針刺“足三里”穴對脾氣虛模型大鼠下丘腦及小腸組織CCK、CCK-AR表達(dá)的影響*

薛亞楠，曲 怡，王建波，李欣欣，勇入琳，張立德△

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽 110032；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臟象理論及應(yīng)用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽 110847)

針刺“足三里”穴對脾氣虛模型大鼠下丘腦及小腸組織CCK、CCK-AR表達(dá)的影響*

薛亞楠1，曲 怡2，王建波1，李欣欣1，勇入琳1，張立德1△

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽 110032；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臟象理論及應(yīng)用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽 110847)

目的：觀察電針雙側(cè)“足三里”穴對脾氣虛模型大鼠下丘腦及小腸組織膽囊收縮素(CCK)及其受體(CCK-AR)表達(dá)的影響。 方法：隨機(jī)將40只SD大鼠分為4組，即正常組、脾氣虛組、足三里組和非經(jīng)非穴組，每組10只。除正常組外，其余3組均采用力竭游泳和不規(guī)則飲食復(fù)合法建立脾氣虛證大鼠模型。依據(jù)造模評定標(biāo)準(zhǔn)造模成功后，足三里組給予電針大鼠雙側(cè)“足三里”穴干預(yù)處理，采用疏密波，1次/天，20 min/次，連續(xù)6天；治療結(jié)束后，10%水合氯醛腹腔麻醉，取下丘腦及小腸組織，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測大鼠小腸組織CCK含量變化，熒光定量PCR法檢測大鼠小腸及下丘腦組織CCK及CCK-AR mRNA表達(dá)水平。結(jié)果：脾氣虛組和非經(jīng)非穴組下丘腦及小腸組織中CCK 、CCK-AR mRNA表達(dá)水平明顯高于正常組(P<0.05)；足三里組下丘腦及小腸組織中CCK及CCK-AR mRNA表達(dá)水平相比于脾氣虛組降低(P<0.05)，非經(jīng)非穴組未見顯著性差異(P<0.05)。結(jié)論：針刺“足三里”穴可以調(diào)節(jié)脾氣虛大鼠小腸及下丘腦組織CCK及CCK-AR的異常分泌，發(fā)揮其外周和中樞效應(yīng)對脾氣虛證起調(diào)控作用。

針刺；足三里；小腸；下丘腦；CCK

早期研究證實(shí)[1]，足三里穴作為胃經(jīng)常用穴位，針刺不僅可以消除上腹脹痛、惡心、噯氣等，還可以通經(jīng)活絡(luò)、調(diào)暢氣血，調(diào)節(jié)脾胃功能。胃腸激素作為一種調(diào)節(jié)肽，對胃腸生理功能有著重要的調(diào)節(jié)作用。已有研究表明脾虛時(shí)消化系統(tǒng)處于紊亂的病態(tài)，胃腸激素在其中發(fā)揮著重要作用。CCK作為胃腸激素和神經(jīng)肽，廣泛分布于消化系統(tǒng)、中樞及外周系統(tǒng)等組織器官中，故本實(shí)驗(yàn)以脾氣虛大鼠為對象，研究電針雙側(cè)“足三里”穴對脾氣虛證大鼠CCK和CCK-AR的干預(yù)效應(yīng)，以揭示“足三里”穴對脾氣虛證的調(diào)控機(jī)制。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SPF級SD大鼠40只，體質(zhì)量(200～220)g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2012-0001。

1.2 試劑

大鼠膽囊收縮素(CCK)ELISA試劑盒，引物設(shè)計(jì)合成(北京博邁德基因技術(shù)有限公司)，PCR反轉(zhuǎn)試劑盒(ProtoScript First Strand cDNA Synthesis Kit)，熒光定量PCR試劑盒(Agilent Technologies)，Trizol?Reagent(Invitrogen life technologies)，無水乙醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，無核酸酶水(由500 ml超純水和0.5 ml DEPC混合后過夜，并高壓滅菌)，氯仿(安徽時(shí)聯(lián)特種溶劑股份有限公司)，異丙醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。見表1。

