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    微生物促生劑發(fā)酵玉米皮生產(chǎn)飼料蛋白研究

    2017-02-16 07:08:30祁宏山王治業(yè)杜軍國
    中國釀造 2017年1期
    關(guān)鍵詞:菌液固態(tài)菌株

    季 彬,祁宏山,王治業(yè)*,杜軍國,曾 楊,陳 娟,祝 英

    (甘肅省科學院生物研究所,甘肅蘭州730000)

    微生物促生劑發(fā)酵玉米皮生產(chǎn)飼料蛋白研究

    季 彬,祁宏山,王治業(yè)*,杜軍國,曾 楊,陳 娟,祝 英

    (甘肅省科學院生物研究所,甘肅蘭州730000)

    以玉米皮為基本碳源,通過單因素和正交試驗,以產(chǎn)朊假絲酵母、啤酒酵母和白地霉聯(lián)合固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料進行了研究。以提高真蛋白含量為主要目的,優(yōu)化得到最佳的發(fā)酵條件為菌液接種量7%,固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基料水比1:1.8(g:mL),發(fā)酵溫度31℃,發(fā)酵時間80 h。在此條件下,真蛋白含量可達15.6%,是發(fā)酵前的1.94倍。

    玉米皮;固態(tài)發(fā)酵;飼料蛋白

    我國優(yōu)質(zhì)飼料資源短缺,一直以來都制約著畜牧業(yè)的長效發(fā)展[1-3]。玉米皮是玉米籽粒的表皮部分,也稱作玉米纖維或玉米渣,是玉米加工淀粉后的副產(chǎn)物,通常在濕法[4]加工淀粉的過程中被分離出來。玉米皮富含淀粉和纖維素[5],還有少量的植物蛋白,傳統(tǒng)的使用方法是直接用來飼喂牛羊,但因其適口性差,牛羊等采食率低,飼喂效果不好。利用微生物發(fā)酵[6-7]的方法,可將玉米皮中的淀粉、纖維類物質(zhì)直接轉(zhuǎn)化為牛羊易采食的單細胞蛋白。目前,相關(guān)研究[8-9]多采用將不同飼料化菌株分別接入玉米皮,然后再利用固態(tài)混合發(fā)酵的方式生產(chǎn)單細胞蛋白飼料,但這種方法在工業(yè)化生產(chǎn)中一是由于不同菌株間可能存在的競爭、協(xié)同關(guān)系,菌株間的配比往往不能反映飼料化過程中各菌株間真實的相互關(guān)系,增蛋白效果有限;二是多次接種增加了工作量,也增加了雜菌污染的機會。針對于此,本試驗采用將飼料化菌株經(jīng)細胞固定化后接種至玉米皮糖化醪中反復培養(yǎng),待其菌群結(jié)構(gòu)穩(wěn)定后再將菌液一次性接入玉米皮后固態(tài)發(fā)酵。由于菌液中各菌株的配比已經(jīng)玉米皮水解液的反復優(yōu)化,呈穩(wěn)定的狀態(tài),在接入玉米皮后可在較短時間內(nèi)迅速進入飼料化發(fā)酵,其最佳的菌株配比也更能高產(chǎn)單細胞蛋白。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    1.1.1 菌種

    白地霉(GeotrichumcandidumLink)、產(chǎn)朊假絲酵母(Candida utilis)、啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiaeHansen):中國工業(yè)微生物菌種保藏中心甘肅分中心提供。

    1.1.2 材料

    聚乙烯醇復合凝膠[10]:蘭州凱奇生物工程有限責任公司提供。

    玉米皮:甘肅張掖昆侖生化有限責任公司提供。將玉米皮粉碎后過40目篩,加入相當于干料總量1%的營養(yǎng)鹽液(0.05%硫酸銨,0.027%磷酸二氫鉀,硫酸鎂0.02%,水1000mL),含水量控制在60%左右,于121℃滅菌處理25min。

    1.1.3 培養(yǎng)基

    白地霉培養(yǎng)基:馬鈴薯200g去皮,切成小塊,加水煮沸20min后用紗布過濾,濾液加葡萄糖20g,定容至1000mL,pH值自然,冷卻后待用。固體培養(yǎng)基加瓊脂16 g。

