Wnt信號(hào)通路組件在胃癌及慢性萎縮性胃炎中的表達(dá)分析*

閆 媛,莊 坤,張 欣，左利平，韓 坤，李 寧,侯 妮

1.西安市中心醫(yī)院(西安 710004)，2.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部分子生物學(xué)與遺傳學(xué)系(西安710061)

Wnt信號(hào)通路組件在胃癌及慢性萎縮性胃炎中的表達(dá)分析*

閆 媛1,莊 坤1,張 欣1，左利平1，韓 坤1，李 寧1,侯 妮2

1.西安市中心醫(yī)院(西安 710004)，2.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部分子生物學(xué)與遺傳學(xué)系(西安710061)

目的：探討Wnt信號(hào)通路在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用。方法：采用免疫組化方法檢測(cè)胃癌、癌旁組織、慢性萎縮性胃炎組織Wnt2及β-catenin的表達(dá)并進(jìn)行分析。結(jié)果：胃癌組織Wnt2表達(dá)顯著高于癌旁組織和慢性萎縮性胃炎表達(dá)；癌旁組織Wnt2表達(dá)高于慢性萎縮性胃炎表達(dá)。癌旁組織及慢性萎縮性胃炎β-catenin均表達(dá)，胃癌組織β-catenin表達(dá)顯著高于癌旁組織和慢性萎縮性胃炎。結(jié)論：Wnt2、β-catenin在胃癌中均高表達(dá)，β-catenin在慢性萎縮性胃炎表達(dá)明顯，Wnt信號(hào)途徑異?；罨谖赴┑陌l(fā)生發(fā)展過(guò)程中有重要作用。

胃癌是危害人類健康的惡性腫瘤之一，全球胃癌的致死率位居所有腫瘤的第二位[1]。胃癌的惡性表型基本生物要素和演變過(guò)程，惡性增殖表型與胃癌轉(zhuǎn)移的潛能存在密切聯(lián)系。Wnt信號(hào)途徑是一種對(duì)細(xì)胞增殖、分化具有重要調(diào)節(jié)作用的信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)。Wnt蛋白和β-連鎖蛋白(β-catenin)是Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路的重要組成部分。β-catenin和T細(xì)胞因子(T cell factor，TCF)/淋巴增強(qiáng)因子(Lymphoid enhancer factor，LEF)家族成員是Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因素。Wnt信號(hào)途徑參與細(xì)胞信號(hào)啟動(dòng)、分子傳遞、靶基因轉(zhuǎn)錄、表達(dá)等多個(gè)重要環(huán)節(jié)，是一個(gè)由多種分子參與，相互影響、相互制約和協(xié)同作用的復(fù)雜體系。 越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，Wnt信號(hào)通路除了參與調(diào)控發(fā)育過(guò)程以外，與胃癌的發(fā)生發(fā)展也有密切的關(guān)系[2-3]。β-catenin 是Wnt信號(hào)途徑的中心環(huán)節(jié)或信使。β-catenin 與TCF/LEF 形成復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)后，Wnt途徑的相關(guān)靶基因即可開始轉(zhuǎn)錄表達(dá)，這些靶基因包括細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)基因、生長(zhǎng)因子和粘附分子等。一旦這些基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)失衡，則與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[4-5]。通過(guò)觀察胃癌、癌旁組織、慢性萎縮性胃炎Wnt2及β-catenin的表達(dá)明確Wnt信號(hào)通路在胃癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程的作用。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)材料 胃癌及癌旁組織取自西安市中心醫(yī)院15例胃腺癌患者的手術(shù)切除標(biāo)本；慢性萎縮性胃炎組織取自西安市中心醫(yī)院胃鏡及病理診斷為慢性萎縮性胃炎15例患者的胃粘膜組織，Wnt2抗體，β-catenin抗體均購(gòu)自美國(guó)Santa公司。

2 方 法

2.1組織固定、包埋、切片：分別將胃癌，癌旁組織，慢性萎縮性胃炎組織4%多聚甲醛浸泡固定24 h后，雙蒸水沖洗3次，50%乙醇沖洗2次，乙醇濃度梯度逐級(jí)脫水(70%乙醇1 d，80%乙醇過(guò)夜，95%乙醇3h，無(wú)水乙醇Ⅰ、Ⅱ各2 h。無(wú)水乙醇二甲苯(1∶1)內(nèi)浸泡組織45 min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ各30 min。浸入58℃恒溫二甲苯石蠟(1∶1)45 Mmin，石蠟Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ共2.5h，石蠟Ⅲ包埋組織。切成4μm石蠟切片，在50℃溫水中展開，用潔凈的載玻片撈片，使組織切片平附于載玻片，室溫過(guò)夜。