表1 引物信息

1.3 主要儀器

華佗牌針灸針(0.25 mm×13 mm，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)，華佗牌電子針療儀(SDZ-Ⅱ型，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)，熒光定量PCR儀(Applied Biosysterms 7500 Fast Real-Time PCR Systerm),梯度PCR擴(kuò)增儀(Applied Biosystems),超微量紫外分光光度計(jì)(NanoDrop2000),多功能酶標(biāo)儀(SpectraMax I3 奧地利MD公司)。

2 方法

2.1 分組與造模

適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，用隨機(jī)數(shù)字表法[2]將大鼠分為正常組、脾氣虛組、足三里組、非經(jīng)非穴組，每組10只。正常組每日自由進(jìn)食飲水；其余組采用力竭游泳及飲食不節(jié)的復(fù)合因素建立脾氣虛證候模型：先飽食1天，再禁食2天，每日自由飲水，3天為一周期，并每日于水溫35℃～37℃的水槽中游泳，以力竭(即大鼠鼻尖沒入水面10 s)為度，1次/天。5個(gè)周期后造模結(jié)束。

2.2 干預(yù)方法

造模結(jié)束后，足三里組用0.25×13 mm毫針針刺大鼠雙側(cè)膝關(guān)節(jié)外側(cè)腓骨小頭下3.5 mm “足三里”穴，直刺5 mm，連接電針儀，采用疏密波，頻率2 Hz/15 Hz，每日1次，每次20 min，連續(xù)6天；非經(jīng)非穴組在雙側(cè)髂脊上10～15 mm、后正中線旁開20 mm區(qū)段內(nèi)選擇1個(gè)固定對照點(diǎn)確定為非經(jīng)非穴點(diǎn)[3]，平刺8～10 mm，給予同等條件下的電針處理，持續(xù)6天。

2.3 標(biāo)本采集與檢測

各組大鼠均于末次電針干預(yù)處理后，禁食不禁水24 h，用10%水合氯醛腹腔麻醉(3 ml/kg體重)，取小腸、下丘腦組織，液氮浸泡后凍存于-80℃冰箱待用。

2.4 ELISA法檢測小腸組織CCK蛋白含量

取小腸組織0.1 g，加入PBS溶液制成10%組織勻漿液，組織研磨后離心取上清；嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書操作，在450 nm波長下測定各孔OD值，以濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)OD值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線，按照曲線方程計(jì)算各樣本濃度。

2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測小腸組織CCK、CCK-AR基因表達(dá)水平

取適量下丘腦、小腸組織0.1 g，用Trizol法提總RNA；采用超微量紫外分光光度計(jì)測定260 nm、280 nm、OD260/OD280比值及RNA濃度。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反轉(zhuǎn)條件：25℃ 10 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min；熒光定量PCR儀進(jìn)行基因表達(dá)量的檢測，每個(gè)反應(yīng)體系總體積為20 μL，反應(yīng)參數(shù)：預(yù)變性95℃ 10 min，變性95℃ 30 s，退火59℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組大鼠一般情況

正常組大鼠始終反應(yīng)靈敏、飲食量正常、被毛濃密有光澤、糞便呈棕褐色顆粒狀。其余組大鼠隨著造模時(shí)間的延長，逐漸出現(xiàn)食量減少、神疲乏力、喜扎堆、被毛枯槁無華、體重下降等“脾氣虛”癥狀；經(jīng)電針干預(yù)處理后，足三里組大鼠上述癥狀減輕，反應(yīng)較之前靈敏，食欲轉(zhuǎn)好，食量增加，被毛疏散但有光澤，糞便呈顆粒狀；非經(jīng)非穴組未見明顯改善。

3.2 各組大鼠小腸組織CCK含量

統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：與正常組相比，脾氣虛組大鼠小腸組織CCK含量升高(P<0.05)；與脾氣虛組比較，足三里組大鼠小腸組織CCK含量降低(P<0.05)，非經(jīng)非穴組大鼠未見顯著性差異(P>0.05)。見表2、圖1。

表2 各組大鼠小腸組織CCK平均含量(±s)

注：與正常組比較，●P<0.05；與脾氣虛組比較，▲P<0.05

圖1 各組大鼠小腸組織CCK含量比較(n=10，±s)注：與正常組比較，●P<0.05；與脾氣虛組比較，▲P<0.05

3.3 各組大鼠小腸組織CCK及CCK-AR的mRNA表達(dá)

