新疆赤霞珠葡萄酒發(fā)酵過程中生物胺含量的變化

王 瑞，陳新軍，吳新月，張 利，張珍珍*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊830052；2.新疆中信國(guó)安葡萄酒業(yè)有限公司，新疆昌吉830000）

新疆赤霞珠葡萄酒發(fā)酵過程中生物胺含量的變化

王 瑞1，陳新軍2，吳新月1，張 利1，張珍珍1*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊830052；2.新疆中信國(guó)安葡萄酒業(yè)有限公司，新疆昌吉830000）

利用高效液相色譜技術(shù)分析葡萄酒發(fā)酵過程中8種生物胺含量的變化。結(jié)果表明，葡萄酒發(fā)酵過程中8種生物胺總含量整體呈上升趨勢(shì)。色胺含量最高，最高可達(dá)到98.03 mg/L；腐胺和組胺含量較低，含量均不超過2.48 mg/L；精胺和亞精胺含量變化相對(duì)平穩(wěn)，波動(dòng)范圍在1.81～3.07 mg/L之間，除色胺外，其他生物胺含量均不超過4.50 mg/L。苯乙胺、尸胺、酪胺等在酒精發(fā)酵后期和蘋果酸-乳酸發(fā)酵初期大幅上升，在蘋-乳發(fā)酵后期，酪胺和亞精胺含量有所下降，其他生物胺含量均有一定程度上升。

葡萄酒；生物胺；酒精發(fā)酵；蘋果酸-乳酸發(fā)酵

生物胺是一類具有生理活性的含氮的堿性低分子有機(jī)化合物，多存在于動(dòng)植物體內(nèi)和食品（尤其是發(fā)酵食品）中。適量的生物胺是生物體（包括人體）生理代謝中的正常活性成分，如苯乙胺、兒茶胺等有助于提升人體血壓、調(diào)節(jié)神經(jīng)活動(dòng)，亞精胺則能促進(jìn)生長(zhǎng)過程中生物體蛋白質(zhì)的合成[1]。但當(dāng)生物胺的攝入量超過一定范圍時(shí)，則會(huì)產(chǎn)生頭疼、腹瀉和嘔吐等一些危害人體健康的不良反應(yīng)[2]。葡萄酒中的生物胺大多為某些微生物中的氨基酸在其相應(yīng)的脫羧酶作用下脫羧產(chǎn)生，即不同的脫羧酶催化其對(duì)應(yīng)的氨基酸進(jìn)行脫羧反應(yīng)，如苯丙氨酸經(jīng)脫羧產(chǎn)生苯乙胺，色氨酸脫羧后生成色胺等。這些氨基酸在葡萄酒發(fā)酵過程中同時(shí)也參與其他化合物的形成與轉(zhuǎn)化[3-4]。

為了降低葡萄酒中生物胺的含量，減少其對(duì)人體健康的危害，本研究以赤霞珠葡萄為原料，通過監(jiān)測(cè)在葡萄酒發(fā)酵過程中生物胺含量的變化規(guī)律，明確關(guān)鍵控制環(huán)節(jié)，旨在為日后降低葡萄酒中生物胺含量提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

赤霞珠（Cabernet Sauvignon）葡萄：產(chǎn)自新疆昌吉；甲醇、丙酮（色譜純）：美國(guó)Fisher公司；丹磺酰氯、精胺、亞精胺、組胺、酪胺、尸胺、腐胺、苯乙胺、色胺（色譜純）：美國(guó)Sigma公司；氯化鈉、乙醚（分析純）：南京化學(xué)試劑股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1200 Series高相液相色譜（high performance liquid chromatograph，HPLC）儀：美國(guó)Agilent公司；D2155W離心機(jī)：德國(guó)Sigma公司；Hc360渦旋儀：美國(guó)Merck公司；0.22μm孔徑有機(jī)相濾膜：上海安譜科學(xué)儀器有限公司；DHG-9053A恒溫箱：上海鴻都電子科技有限公司；PL303電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；酸度計(jì)：上海艾旺工貿(mào)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 葡萄酒釀造工藝流程

原料經(jīng)除梗破碎后，在10L發(fā)酵罐中添加酵母0.2g/L、乳酸菌0.015 g/L進(jìn)行發(fā)酵，其中1～27 d為酒精發(fā)酵，28～72 d為蘋乳發(fā)酵，發(fā)酵溫度控制在22～25℃，分別發(fā)酵第1、7、13、20、27、42、57和72天各獲取酒樣兩份，取樣量為250 mL。獲得新鮮的葡萄酒液后，酒樣置于-40℃冰箱。