    酵母種子培養(yǎng)基:蛋白胨8 g,牛肉膏5 g,酵母粉3 g,葡萄糖10 g,七水硫酸鎂0.5 g,水1 000 mL。

    固定化細胞培養(yǎng)基[11]:白地霉菌液體培養(yǎng)基與玉米糖化醪1∶1混合,其中玉米糖化醪的制作方法:將玉米粉碎并過40目篩,與水以1:4.5的比例混合并加熱,待溫度為40℃,開始加入所需酶量一半的淀粉酶(淀粉酶按12 U/g玉米粉稱取),保溫30 min,后繼續(xù)加熱至90℃,加入剩余的淀粉酶,并加熱至沸25 min,后開始冷卻,待溫度為62~64℃時加入糖化酶(糖化酶按200 U/g玉米粉稱?。?,并保溫40 min后降溫至28~30℃。

    1.2 儀器與設(shè)備

    LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器:上海申安醫(yī)療器械廠;SW-CJ-1F超凈工作臺:蘇州凈化設(shè)備有限公司;MJ-160型霉菌培養(yǎng)箱:上海恒躍醫(yī)療器械有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 工藝流程

    1.3.2 酵母菌共固定化方法

    將待固定的酵母菌種分別經(jīng)種子培養(yǎng)基增殖培養(yǎng)后,待菌懸液中酵母細胞數(shù)達到1.2×108CFU/mL以上時,將產(chǎn)朊假絲酵母、啤酒酵母菌懸液以1:1的體積比混合,然后以2:8的體積比與聚乙烯醇凝膠混合,攪拌均勻后置于低溫冷凍箱中固化48 h,解凍后切成4 cm×4 cm×4 cm的切塊備用。

    1.3.3 共固定化細胞增殖培養(yǎng)[12]

    將備用的固定化細胞切塊加入固定化增殖培養(yǎng)基中,在28℃條件下增殖18 h,增殖罐攪拌轉(zhuǎn)速為90 r/min。

    將固定化酵母增殖液與白地霉菌培養(yǎng)液以1∶1的比例混合[13]后,接種在蒸煮好的玉米皮中,在一定培養(yǎng)條件下發(fā)酵。

    1.3.4 玉米皮固態(tài)發(fā)酵試驗[14-16]

    ①單因素試驗

    試驗以玉米皮為基本碳源,添加營養(yǎng)鹽液后控制料水比,經(jīng)蒸煮滅菌處理后接種培養(yǎng),初始培養(yǎng)條件為玉米皮200 g,料水比1∶2(g∶mL),接種量10%,30℃培養(yǎng)72 h,考察不同接種量(5.0%、7.5%、10.0%、12.5%、15.0%)、基質(zhì)料水比(1∶1.0、1∶1.4、1∶1.8、1∶2.2、1∶2.6、1∶3.0(g∶mL))、發(fā)酵溫度(25℃、28℃、31℃、34℃、37℃)和培養(yǎng)時間(48 h、64 h、72h、80h、90h)對玉米皮飼料化發(fā)酵產(chǎn)真蛋白量的影響。

    ②正交試驗

    在單因素試驗基礎(chǔ)上,選取接種量、培養(yǎng)基料水比、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間4個因素,取3水平設(shè)計試驗,發(fā)酵終了時測定真蛋白含量,并且利用軟件對試驗結(jié)果進行極差分析。正交試驗因素與水平見表1。

    表1 玉米皮發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for corn bran culture conditions optimization

    1.3.5 真蛋白含量測定[17]

    用電子天平精確稱取發(fā)酵后產(chǎn)物0.5 g放置于100 mL燒杯中,加入30 mL蒸餾水用玻璃棒攪拌均勻,再煮沸依次加入10%硫酸銅水溶液20 mL和2.5%氫氧化鈉溶液20 mL,邊加邊攪拌,加完后繼續(xù)攪拌幾分鐘。放置2 h,沉淀物用濾紙過濾,并用70℃以上熱蒸餾水反復洗滌沉淀,直至濾液無沉淀為止(用氯化鋇試驗檢驗)。最后將濾紙和沉淀物包好,65~70℃烘箱干燥。用凱氏定氮法測定樣品中真蛋白含量,同時作空白對照。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 單因素試驗

