理特征關(guān)系分析

    3 討論

    本研究結(jié)果顯示Sanger測(cè)序法檢測(cè)出31例發(fā)生EGFR基因突變,突變檢出率為32.3%;ARMS法檢測(cè)出49例發(fā)生EGFR基因突變,突變檢出率為48.0%。EGFR基因突變好發(fā)于女性、未吸煙患者和腺癌患者,這與孫孟紅等[6]報(bào)道結(jié)果一致。董剛強(qiáng)等[7]對(duì)394例肺癌EGFR基因突變情況進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)EGFR基因突變主要發(fā)生在19和21號(hào)外顯子,以19號(hào)外顯子的del-E746-A750缺失突變和21號(hào)外顯子的L858R點(diǎn)突變?yōu)樽畛R?jiàn)的突變形式,其中19號(hào)外顯子del-E746-A750缺失突變約占其總突變率的74%,21號(hào)外顯子的L858R點(diǎn)突變約占其總突變的94.4%,而19號(hào)外顯子的del-L747-P753insS突變和21號(hào)外顯子的L861Q突變僅占各自突變的2.7%和3.7%。本研究采用Sanger測(cè)序法和ARMS法均只檢測(cè)到19號(hào)外顯子del-E746-A750缺失突變和21號(hào)外顯子L858R點(diǎn)突變,這可能與檢測(cè)樣本量偏少和其他類(lèi)型突變發(fā)生率本身較低有關(guān)。

    Sanger測(cè)序法被認(rèn)為是檢測(cè)EGFR基因突變的金標(biāo)準(zhǔn),其優(yōu)勢(shì)在于對(duì)已知和未知突變都有良好的檢測(cè)重復(fù)性,其局限是靈敏度低,要求突變細(xì)胞不低于總標(biāo)本的20%以上,操作耗時(shí)長(zhǎng),結(jié)果判讀復(fù)雜[8],并且測(cè)序結(jié)果判讀依賴(lài)于測(cè)序峰中是否出現(xiàn)突變波峰。在獲得目的片段時(shí),目的基因的突變與非突變區(qū)域都被擴(kuò)增,因此當(dāng)組織中腫瘤細(xì)胞少,或突變腫瘤克隆少時(shí),引起突變峰低甚至無(wú)法檢測(cè),導(dǎo)致結(jié)果假陰性。ARMS法其優(yōu)勢(shì)在于檢測(cè)靈敏度高,檢測(cè)周期短,操作簡(jiǎn)便,尤其適合微小組織標(biāo)本[9];其局限性在于檢測(cè)成本高,只針對(duì)已知突變進(jìn)行檢測(cè)。

    2種方法對(duì)不同標(biāo)本類(lèi)型檢測(cè)結(jié)果來(lái)看,Sanger測(cè)序法和ARMS法對(duì)于含有效腫瘤組織標(biāo)本的檢測(cè)有較好的檢測(cè)一致性,而對(duì)于小的活檢標(biāo)本,ARMS法檢測(cè)優(yōu)勢(shì)更為明顯。本研究中,Sanger測(cè)序法對(duì)6例病理活檢標(biāo)本檢測(cè)失敗,分析原因可能是:(1)對(duì)標(biāo)本處理及獲得目的片段過(guò)程中引起標(biāo)本DNA片段化,其擴(kuò)增長(zhǎng)度低于測(cè)序檢測(cè)要求;(2)腫瘤取材越少對(duì)腫瘤整體基因代表性越差,因而腫瘤細(xì)胞比例較低的活檢標(biāo)本無(wú)法達(dá)到測(cè)序檢測(cè)下限。為了得到較為準(zhǔn)確的結(jié)果,需選用靈敏度較高、對(duì)標(biāo)本質(zhì)量要求低的檢測(cè)方法。趙婧雅等[10]采用Sanger測(cè)序法和ARMS法對(duì)NSCLC活檢小標(biāo)本EGFR基因進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)Sanger測(cè)序法突變檢出率低,且檢出結(jié)果對(duì)臨床TKI療效可靠性下降,因此對(duì)活檢標(biāo)本應(yīng)選擇檢出率及靈敏度更高的ARMS法。

    綜上所述,比較NSCLC的EGFR基因突變的2種檢測(cè)方法,Sanger測(cè)序法對(duì)大組織樣本及未知突變檢測(cè)更有優(yōu)勢(shì),ARMS法對(duì)病理活檢、微小樣本及要求靈敏度高的樣本檢測(cè)更為適合,2種方法結(jié)合檢測(cè)結(jié)果更為可靠。

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    Detection of EGFR gene 19 and 21 exons mutations in non-small cell lung cancer by Sanger sequencing versus amplification refractory mutation system assay

    ObjectiveTo compare Sanger sequencing and amplification refractory mutation system(ARMS)assay in detection of EGFR gene 19 and 21 exons mutations in non-small cell lung cancer(NSCLC).MethodsOne hundred and two NSCLC specimens,including 75 paraffin tissue samples and 27 biopsy specimens were collected.Mutations of EGFR gene 19 and 21 exons were detected by Sanger sequencing and ARMS assay.The association of gene mutations with clinicopathological features of NSCLC was analyzed.ResultsThe mutation rates of ARMS assay and Sanger sequencing were 48.0%(49/102)and 32.3%(31/96),respectively(P<0.05).In biopsy tissue samples,the mutation rate detected by ARMS(57.1%,12/21)was significantly higher than that by Sanger sequencing(23.8%,5/21,P<0.05),however,there was no significant difference in mutation rate of paraffin embedded specimens between two methods(49.3%,37/75 vs 34.7%,26/75,P>0.05).According to ARMS results,the EGFR mutation rate was higer in female patients(68.0%)than in male patients(28.8%),in non-smoking patients (65.5%)higher than that in smoking patients(27.7%),in adenocarcinomas(62.3%)higher than that in squamous cell carcinomas (26.8%)(allP<0.05).The EGFR mutation rate was not correlated with the age and lymphatic metastasis of patients(allP>0.05).ConclusionThe mutation rates of EGFR 19 and 21 exons were higher in NSCLC patients,especially in non-smoking,female and adenocarinoma patients.Sanger sequencing method has more advantages for large tissue samples,and the ARMS method is more suitable for biopsy and small samples.Therefore,the combination of two methods may provide more reliable and comprehensive test results.

    2016-09-09)

    (本文編輯:陳麗)

    315040 寧波市鄞州人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室

    王建華,E-mail:wjhua530@163.com

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