1.3.2 樣品前處理

取葡萄酒10mL，向其中加入NaCl至飽和，用0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為12，加入5 mL正丁醇∶氯仿（1∶1）進(jìn)行萃取，漩渦振蕩5 min后，吸取上層清液，用同體積萃取液再進(jìn)行2次萃取，將萃取液合并，搖勻。取3 mL萃取液加人0.3mL的1mol/LHCl溶液，混勻。在40℃水浴條件下用氮?dú)獯蹈桑?mL（0.1mol/L）鹽酸溶液溶解殘留物待衍生。

1.3.3 生物胺標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的配制

準(zhǔn)確稱量各生物胺標(biāo)準(zhǔn)品10 mg至10 mL容量瓶中，并用0.1 mol/L鹽酸溶液溶解后定容成含量為1 000 mg/L的生物胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，封口，避光保存至4℃冰箱中。

分別吸取1 mL各生物胺的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1 000 mg/L于同一容量瓶（10 mL）中，用0.1 mol/L鹽酸溶液定容，混勻成含量為100 mg/L的生物胺標(biāo)準(zhǔn)混合使用液。量取0.10 mL、0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL、1.50 mL、2.50 mL、5.00 mL生物胺標(biāo)準(zhǔn)混合使用液，分別置于10mL容量瓶中，用0.1mol/L鹽酸溶液定容，使其含量為1.0 mg/L、2.5 mg/L、5.0 mg/L、10.0 mg/L、15.0 mg/L、25.0 mg/L、50.0 mg/L的生物胺標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，待衍生。

1.3.4 生物胺標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品提取液的衍生

吸取0.5 mL上述待衍生的生物胺標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，取1.5 mL飽和碳酸氫鈉溶液及1 mL丹磺酰氯衍生溶液（0.01 mg/L，溶劑為丙酮）置于10 mL具塞試管中，混勻。60℃避光反應(yīng)0.5h，加入100μL谷氨酸鈉溶液（50mg/mL，溶劑為飽和碳酸氫鈉溶液）后振蕩混勻，60℃反應(yīng)15 min后分別加入1 mL的超純水，40℃的水浴條件下用氮吹儀去除丙酮。加入3 mL乙醚并漩渦振蕩2 min，靜置至分層后吸取上層有機(jī)相，重復(fù)萃取兩次，合并萃取液。在40℃的條件下氮?dú)獯蹈?，加? mL的甲醇溶液溶解殘留物，混勻后用0.22 μm有機(jī)相濾膜過濾，濾液待HPLC檢測(cè)。

吸取0.5 mL樣品提取液進(jìn)行衍生，樣品提取液的衍生與生物胺標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生條件及方法相同。

1.3.5 高效液相色譜條件

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

色譜條件：Agilent XDB-C18色譜柱（150 mm×4.6 nm，5μm），柱溫30℃，進(jìn)樣量20μL，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)254nm，流動(dòng)相A：99.99%甲醇溶液，流動(dòng)相B：超純水，流速：1.5mL/min，梯度洗脫程序見表1。

1.3.7 定性定量分析

定性分析：在相同色譜條件下，對(duì)照8種生物胺標(biāo)準(zhǔn)品HPLC色譜圖出峰時(shí)間，對(duì)樣品中各生物胺進(jìn)行定性分析。

定量分析：通過HPLC色譜檢測(cè)葡萄酒樣品中各生物胺的峰面積，根據(jù)8種生物胺標(biāo)準(zhǔn)回歸方程，計(jì)算葡萄酒樣品中各生物胺的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 8種生物胺標(biāo)準(zhǔn)回歸方程的建立

對(duì)8種生物胺混合標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生處理后，采用高效液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)，以峰面積（y）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，得到8種生物胺標(biāo)準(zhǔn)回歸方程，結(jié)果見表2。

表2 8種生物胺線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限Table 2 Linear regression equation,correlation coefficient and limit of detection of eight kinds of biogenic amines

由表2可知，8種生物胺的線性回歸方程相關(guān)系數(shù)R2均＞0.992，說明峰面積與生物胺含量有良好的線性關(guān)系，能夠滿足葡萄酒樣品中生物胺含量的檢測(cè)要求。