2.2 檢測(cè)方法：取各組石蠟切片，恒溫箱內(nèi)60℃烤片20 min。二甲苯Ⅰ浸泡10 min，二甲苯Ⅱ浸泡10 min，無(wú)水乙醇浸泡5 min, 95%乙醇浸泡5 min, 80%乙醇浸泡5 min, 60%乙醇浸泡5 min, 雙蒸水浸泡5 min；滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，3%H2O2室溫封閉10 min，PBS沖洗3次，微波爐中加熱檸檬酸鈉緩沖液沸騰，放入組織切片煮沸15 min，冷卻至室溫，蒸餾水沖洗3次，加入山羊血清，室溫20 min，甩去多余液體。分別滴加Wnt2抗體(1∶50)，β-catenin抗體(1∶50)4℃過(guò)夜，PBS洗滌3次，滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(SAP顯色劑B)室溫15 min，PBS洗滌3次，滴加鏈霉親和素-過(guò)氧化物酶(SAP顯色劑C)室溫15 min，PBS洗滌3次；避光將DAB顯色顯色試劑盒中A、B、C各一滴加入1 ml蒸餾水中，混合均勻后滴加于切片，自來(lái)水沖洗終止顯色。蘇木素復(fù)染3 min，鹽酸酒精分化，自來(lái)水沖洗后依次在60%乙醇5 min, 80%乙醇5 min, 95%乙醇5 min, 無(wú)水乙醇5 min中脫水，二甲苯20 min共兩次透明；中性樹膠封片后，顯微鏡下觀察。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，兩組間差異比較應(yīng)用獨(dú)立樣本雙側(cè)t檢驗(yàn)。P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 Wnt2表達(dá) 見圖1。胃癌組織Wnt2表達(dá)顯著高于癌旁組織、慢性萎縮性胃炎組織(P< 0.05)；癌旁組織Wnt2表達(dá)高于慢性萎縮性胃炎組織(P< 0.05)。

A:胃癌，B:癌旁組織，C:慢性萎縮性胃炎組織

圖1 Wnt2在胃癌及慢性胃炎組織中的表達(dá)(100×)

2 β-catenin表達(dá) 見圖2。胃癌組織β-catenin表達(dá)顯著高于癌旁組織及慢性萎縮性胃炎組織(P< 0.05)；癌旁組織及慢性萎縮性胃炎β-catenin均高表達(dá)。

A:胃癌，B:癌旁組織，C:慢性萎縮性胃炎組織

討 論

Wnt信號(hào)途徑是一種對(duì)細(xì)胞增殖、分化具有重要調(diào)節(jié)作用的信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)。參與細(xì)胞信號(hào)啟動(dòng)、分子傳遞、靶基因轉(zhuǎn)錄、表達(dá)等多個(gè)重要環(huán)節(jié)，是一個(gè)由多種分子參與，相互影響、相互制約和協(xié)同作用的復(fù)雜體系。Wnt2和β-catenin是Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路的重要組成部分，正常狀態(tài)下β- catenin通過(guò)其降解復(fù)合體生成與降解的動(dòng)態(tài)平衡，維持細(xì)胞的生理狀態(tài)。β- catenin 的降解復(fù)合體由APC (Adenomatouspolyposis coli)、Axin、GSK-3β(Glycogen synthase kinase3)、CK1等構(gòu)成。各部分功能不同，GSK-3β使β-catenin 磷酸化，Axin 在β-catenin 降解復(fù)合體中起支架蛋白作用，β- catenin 降解復(fù)合體生成與降解處于一種動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。病理狀態(tài)下，當(dāng)β- catenin降解復(fù)合體的降解途徑被切斷時(shí)，β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中積累，細(xì)胞內(nèi)增多的β-catenin與作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的DNA結(jié)合蛋白TCF/LEF相互作用進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi), 與相應(yīng)的DNA結(jié)合, 導(dǎo)致相應(yīng)靶基因(如C-myc、cyclin D1、MMP-7等)的持續(xù)轉(zhuǎn)錄及表達(dá)。

