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    兒童急性B淋巴細(xì)胞白血病致癌基因FGFR3表達(dá)對(duì)預(yù)后的影響研究

    2017-02-17 01:52:04吳靜怡周劍峰裴仁治張丕勝劉旭輝杜小紅
    浙江醫(yī)學(xué) 2017年2期
    關(guān)鍵詞:白血病分型淋巴細(xì)胞

    吳靜怡 周劍峰 裴仁治 張丕勝 劉旭輝 杜小紅

    兒童急性B淋巴細(xì)胞白血病致癌基因FGFR3表達(dá)對(duì)預(yù)后的影響研究

    吳靜怡 周劍峰 裴仁治 張丕勝 劉旭輝 杜小紅

    目的 分析急性B淋巴細(xì)胞白血?。˙-ALL)患兒成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體3(FGFR3)基因的表達(dá)情況,探討其在疾病預(yù)后判斷中的意義。方法采用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)52例B-ALL患兒(B-ALL組)與12例對(duì)照兒童(對(duì)照組)骨髓血中B淋巴細(xì)胞FGFR3基因表達(dá)水平;并以B-ALL組患兒FGFR3基因表達(dá)水平的中位數(shù)為界,將B-ALL組患兒分為FGFR3基因高表達(dá)組和FGFR3基因低表達(dá)組。比較FGFR3基因高表達(dá)組和FGFR3基因低表達(dá)組患兒的各項(xiàng)臨床指標(biāo);隨訪36個(gè)月,比較兩組患兒的無事件生存(EFS)率。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)B淋巴細(xì)胞免疫分型、巢式PCR法檢測(cè)B淋巴細(xì)胞融合基因,比較不同B淋巴細(xì)胞免疫分型及融合基因的B-ALL組患兒FGFR3基因表達(dá)水平。結(jié)果B-ALL組患兒FGFR3基因表達(dá)水平高于對(duì)照組兒童(1.637±0.903 vs 0.645±0.559,P<0.05)。FGFR3基因高表達(dá)組與FGFR3基因低表達(dá)組患兒性別、年齡、外周血WBC、肝脾有無腫大、有無髓外浸潤(rùn)、B淋巴細(xì)胞免疫分型及染色體核型等臨床指標(biāo)比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05)。FGFR3基因高表達(dá)組患兒EFS率低于FGFR3基因低表達(dá)組患兒(49.97%vs 76.17%,P<0.05)。B-ALL組患兒中,CD34+患兒FGFR3基因表達(dá)水平高于CD34-患兒(P<0.05),BCR/ABL+患兒FGFR3基因表達(dá)水平高于BCR/ABL-患兒(P<0.05)。結(jié)論FGFR3基因高表達(dá)與腫瘤發(fā)生、發(fā)展有關(guān),有望成為輔助評(píng)價(jià)兒童B-ALL預(yù)后的指標(biāo)。

    急性B淋巴細(xì)胞白血病 FGFR3 預(yù)后

    成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(FGFR)是一類具有自身磷酸化活性的跨膜酪氨酸激酶受體,在細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、遷移及血管發(fā)生、傷口愈合等生理、病理過程中發(fā)揮重要作用[1]。FGFR3是FGFR家族一員,其在膀胱癌中高表達(dá),且與腫瘤轉(zhuǎn)移及淋巴結(jié)浸潤(rùn)密切相關(guān)[2]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)約25%多發(fā)性骨髓瘤患者發(fā)生t(4;14)(p16.3;q32.3)基因易位,導(dǎo)致FGFR3基因過度表達(dá)而致瘤[3]。FGFR3基因定位于染色體4pl 6.3,跨越16.5 kb,共含19個(gè)外顯子,是已被確認(rèn)的致癌基因。本研究旨在分析FGFR3基因在急性B淋巴細(xì)胞白血病(B-ALL)患兒B淋巴細(xì)胞中的表達(dá)情況,探討其在疾病預(yù)后判斷中的意義,現(xiàn)報(bào)道如下。