2.2 生物胺混合標(biāo)準(zhǔn)品和葡萄酒樣品HPLC色譜圖

采用高效液相色譜法對(duì)8種生物胺混合標(biāo)品及葡萄酒樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示。

由圖1A可知，生物胺混合標(biāo)準(zhǔn)品組分在35min內(nèi)分離效果較好，出峰的時(shí)間順序?yàn)椋荷罚?.50min）、苯乙胺（14.58 min）、腐胺（17.88 min）、尸胺（20.50 min）、組胺（22.95 min）、酪胺（25.41 min）、亞精胺（27.64 min）、精胺（28.38 min）。由圖1B可知，葡萄酒樣品中各生物胺出峰順序?yàn)椋荷?、苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺、精胺，出峰時(shí)間分別為：4.51 min、14.56 min、17.87 min、20.53 min、22.92 min、25.39 min、27.62 min、28.36 min。

圖1 生物胺混合標(biāo)準(zhǔn)品(A)及葡萄酒樣品(B)高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of biogenic amines mix standards(A) and wine samples(B)

2.3 葡萄酒發(fā)酵過程中生物胺總含量的變化

圖2 葡萄酒發(fā)酵過程中生物胺總含量的變化Fig.2 Change of biogenic amines content during wine fermentation

葡萄酒發(fā)酵過程中8種生物胺總含量的變化見圖2，其中1～27 d為葡萄酒酒精發(fā)酵時(shí)期，此后進(jìn)入蘋乳發(fā)酵。由圖2可知，在整個(gè)發(fā)酵過程中，生物胺整體呈上升趨勢(shì)，尤其是酒精發(fā)酵后期和蘋乳發(fā)酵前期生物胺總含量迅速增加，由最初的8.14mg/L升至46.36mg/L；在蘋乳發(fā)酵時(shí)期，生物胺總含量繼續(xù)升高，由46.36mg/L升至115.25mg/L，發(fā)酵結(jié)束進(jìn)入陳釀階段后期，含量有所回落。由此可知，葡萄酒中生物胺的產(chǎn)生主要在酒精發(fā)酵后期和蘋乳發(fā)酵初期。在葡萄酒進(jìn)行蘋果酸-乳酸發(fā)酵時(shí)，葡萄酒中的微生物會(huì)優(yōu)先以蘋果酸和可發(fā)酵糖為能源物質(zhì)，而當(dāng)蘋乳發(fā)酵過程結(jié)束后，因?yàn)槠咸丫浦腥狈@些可供代謝的發(fā)酵底物，則會(huì)利用游離的氨基酸作為其能源物質(zhì)，從而致使葡萄酒中生物胺含量的增加[5-6]。因此，應(yīng)在這一時(shí)期及時(shí)進(jìn)行除菌和抑菌等措施控制葡萄酒中生物胺含量。

2.4 葡萄酒發(fā)酵過程中8種生物胺含量的變化

圖3 葡萄酒發(fā)酵過程中7種生物胺(A)和色胺(B)含量變化曲線Fig.3 Changes of seven kinds of biogenic amines(A)and tryptamine(B)during wine fermentation

葡萄酒發(fā)酵過程中8種生物胺含量的變化，結(jié)果見圖3。由圖3可知，在葡萄酒發(fā)酵過程中共檢測(cè)出8種生物胺，分別為色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺和精胺。不同發(fā)酵時(shí)期，8種生物胺的含量有所變化。色胺、組胺、尸胺在發(fā)酵開始時(shí)未檢出，而其他幾種生物胺在發(fā)酵最初就被檢測(cè)到，且含量均＜3 mg/L。