本研究我們可見胃癌組織Wnt2表達(dá)顯著高于癌旁組織和慢性萎縮性胃炎表達(dá)，癌旁組織Wnt2表達(dá)高于慢性萎縮性胃炎表達(dá)(圖1)。癌旁組織及慢性萎縮性胃炎β-catenin均表達(dá)，胃癌組織β-catenin表達(dá)顯著高于癌旁組織和慢性萎縮性胃炎(圖2)。胃癌組織中Wnt2與β-catenin表達(dá)均顯著升高，顯示W(wǎng)nt信號(hào)通路在胃癌中異?；罨琖nt信號(hào)途徑的β-catenin通過(guò) 與TCF/LEF 形成復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)后激活其相關(guān)靶基因，這些靶基因涉及與細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的基因，以及生長(zhǎng)因子和粘附分子等，而這些基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)失衡與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。慢性萎縮性胃炎是導(dǎo)致胃癌的一個(gè)重要原因[6-7]，慢性萎縮性胃炎的β-catenin表達(dá)明顯，提示慢性萎縮性胃炎時(shí)Wnt信號(hào)途徑已出現(xiàn)異?；罨?，這也是慢性萎縮性胃炎導(dǎo)致胃癌發(fā)生的一個(gè)重要機(jī)制。Wnt信號(hào)途徑異?；罨谖赴┑陌l(fā)生發(fā)展過(guò)程中有起重要作用。

[1] 鄒小農(nóng), 孫喜斌, 陳萬(wàn)青, 等. 2003-2007年中國(guó)胃癌發(fā)病與死亡情況分析[J].腫瘤, 2012,32:109-114.

[2] 李 康, 旦 增. Wnt/β-catenin信號(hào)與胃癌防治研究進(jìn)展[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2014,12:1852-1856.

[3] 劉曉紅, 曹智新, 耿 明, 等. Wnt-5a基因在胃癌中的表達(dá)及意義[J].世界華人消化雜志,2010,18:1222-1226.

[4] 董稚明, 郭艷麗, 孫萍萍,等. 胃癌中Wnt信號(hào)通路的激活及E-cadherin/catenins的異常表達(dá)[J].河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2008,29:652-656,652.

[5] Wu C, Zhuang Y, Jiang S,etal. Interaction between Wnt/beta-catenin pathway and microRNAs regulates epithelial-mesenchymal transition in gastric cancer (Review) [J].Int J Oncol,2016,48:2236-2246.

[6] 王霄騰, 呂 賓. 胃癌前病變的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估[J].中華消化雜志,2016,36:208-210.

[7] Liu N, Zhou N, Chai N,etal. Helicobacter pylori promotes angiogenesis depending on Wnt/beta-catenin-mediated vascular endothelial growth factor via the cyclooxygenase-2 pathway in gastric cancer[J].BMC Cancer,2016,16:321.

(收稿：2016-11-12)

Analysis of Wnt signaling pathway activition in gastric carcinoma and chronic atrophic gastritis

Yan Yuan, Zhuang Kun, Zhang Xin,et al.

Xi’an Central Hospital (Xi’an 710004)

Objective: To explore the role of Wnt signaling pathway in the occurrence and development of gastric carcinoma. Methods: Using histochemistry to detected the expression of Wnt2 and β-catenin in gastric carcinoma, adjacent tissue, and chronic atrophic gastritis. Results: The expression of Wnt2 in gastric carcinoma is obviously more than adjacent tissue and chronic atrophic gastritis. The expression of Wnt2 in adjacent tissue is more than chronic atrophic gastritis. There are expression of β-catenin in adjacent tissue and chronic atrophic gastritis. The expression of β-catenin in gastric carcinoma is obviously more than adjacent tissue and chronic atrophic gastritis. Conclusion: Wnt2 and β-catenin are high expression in gastric carcinoma. β-catenin is expression in chronic atrophic gastritis. Abnomal Wnt signaling pathway is important in the occurrence and development of gastric carcinoma.

Gastric neoplasms Gastritis,atrophic @Wnt2 @β-catenin

* 陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目(2014JN141160)

胃腫瘤 胃炎，萎縮性 @Wnt2 @β-連鎖蛋白

R737.31

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.02.007