AK000953基因沉默聯(lián)合達(dá)那唑?qū)ψ訉m肌瘤細(xì)胞增殖、凋亡的影響*

牛力春,李世梅,于 赟,張 穎,梁 靜,劉會玲

解放軍第三二三醫(yī)院婦產(chǎn)科(西安710054)

AK000953基因沉默聯(lián)合達(dá)那唑?qū)ψ訉m肌瘤細(xì)胞增殖、凋亡的影響*

牛力春,李世梅△,于 赟,張 穎,梁 靜,劉會玲

解放軍第三二三醫(yī)院婦產(chǎn)科(西安710054)

目的：探討AK000953基因沉默聯(lián)合達(dá)那唑?qū)ψ訉m肌瘤細(xì)胞增殖、凋亡的影響。方法：利用小干擾RNA(RNAi)技術(shù)合成AK000953 siRNA,脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染子宮肌瘤細(xì)胞,分別用MTT法、流式細(xì)胞術(shù)檢測AK000953 siRNA聯(lián)合達(dá)那唑?qū)ψ訉m肌瘤細(xì)胞的增殖、凋亡的影響。結(jié)果：MTT法結(jié)果表明達(dá)那唑組對子宮肌瘤細(xì)胞的抑制率為(17±4.5)%,而AK000953 siRNA+達(dá)那唑組對子宮肌瘤細(xì)胞的抑制率升高為(56±8.7)%(P<0.01)；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示AK000953 siRNA+達(dá)那唑組凋亡率顯著高于對照組[(43.2±2.3)%與(5±0.4)%,P<0.01]和達(dá)那唑組[(43.2±4.3)%與(16.0±2.1)%P<0.01]。結(jié)論：AK000953 siRNA可顯著增強(qiáng)達(dá)那唑?qū)ψ訉m肌瘤細(xì)胞的增殖抑制和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的效應(yīng)。

子宮肌瘤是婦女常見的生殖系統(tǒng)良性腫瘤，近年來子宮肌瘤發(fā)病率逐年上升，是切除子宮的主要原因之一[1]。前期工作中,我們采用基因芯片高通量篩選獲得子宮肌瘤組織和正常子宮平滑肌組織之間表達(dá)顯著差異的基因AK000953,差異倍數(shù)為2.398～12.071倍,提示AK000953基因可能是子宮肌瘤發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵因子[2]。為進(jìn)一步探討AK000953基因?qū)ψ訉m肌瘤是否具有治療效果，本課題采用RNAi技術(shù)靶向沉默AK000953，研究其聯(lián)合達(dá)那唑?qū)ψ訉m肌瘤細(xì)胞增殖、凋亡的影響,從而為子宮肌瘤的分子靶向治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

1 材 料 DMEM(Hylone公司，美國),胎牛血清(Gibco公司,美國),I型膠原酶(Gibco公司,美國),胰蛋白酶(Gibco公司,美國),肌動蛋白(α-actin)一抗(Santa公司,美國)。收集解放軍第三二三醫(yī)院婦產(chǎn)科行子宮肌瘤剔除術(shù)患者術(shù)中肌瘤組織,分離、原代培養(yǎng)獲得子宮肌瘤細(xì)胞。子宮肌瘤患者納入標(biāo)準(zhǔn)為子宮肌瘤體積>5 cm×5 cm×5 cm,術(shù)前未接受藥物治療,術(shù)后病理診斷確診為子宮平滑肌瘤。

2 研究方法

2.1 子宮肌瘤細(xì)胞的原代培養(yǎng)：無菌條件下將子宮肌瘤組織用DMEM培養(yǎng)基沖洗3遍,剪碎至<1 mm的小塊，分別加入0.25% I型膠原酶和10 %胎牛血清，37 ℃恒溫水浴搖床消化子宮肌瘤組織1.5～2 h,6000 r/min離心3 min 2次,棄上清。重復(fù)加入0.25% I型膠原酶和10%小牛血清，繼續(xù)消化30 min，離心后棄上清，收集細(xì)胞。臺盼藍(lán)染色觀察細(xì)胞活性并記數(shù),分別以每毫升培養(yǎng)液含1×105個細(xì)胞接種于50 ml培養(yǎng)瓶,置于溫度為37℃、5% CO2濕度為95%培養(yǎng)箱中培養(yǎng),培養(yǎng)基為含20%FBS的DMEM。24 h后倒去未貼壁細(xì)胞,繼續(xù)培養(yǎng)。