    2.1.1 料水比對玉米皮飼料化發(fā)酵產(chǎn)真蛋白的影響

    固態(tài)發(fā)酵不同于液態(tài)發(fā)酵,固態(tài)發(fā)酵中合理控制發(fā)酵基質(zhì)中水分的含量,有利于微生物進行細胞運動、生長、細胞內(nèi)外營養(yǎng)物質(zhì)交換。料水比對真蛋白含量的影響見圖1。

    圖1 料水比對玉米皮產(chǎn)真蛋白含量的影響Fig.1 Effects of solid-liquid ratio on true protein content from corn bean

    由圖1可以看出,真蛋白含量隨料水比的增加呈先增大后減小的趨勢,當料水比為1∶1.8(g∶mL)時,飼料化發(fā)酵后玉米皮真蛋白含量達最大值,為14.3%。原因可能是低水分發(fā)酵時,底物中的營養(yǎng)物沒有足夠的自由水將其擴散到底物表面,菌株生長繁殖的營養(yǎng)物質(zhì)供給不足,真蛋白增量不足;高水分發(fā)酵時,底物顆粒間沒有足夠的孔隙率,供氧不足,菌株生長受限,真蛋白增量有限。因此選擇料水比為1∶1.8(g∶mL)進行后續(xù)試驗。

    2.1.2 接種量對玉米皮飼料化發(fā)酵產(chǎn)真蛋白的影響

    接種量對真蛋白含量的影響見圖2。由圖2可知,真蛋白含量隨接種量的增加呈先快速后緩慢增大的趨勢,當接種量為7.5%時,飼料化發(fā)酵后玉米皮中真蛋白含量可達9.7%,之后隨著接種量的增加,真蛋白含量增量較小,考慮到菌液生產(chǎn)成本,控制接種量在7.5%較為合適。接種量大可以縮短發(fā)酵過程中菌株細胞數(shù)達到峰值的時間,提早形成發(fā)酵終產(chǎn)物。這是因為種子液中含有胞外水解酶類,接種量大,酶量也多,有利于對固態(tài)基質(zhì)中營養(yǎng)物質(zhì)的分解和利用,同時菌體量多,占有絕對生長優(yōu)勢,可以相對減少雜菌污染和生長的機會。但接種量過大,也會造成菌體前期生長過速,后期由于基質(zhì)中菌體代謝產(chǎn)物堆積和營養(yǎng)物質(zhì)消耗殆盡,導致菌體早衰,從而影響產(chǎn)物的合成。因此,選擇接種量為7.5%進行后續(xù)試驗。

    圖2 接種量對玉米皮產(chǎn)真蛋白含量的影響Fig.2 Effects of inoculum on true protein content from corn bran

    2.1.3 發(fā)酵溫度對玉米皮飼料化發(fā)酵產(chǎn)真蛋白的影響

    溫度對發(fā)酵的影響及其調(diào)節(jié)控制是影響微生物生長繁殖最重要的因素之一,其主要表現(xiàn)在對細胞生長、產(chǎn)物合成和培養(yǎng)基質(zhì)物理性質(zhì)的改變等方面。據(jù)此,控制適當?shù)陌l(fā)酵溫度,使生產(chǎn)菌種處于產(chǎn)物合成最佳的溫度下生長,才能得到優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的效果。發(fā)酵溫度對真蛋白含量的影響見圖3。

    圖3 發(fā)酵溫度對玉米皮產(chǎn)真蛋白含量的影響Fig.3 Effects of the fermentation temperature on true protein content from corn bran

    由圖3可知,真蛋白含量隨發(fā)酵溫度的升高呈先增大后減小的趨勢,當混合菌液在31℃發(fā)酵玉米皮時,發(fā)酵后得成熟物料中真蛋白含量最高為14.5%,之后,隨著溫度的上升,真蛋白含量有所下降。因此,選擇發(fā)酵溫度為31℃進行后續(xù)試驗。

    2.1.4 發(fā)酵時間對玉米皮飼料化發(fā)酵產(chǎn)真蛋白的影響

    真蛋白含量是評價玉米皮飼料化發(fā)酵效果的重要指標,而微生物的生長要經(jīng)過停滯期、對數(shù)生長期、穩(wěn)定期和衰退期四個階段,微生物發(fā)酵產(chǎn)物的總量隨著微生物的生長階段的改變而改變。發(fā)酵時間對真蛋白含量的影響見圖4。