    1 對(duì)象和方法

    1.1 對(duì)象 選取2006年6月至2015年3月在寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鄞州醫(yī)院初診的B-ALL患兒52例(BALL組),采用MICM分型診斷。其中男33例,女19例;年齡0.25~16歲,中位年齡10歲;同時(shí)記錄患兒初診時(shí)外周血WBC、PLT、肝脾有無腫大、有無髓外浸潤(rùn)、B淋巴細(xì)胞免疫分型及染色體核型等臨床指標(biāo)?;純壕础秲和疉LL診療建議》[4]進(jìn)行危險(xiǎn)度分組,并參照該建議治療;1個(gè)療程結(jié)束后,根據(jù)《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》[5]評(píng)價(jià)療效,隨訪3年。選取同期健康兒童10例及缺鐵性貧血患兒2例作為對(duì)照組。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn),患兒、對(duì)照兒童監(jiān)護(hù)人均知情同意并簽署知情同意書。

    1.2 試劑和儀器 人淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程醫(yī)學(xué)研究所,Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司,RNA酶抑制劑購(gòu)自華美生物工程公司,M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自美國(guó)Promega公司,Taq DNA聚合酶購(gòu)自加拿大Fermentas公司,SYBR Green Realtime PCR Master Mix購(gòu)自上海東洋紡生物科技有限公司,所有流式試劑均購(gòu)自美國(guó)BD公司。PRISM 7300實(shí)時(shí)定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司,ChemilmagerTM5500型凝膠成像分析系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Alpha Innotech公司,四色數(shù)字化流式細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)Beckman Coulter公司。

    1.3 方法

    1.3.1 FGFR3基因?qū)崟r(shí)定量PCR檢測(cè) 抽取B-ALL組患兒及對(duì)照組兒童骨髓血3~5ml,淋巴細(xì)胞分離液分離骨髓B淋巴細(xì)胞,Trizol一步法抽取總RNA,按試劑盒說明書操作步驟合成cDNA鏈。FGFR3基因上游引物5′-TTAACACTTCTTACGCAATGCT-3′,下游引物5′-GCCCAGTAACAGTACAGAACGA-3′,擴(kuò)增片段長(zhǎng)度110bp。內(nèi)參GAPDH基因上游引物5′-CTTAGCACCCCTGGCCAAG-3′,下游引物5'-CATGCCATCACTGCCACCCAGAAGA-3′,擴(kuò)增片段長(zhǎng)度150bp。20μl反應(yīng)體系中含 cDNA 2μl、FGFR3及 GAPDH上下游引物(10μmol/L)各0.5μl,每份標(biāo)本均設(shè)2個(gè)復(fù)孔,每板同時(shí)設(shè)質(zhì)控對(duì)照組、陽性對(duì)照組和陰性對(duì)照組。PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性10s,95℃變性10s,60℃退火30s,72℃延伸10s,40個(gè)循環(huán),目的基因和內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率基本一致。按照相對(duì)定量法計(jì)算目的基因的相對(duì)拷貝數(shù)即表達(dá)水平,具體公式為2-△△ct,其中△Ct=目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值,△△Ct=待測(cè)標(biāo)本△Ct值-標(biāo)準(zhǔn)品△Ct值。并以B-ALL組患兒FGFR3基因表達(dá)水平的中位數(shù)為界,將B-ALL組患兒分為FGFR3基因高表達(dá)組和FGFR3基因低表達(dá)組。

    1.3.2 染色體核型分析 24h培養(yǎng)法制備B-ALL組患兒骨髓B淋巴細(xì)胞染色體,采用G帶技術(shù)顯帶,分析細(xì)胞數(shù)20個(gè)。根據(jù)《人類細(xì)胞遺傳學(xué)國(guó)際命名體制(ISCN1995)》描述核型,包括正常二倍體、超二倍體、亞二倍體、假二倍體。