2.2 免疫組化法鑒定子宮肌瘤細(xì)胞：3～5 d細(xì)胞融合達(dá)80%～90%時應(yīng)用免疫組化法鑒定。將無菌蓋玻片置于6孔板中,每孔加入1×105個細(xì)胞,常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng),待細(xì)胞融合至70%左右時取出蓋玻片,PBS輕柔沖洗細(xì)胞面,4%多聚甲醛固定15 min。3% H2O2室溫孵育5～10 min，蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min 2遍。10%正常山羊血清封閉,室溫孵育10 min，去血清。滴加肌動蛋白(α-actin)一抗，4 ℃孵育過夜。PBS沖洗后滴加生物素標(biāo)記二抗，37 ℃孵育10～30 min。PBS沖洗后滴加堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，37 ℃孵育30 min。DAB顯色劑顯色5 min。蘇木精復(fù)染、脫水、透明、封片?？瞻讓φ找訮BS代替一抗。顯微鏡下觀察肌動蛋白(α-actin)陽性被染成棕黃色為子宮肌瘤細(xì)胞。陽性細(xì)胞超過95%以上鑒定為子宮肌瘤細(xì)胞。

2.3 siRNA轉(zhuǎn)染：在http://sidirect2.rnai.jp/ 在線設(shè)計siRNA模板序列,經(jīng)過前期PCR驗(yàn)證,選擇沉默效率超過80%的AK000953引物。上游：5‘-AUUAUAAAGAUUAUUGAUGUG-3’,下游：3‘-CAUCAAUAAUCUUUAUAAUAC-5’。接種2×105個細(xì)胞/孔于6孔板中,待其達(dá)到70%細(xì)胞融合后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。使用脂質(zhì)體 Lipofectamine 2000(Invitrogen,美國)進(jìn)行轉(zhuǎn)染,具體轉(zhuǎn)染步驟按照Lipofectamine 2000說明書進(jìn)行。

2.4 MTT法檢測AK000953 siRNA聯(lián)合達(dá)那唑?qū)ψ訉m肌瘤細(xì)胞增殖能力的影響：常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng),每孔加入1×105個細(xì)胞,待細(xì)胞融合至70%左右將細(xì)胞分為如下三組：①空白對照組,用生理鹽水處理；②達(dá)那唑組,用達(dá)那唑(1 μg/ml)處理；③AK000953 siRNA+達(dá)那唑組(達(dá)那唑+siRNA組)：AK000953 siRNA轉(zhuǎn)染24 h后加入1 μg/ml達(dá)那唑。各組細(xì)胞處理48 h后常規(guī)胰酶消化細(xì)胞,離心收集各組細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度,以2×103/孔接種于96孔板，每組設(shè)5個復(fù)孔,常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞24 h后每孔加 1 mg/ml MTT(Sigma)溶液50 μl,37 ℃靜置。作用4 h,棄上清,每孔加入DMSO 150 μl振蕩溶解15 min,96孔酶標(biāo)儀SpectraMAXM5(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)上測定波長為570 nm的吸光度(A)。 抑制率=1-處理組OD/空白對照組OD

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測AK000953 siRNA聯(lián)合達(dá)那唑?qū)ψ訉m肌瘤細(xì)胞凋亡的影響：培養(yǎng)48 h后收集各組細(xì)胞,1000 r/min離心5 min,PBS洗滌兩次,棄上清,細(xì)胞濃度大約每毫升1×106；加入凱基試劑盒中的bindingbuffer 500 μl重懸細(xì)胞；加入5 μl AnnexinV-FITC混勻后,加入10 μl Propidium Iodide(PI),混勻；室溫、避光、冰浴15 min，在1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。

結(jié) 果

1 子宮肌瘤細(xì)胞分離培養(yǎng)及鑒定 在接種消化分離過的細(xì)胞大約2 d左右,大部分細(xì)胞貼壁,3 d后細(xì)胞完全伸展，伸出較長突起呈長梭形,細(xì)胞成束平行排列(圖1A)。免疫組化結(jié)果顯示,超過95%細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見α-actin被染成棕黃色,呈絲狀結(jié)構(gòu),為肌瘤細(xì)胞,傳代后細(xì)胞增殖能力旺盛,性能穩(wěn)定(圖1B)。

A：光鏡下肌瘤細(xì)胞生長形態(tài)；B：免疫組化desmin染色的肌瘤細(xì)胞

2 達(dá)那唑+siRNA對子宮肌瘤細(xì)胞增殖能力的影響 見圖2。MTT法分別檢測空白對照組、達(dá)那唑組和達(dá)那唑+siRNA組三組細(xì)胞增殖能力的變化，結(jié)果表明和空白對照組相比, 達(dá)那唑組對子宮肌瘤細(xì)胞的抑制率僅為(17±4.5)%，而達(dá)那唑+siRNA組對子宮肌瘤細(xì)胞的抑制率顯著升高為(56±8.7)%,兩組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