    圖4 發(fā)酵時間對玉米皮產(chǎn)真蛋白含量的影響Fig.4 Effects of the fermentation time on true protein content from corn bran

    由圖4可知,真蛋白含量隨發(fā)酵時間的延長呈先增大后減小的趨勢,玉米皮飼料化發(fā)酵80 h時,真蛋白含量可達峰值為14.8%,之后隨著發(fā)酵時間的延長有所減低,分析認為是由于微生物自身分解代謝所致。因此,選擇發(fā)酵時間為80 h進行后續(xù)試驗。

    2.2 正交試驗結(jié)果

    在單因素試驗的基礎(chǔ)上,選取接種量、培養(yǎng)基料水比、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間4因素,分別設(shè)3個水平,用正交表L9(34)設(shè)計試驗,研究各因素對玉米皮飼料化發(fā)酵的影響,試驗結(jié)果與分析見表2。

    表2 玉米皮發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal tests for corn bran fermentation conditions optimization

    由表2可知,直觀分析得出最佳水平組合為A1B2C2D2,即菌種接種量7%,固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基料水比1∶1.8(g∶mL),發(fā)酵溫度31℃,發(fā)酵時間80 h。在此條件下,真蛋白含量為15.6%,是發(fā)酵前的1.94倍。4種因素對真蛋白產(chǎn)量影響依次為培養(yǎng)基料水比>發(fā)酵溫度>接種量>發(fā)酵時間,即培養(yǎng)基含水量和發(fā)酵溫度是影響玉米皮飼料化發(fā)酵的主要因素,其他影響較小。

    表3 正交試驗結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal test result

    由方差分析(表3)可知,培養(yǎng)基料水比、發(fā)酵時間F比>F0.05(2,2),故其對玉米皮飼料化發(fā)酵產(chǎn)真蛋白十分顯著(P<0.05);接種量、發(fā)酵溫度F比<F0.05(2,2),故其對玉米皮飼料化發(fā)酵產(chǎn)真蛋白的影響不顯著(P>0.05)。

    3 結(jié)論

    本試驗中玉米皮經(jīng)蒸煮滅菌處理后,接種經(jīng)細胞固定化后制得的產(chǎn)朊假絲酵母、啤酒酵母、白地霉菌液優(yōu)化菌液,固態(tài)發(fā)酵后制取單細胞蛋白飼料。試驗結(jié)果表明,將菌液接種量控制在7%,固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基料水比1∶1.8(g∶mL),發(fā)酵溫度31℃,發(fā)酵80 h時,真蛋白含量可達15.6%,是發(fā)酵前的1.94倍。本研究由于優(yōu)化了發(fā)酵菌液,發(fā)酵后玉米皮真蛋白含量要高于現(xiàn)有的研究水平,顯示了其優(yōu)越性,具有一定的工業(yè)應(yīng)用潛力。

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    Feed protein production from corn bran with microbial fermentation promoters

    JI Bin,QI Hongshan,WANG Zhiye*,DU Junguo,ZENG yang,CHEN Juan,ZHU Yin(Institute of Biology,Gansu Provincial Academy of Sciences,Lanzhou 730000,China)

    Usingcornbranasbasiccarbonsource,proteinfeedwasproducedwiththesolid-statefermentationofCandidautilis,Saccharomycescerevisiae andGeotrichum candidumby single-factor and orthogonal experiments.To improve pure protein content,the optimal fermentation conditions were as follows:solid-liquid ratio of solid-state fermentation medium 1:1.8(g:ml),inoculum 7%,fermentation temperature 31℃and time 80 h.Under the above conditions,the true protein content in the final product achieved 15.6%,which was 1.94 times of before fermentation.

    corn bran;solid-state fermentation;feed protein

    S816.6

    0254-5071(2017)01-0107-04

    10.11882/j.issn.0254-5071.2017.01.022

    2016-05-04

    甘肅省科學院青年基金(2013QN-07);國家科技支撐計劃(2012BAD14B10-4);國家星火項目(2012GA860003)

    季彬(1983-),男,助理研究員,本科,主要從事農(nóng)業(yè)廢棄物高值化利用研究工作。

    *通訊作者:王治業(yè)(1976-),男,研究員,碩士,主要從事生物資源高值化及清潔生產(chǎn)方面的研究工作。

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