    1.3.3 B淋巴細(xì)胞免疫分型檢測(cè) 應(yīng)用四色數(shù)字化流式細(xì)胞儀和相應(yīng)的配套試劑檢測(cè)B淋巴細(xì)胞的免疫分型。所有B-ALL組患兒標(biāo)本均先以CD45設(shè)門,選定CD45弱陽性和側(cè)向角散射較小區(qū)域細(xì)胞進(jìn)行分析。

    1.3.4 B淋巴細(xì)胞融合基因檢測(cè) 參照文獻(xiàn)[6]報(bào)道的巢式PCR方法,同時(shí)檢測(cè)B-ALL組患兒骨髓B淋巴細(xì)胞融合基因。擴(kuò)增產(chǎn)物取10μl進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳,溴化乙錠染色,凝膠成像掃描系統(tǒng)分析,根據(jù)特異條帶的有無分別記為陽性和陰性。

    1.4 觀察指標(biāo) (1)比較B-ALL組患兒與對(duì)照組兒童FGFR3基因表達(dá)水平。(2)比較FGFR3基因高表達(dá)組與FGFR3基因低表達(dá)組患兒各臨床指標(biāo)(性別、年齡、外周血WBC、肝脾有無腫大、有無髓外浸潤(rùn)、B淋巴細(xì)胞免疫分型及染色體核型)。(3)患兒隨訪36個(gè)月,中位隨訪時(shí)間18個(gè)月,觀察比較FGFR3基因高表達(dá)組與FGFR3基因低表達(dá)組患兒疾病預(yù)后。其中無事件生存(EFS)率定義為患兒自確診之日起至任何事件發(fā)生(包括復(fù)發(fā)、第二腫瘤或死亡)或末次隨訪日期,若患兒治療效果未達(dá)完全緩解,其EFS率為0.00%。(4)比較不同B淋巴細(xì)胞免疫分型及融合基因的 B-ALL組患兒FGFR3基因表達(dá)水平。

    1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件;計(jì)量資料以表示,兩組比較采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以構(gòu)成比表示,兩組比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。采用Kaplan-Meier法估計(jì)患者的EFS率并繪制生存曲線,兩組患者EFS率的比較采用log-rank檢驗(yàn)。

    2 結(jié)果

    2.1 B-ALL組患兒與對(duì)照組兒童FGFR3基因表達(dá)水平比較 B-ALL組患兒與對(duì)照組兒童FGFR3基因表達(dá)水平分別為1.637±0.903、0.645±0.559,兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),即B-ALL患兒FGFR3基因表達(dá)水平高于對(duì)照兒童。

    2.2 FGFR3基因高表達(dá)組與FGFR3基因低表達(dá)組患兒各項(xiàng)臨床指標(biāo)比較 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果提示,F(xiàn)GFR3基因高表達(dá)組與FGFR3基因低表達(dá)組患兒各有26例。兩組患兒各臨床指標(biāo)比較見表1。

    由表1可見,兩組患兒性別、年齡、外周血WBC、肝脾有無腫大、有無髓外浸潤(rùn)、B淋巴細(xì)胞免疫分型及染色體核型等臨床指標(biāo)比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05)。

    2.3 FGFR3基因高表達(dá)組與FGFR3基因低表達(dá)組患兒疾病預(yù)后比較 兩組患兒生存曲線見圖1。

    圖1 FGFR3基因高表達(dá)組與FGFR3基因低表達(dá)組患兒生存曲線

    由圖1可見,F(xiàn)GFR3基因高表達(dá)組與與FGFR3基因低表達(dá)組患兒EFS率分別為49.97%、76.17%,兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),即FGFR3基因高表達(dá)組患兒EFS率低于FGFR3基因低表達(dá)組患兒。