圖2 達(dá)那唑+siRNA對子宮肌瘤細(xì)胞增殖能力的影響

3 達(dá)那唑+siRNA對子宮肌瘤細(xì)胞凋亡的影響 見圖3。流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞中細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示空白對照組細(xì)胞凋亡率僅為(5±0.4)%，達(dá)那唑組細(xì)胞凋亡率為(16±2.1)%，達(dá)那唑+siRNA組細(xì)胞凋亡率則達(dá)到(43.2±4.3)%。達(dá)那唑+siRNA組凋亡率顯著高于對照組[(43.2±2.3)%與(5±0.4)%，P<0.01]和達(dá)那唑組[(43.2±2.3)%與(16.0±2.1)%,P<0.01]。

A:對照組;B:達(dá)那唑組;C:達(dá)那唑+siRNA組

圖3 達(dá)那唑+siRNA對子宮肌瘤細(xì)胞凋亡的影響

討 論

子宮肌瘤的發(fā)病機(jī)制可能與遺傳傾向、性激素及局部微環(huán)境等導(dǎo)致子宮平滑肌細(xì)胞異常增生,其中雌激素的影響是子宮肌瘤發(fā)病的主要因素[3]。達(dá)那唑是人工合成的 17-α-乙炔睪酮衍生物，可通過阻斷下丘腦促性腺激素釋放激素( GnRH) 和垂體促性腺激素(GTH)的釋放,從而抑制卵巢雌孕激素的合成，是傳統(tǒng)治療子宮肌瘤及控制癥狀的有效藥物，但長期口服達(dá)那唑治療可產(chǎn)生體重增加、肝腎功能損害、潮熱、焦慮等副作用[4]，而達(dá)那唑減量治療子宮肌瘤,又影響了療效[5]。達(dá)那唑可抑制卵巢甾體激素合成,或競爭性與雌孕激素受體結(jié)合,導(dǎo)致不排卵及閉經(jīng),致使卵巢功能暫時衰退，因而限制了其臨床應(yīng)用[6]。如能發(fā)現(xiàn)子宮肌瘤有效的靶向性藥物對于改善子宮肌瘤患者生活質(zhì)量,提高臨床治療療效具有重要意義。

前期工作中，我們采用基因芯片高通量篩選獲得子宮肌瘤組織和正常子宮平滑肌組織之間表達(dá)顯著差異的基因AK000953，差異倍數(shù)為2.398～12.071倍,提示AK000953作為一種與蛋白翻譯表達(dá)相關(guān)的基因在子宮肌瘤呈現(xiàn)高表達(dá),可能參與子宮肌瘤細(xì)胞的增殖,促進(jìn)子宮肌瘤的發(fā)生發(fā)展,可能是子宮肌瘤發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵因子[2]。AK000953是與蛋白翻譯合成相關(guān)的基因,目前AK000953相關(guān)報道較少，其功能及生物學(xué)效應(yīng)尚不清楚。siRNA可介導(dǎo)哺乳動物細(xì)胞特異性基因沉默,具有高效性和特異性,系基因功能研究和腫瘤基因治療的新技術(shù)[7]。為進(jìn)一步探討AK000953基因?qū)ψ訉m肌瘤是否具有治療效果，本課題以原代培養(yǎng)的子宮肌瘤細(xì)胞為研究對象，采用RNAi技術(shù)沉默AK000953基因表達(dá),研究AK000953 siRNA聯(lián)合達(dá)那唑?qū)ψ訉m肌瘤細(xì)胞增殖、凋亡的影響。MTT結(jié)果表明AK000953 siRNA+達(dá)那唑可顯著增強(qiáng)對子宮肌瘤細(xì)胞的抑制效應(yīng)。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示AK000953 siRNA+達(dá)那唑凋亡率顯著高于對照組和達(dá)那唑組。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果均提示，AK000953 siRNA可顯著促進(jìn)達(dá)那唑?qū)ψ訉m肌瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性，可能是子宮肌瘤分子靶向治療的良好候選靶點(diǎn)。

綜上所述,本研究以原代培養(yǎng)的子宮肌瘤細(xì)胞為研究對象,用MTT法和流式細(xì)胞術(shù)均證實(shí)siRNA靶向沉默AK000953表達(dá)后能有效增強(qiáng)達(dá)那唑?qū)×黾?xì)胞的殺傷作用,提示AK000953有可能成為子宮肌瘤的治療靶點(diǎn)。

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(收稿：2016-08-01)

*蘭州軍區(qū)醫(yī)藥衛(wèi)生資助課題(CLZ12GA23)

子宮 肌瘤 達(dá)那唑 RNA,小分子干擾 細(xì)胞增殖 細(xì)胞凋亡 @AK000953基因

R737.33

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.02.005

△通訊作者