在葡萄酒發(fā)酵過程中，精胺和亞精胺含量的變化相對(duì)平穩(wěn)，波動(dòng)范圍在1.81～3.07 mg/L，其余6種生物胺都有較大波動(dòng)。除色胺含量較高（最高可達(dá)98.03 mg/L）外，其他7種生物胺含量在發(fā)酵過程中均不超過4.50mg/L。酪胺含量在整個(gè)發(fā)酵過程略高于其他生物胺，葡萄酒中組胺對(duì)人類的危害較大，研究顯示，口服超過0.008 g的組胺即會(huì)產(chǎn)生輕微中毒癥狀，而當(dāng)超過0.1 g時(shí)則會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重中毒癥狀[7-9]。在葡萄酒發(fā)酵的過程中，組胺含量雖然在酒精發(fā)酵結(jié)束后有明顯的上升，但最高含量不超過1.64 mg/L。組胺和腐胺含量最低，苯乙胺、腐胺、尸胺和組胺在酒精發(fā)酵后期（20～27 d）時(shí)，含量迅速上升，尸胺含量上升最為明顯，由0.81 mg/L上升至3.37 mg/L。而隨著發(fā)酵過程的進(jìn)行，葡萄酒中各生物胺含量在42～57 d呈下降趨勢(shì)。在57 d后，除酪胺大幅下降外，其余幾種生物胺均有一定程度的上升。

目前，大多數(shù)研究認(rèn)為生物胺的產(chǎn)生主要與氨基酸脫羧酶的活性有關(guān)，而與其含量關(guān)系較小，且乳酸菌具有氨基酸脫羧酶活性，可使氨基酸轉(zhuǎn)化為生物胺，因此乳酸菌是影響葡萄酒中生物胺含量的主要微生物[13]。此外，酒母也會(huì)帶入一部分生物胺，這可能會(huì)抑制乳酸菌的活性；葡萄醪（汁）中氨基酸的濃度也會(huì)在一定程度上影響生物胺的產(chǎn)生量，在一定范圍內(nèi)，濃度越大產(chǎn)生物胺越多[14-16]，而葡萄酒中生物胺的含量與葡萄品種、原料產(chǎn)地、釀造工藝等也有一定關(guān)系。

3 結(jié)論

本研究采用高效液相色譜法對(duì)新疆赤霞珠葡萄酒發(fā)酵過程中8種生物胺含量進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明，在整個(gè)發(fā)酵過程中，生物胺含量整體呈上升趨勢(shì)，在酒精發(fā)酵后期和蘋乳發(fā)酵前期生物胺含量迅速增加，總含量由最初的8.14mg/L升高至115.25 mg/L，說明酒精發(fā)酵后期和蘋乳發(fā)酵初期是生物胺生成的主要階段。葡萄酒中色胺含量最高，最高可達(dá)到98.03 mg/L，說明色胺為葡萄酒中主要的生物胺。組胺在整個(gè)發(fā)酵過程中含量最低，酪胺含量雖是除色胺外含量最高的生物胺，但其含量不超過4.50mg/L。

部分生物胺在蘋乳發(fā)酵結(jié)束時(shí)呈上升趨勢(shì)，因此在蘋乳發(fā)酵結(jié)束后，隨著這個(gè)時(shí)期有殺菌作用的游離SO2的減少，要及時(shí)抑菌、除菌，來降低葡萄酒中的生物胺含量。為優(yōu)化生產(chǎn)工藝，控制發(fā)酵條件，從而降低葡萄酒中的生物胺含量提供理論基礎(chǔ)。

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Change of biogenic amines content of Xinjiang Cabernet Sauvignon wine in the fermentation process

WANG Rui1,CHEN Xinjun2,WU Xinyue1,ZHANG Li1,ZHANG Zhenzhen1*(1.College of Food Science and Pharmacy,Xinjiang Agricultural University,Urumqi 830052,China; 2.Xinjiang CITIC Guoan Wine Industry Co.,Ltd.,Changji 830000,China)

The change of eight biogenic amines content during the wine fermentation were analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC).The results showed that the total contents of the eight biogenic amines in wine overall had an ascending tendency.The tryptamine content was the highest of 98.03 mg/L.The contents of putrescine and histamine were lower,not more than 2.48 mg/L.The changes of spermine and spermine contents were relatively stable in the range of 1.81-3.07 mg/L.Except for tryptamine,the contents of other biogenic amines were less than 4.50 mg/L.the contents of phenylethylamine,cadaverine,tyramine and so on increased significantly in the late stage of alcohol fermentation and the preliminary stage of malolactic fermentation.In the late stage of malolactic fermentation,the contents of tyramine and spermidine decreased slightly, and the contents of other biological amines increased to a certain extent.

wine;biogenic amines;alcohol fermentation;malolactic fermentation

N34

0254-5071（2017）01-0131-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.01.027

2016-07-06

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(2015211A024)；大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201610758082、201610758170)

王瑞(1992-)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量與安全。

*通訊作者：張珍珍(1984-)，女，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量與安全。