    2.3 不同B淋巴細(xì)胞免疫分型的B-ALL組患兒FGFR3基因表達(dá)水平比較 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)到B-ALL組患兒B淋巴細(xì)胞免疫分型包括CD10、CD20、CD22、CD34、CD38。不同B淋巴細(xì)胞免疫分型的B-ALL組患兒FGFR3基因表達(dá)水平比較見表2。

    表1 FGFR3基因高表達(dá)組與FGFR3基因低表達(dá)組患兒各臨床指標(biāo)比較[例(%)]

    表2 不同B淋巴細(xì)胞免疫分型的B-ALL組患兒FGFR3基因表達(dá)水平比較

    由表2可見,B-ALL組患兒中,CD34+患兒FGFR3基因表達(dá)水平高于CD34-患兒(P<0.05)。

    2.4 不同B淋巴細(xì)胞融合基因的B-ALL組患兒FGFR3基因表達(dá)水平比較 巢式PCR法檢測(cè)到BALL組患兒B淋巴細(xì)胞融合基因包括HLA-DR、BCR/ ABL及TEL/AML1。不同B淋巴細(xì)胞融合基因的BALL組患兒FGFR3基因表達(dá)水平比較見表3。

    表3 不同B淋巴細(xì)胞融合基因的B-ALL組患兒FGFR3基因表達(dá)水平比較

    由表3可見,B-ALL組患兒中,BCR/ABL+患兒FGFR3基因表達(dá)水平高于BCR/ABL-患兒(P<0.05)。

    3 討論

    FGFR3屬于酪氨酸激酶家族,生理?xiàng)l件下與配體結(jié)合后形成二聚體,激活細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶,參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化及遷移。在腫瘤組織中,F(xiàn)GFR3基因發(fā)生突變導(dǎo)致以受體非依賴的方式異常激活,有研究發(fā)現(xiàn)約35%膀胱癌及25%宮頸癌組織存在FGFR3基因的突變[7]。而在血液系統(tǒng)惡性疾病如慢性髓細(xì)胞白血病、漿細(xì)胞白血病和多發(fā)性骨髓瘤中也發(fā)現(xiàn)FGFR3基因的過表達(dá)[8-9]。如將FGFR3基因高表達(dá)的骨髓細(xì)胞植入經(jīng)致死性照射的小鼠體內(nèi),所有移植后的小鼠都出現(xiàn)了惡性的血液表型,包括淋巴細(xì)胞和髓系的惡性表型[10]。這些前期研究均提示FGFR3作為一種致癌基因與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示,與對(duì)照組兒童相比,B-ALL組患兒FGFR3基因表達(dá)水平較高。對(duì)BALL組患兒的隨訪也發(fā)現(xiàn),F(xiàn)GFR3基因高表達(dá)組患兒EFS率低于FGFR3基因低表達(dá)組患兒。

    本研究發(fā)現(xiàn)B-ALL組患兒中,BCR/ABL+患兒FGFR3基因表達(dá)水平高于BCR/ABL-患兒。Dvorakova等[11]發(fā)現(xiàn)慢性粒細(xì)胞白血病患者治療后BCR/ABL拷貝數(shù)下降,F(xiàn)GFR3基因表達(dá)水平明顯下降至正常水平,當(dāng)白血病復(fù)發(fā)或進(jìn)入加速期后,F(xiàn)GFR3基因表達(dá)水平會(huì)隨BCR/ABL拷貝數(shù)上升而明顯升高。兩者在腫瘤細(xì)胞增殖過程中有明顯的相關(guān)性,另外值得注意的是BCR/ ABL酪氨酸酶是依賴Ras信號(hào)途徑激活,而FGFR3基因的激活途徑是Ras非依賴性的,因此FGFR3基因的異常激活很可能進(jìn)一步激活BCR/ABL酪氨酸酶,導(dǎo)致細(xì)胞增殖。

    本研究亦發(fā)現(xiàn) B-ALL組患兒中,CD34+患兒FGFR3基因表達(dá)水平高于CD34-B-ALL患兒。CD34抗原起源于早期造血干細(xì)胞,分化成熟后逐漸消失,在兒童ALL中表達(dá)明顯高于成人。盡管目前兒童急性淋巴細(xì)胞白血病中CD34與預(yù)后關(guān)系尚不明確,但這仍提示來源于早期造血細(xì)胞的惡性克隆更容易出現(xiàn)致癌基因FGFR3的異常表達(dá)。國(guó)外學(xué)者在慢性粒細(xì)胞白血病患者CD34+細(xì)胞及健康供者CD34+外周血干細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)FGFR3基因的異常高表達(dá)[12],這與本研究觀察到的現(xiàn)象一致。

    綜上所述,本研究結(jié)果顯示FGFR3基因高表達(dá)與腫瘤發(fā)生、發(fā)展有關(guān),有望成為輔助評(píng)價(jià)兒童B-ALL治療效果及預(yù)后的指標(biāo)。FGFR3基因及其表達(dá)產(chǎn)物的抑制劑或可作為抗腫瘤治療重要的靶向藥物,值得臨床及實(shí)驗(yàn)室進(jìn)一步研究。

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    [5]張之南,沈悌.血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)[M].3版.北京:科學(xué)技術(shù)出版社, 2008:172-173.

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    [12]Dvorak P,Dvorakova D,Doubek M,et al.Increased expression of fibroblast growth factor receptor 3 in CD34+BCR-ABL+cells from patients with chronic myeloid leukemia[J].Leukemia,2003, 17(12):2418-2425.

    Expression of FGFR3 gene in childhood acute B lymphoblastic leukemia and its relation to disease progression

    Objective To investigate the expression of fibroblast growth factor receptors 3(FGFR3)gene in childhood acute B lymphoblastic leukemia(B-ALL),and its clinical significance in disease progression.MethodsThe expression levels of FGFR3 in 52 children with B-ALL and 12 normal children were assayed by real time RT-PCR.Clinical indicators were compared between patients with high FGFR3 expression and those with low FGFR3 expression.Patients were followed up for 36 months. The event-free survival(EFS)rate was compared with single factor analysis between two groups.B lymphocyte immune classification was detected by flow cytometry and B lymphocyte fusion gene was detected by nested PCR.The expression levels of FGFR3 were compared among different immune classification and fusion gene groups.ResultsFGFR3 was over-expressed in children with B-ALL compared with normal controls (1.637±0.903 vs 0.645±0.559,P<0.05).There were no significant differences in sex,age,peripheral blood WBC count,hepatosplenomegaly,extramedullary infiltration,B lymphocyte immune classification and karyotype between low FGFR3 group and high FGFR3 group(P>0.05).The probability of 3-year EFS for patients with high FGFR3 level was significantly lower than that with low FGFR3 level(49.97%vs 76.17%,P<0.05).Expression levels of FGFR3 were significantly different between BCR/ABL+group and BCR/ABL-group(P<0.05)and between CD34+group and CD34-group(P<0.05).ConclusionOver-expression of FGFR3 may participate in malignant hematopoiesis and the detection of FGGR3 expression might be helpful in evaluation of disease progression in childhood acute B lymphoblasticleukemia.

    Acute B lymphoblastic leukemia Fibroblast growth factor receptor 3 Progression

    2015-12-10)

    (本文編輯:李媚)

    浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(LQ12H08001);浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技項(xiàng)目(2012KYB186);寧波市自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2012A610236);寧波市醫(yī)學(xué)科技計(jì)劃項(xiàng)目(2011B23)

    315000 寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鄞州醫(yī)院血液內(nèi)科(吳靜怡、裴仁治、張丕勝、劉旭輝、杜小紅);華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院血液科(周劍峰)

    裴仁治,E-mail:peirz@163.com

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