統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：與正常組相比，脾氣虛組大鼠小腸組織CCK及CCK-AR的mRNA表達(dá)上調(diào)(P<0.05)；與脾氣虛組相比，足三里組大鼠小腸組織CCK及CCK-AR的mRNA表達(dá)下調(diào)(P<0.05)，非經(jīng)非穴組未見顯著性差異(P>0.05)。見表3、圖2。

表3 各組大鼠小腸組織CCK及CCK-AR的mRNA表達(dá)(±s)

注：與正常組比較，●P<0.05；與脾氣虛組比較，▲P<0.05

圖2 各組大鼠小腸組織CCK及CCK-AR的mRNA表達(dá)(n=10，±s)注：與正常組比較，●P<0.05；與脾氣虛組比較，▲P<0.05

3.4 各組大鼠下丘腦組織CCK及CCK-AR的mRNA表達(dá)

統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：與正常組相比，脾氣虛組大鼠下丘腦組織CCK及CCK-AR的mRNA表達(dá)上調(diào)(P<0.05)；與脾氣虛組相比，足三里組大鼠下丘腦組織CCK及CCK-AR的mRNA表達(dá)下調(diào)(P<0.05)，非經(jīng)非穴組未見顯著性差異(P>0.05)。見表4、圖3。

表4 各組大鼠下丘腦組織CCK及CCK-AR的mRNA表達(dá)(±s)

注：與正常組比較，●P<0.05；與脾氣虛組比較，▲P<0.05

圖3 各組大鼠下丘腦組織CCK及CCK-AR的mRNA表達(dá)(n=10，±s)注：與正常組比較，●P<0.05；與脾氣虛組比較，▲P<0.05

4 討論

傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，脾主運(yùn)化即指脾將水谷化為精微物質(zhì)，并將其轉(zhuǎn)輸至全身臟腑組織的功能，實(shí)際就是脾對營養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收和運(yùn)輸?shù)墓δ?。即西醫(yī)所說的消化功能，所以，一旦脾主運(yùn)化功能失調(diào)就會(huì)使消化吸收障礙，產(chǎn)生便溏、倦怠乏力等相應(yīng)病證[4]。脾氣虛證是中醫(yī)臨床常見證候之一，《內(nèi)經(jīng)》就曾提到過脾氣虛證所涉及的癥狀以及與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)相關(guān)的消化系統(tǒng)疾病，表現(xiàn)居多為胃腸道消化吸收功能低下、胃排空加速等癥狀。研究表明[5-7]，胃腸激素分泌紊亂是導(dǎo)致胃腸功能障礙和脾虛證發(fā)生的原因之一，脾氣虛大鼠體內(nèi)存在SS、SP、CCK等胃腸激素表達(dá)的異常。脾氣虛CCK含量的改變及其受體敏感性的變化，常引起消化道動(dòng)力性疾病的發(fā)生[8-9]。本實(shí)驗(yàn)通過觀察電針刺激脾氣虛大鼠雙側(cè)“足三里”穴對小腸及下丘腦組織中CCK及CCK-AR表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討“足三里”穴對脾氣虛證的調(diào)控機(jī)制。

CCK是由十二指腸和空腸Ⅰ細(xì)胞合成分泌的多肽激素，廣泛分布于胃腸道和中樞神經(jīng)系統(tǒng)，除了促進(jìn)膽囊收縮外，還可以調(diào)節(jié)胰酶的分泌、胃腸蠕動(dòng)、抑制胃酸分泌，參與飽腹信號的傳導(dǎo)，對消化道有廣泛、重要的調(diào)節(jié)作用[8,10-11]。早期研究顯示[8,12-13]：CCK產(chǎn)生明顯的外周和中樞效應(yīng)，胃和迷走神經(jīng)是其外周作用部位。在外周，CCK的飽和效應(yīng)一方面通過CCK-AR刺激迷走神經(jīng)介導(dǎo)，另一方面通過促進(jìn)膽囊收縮、胰酶分泌和脂肪的消化吸收而抑制進(jìn)食，且濃度與胃的排空率呈反比關(guān)系。實(shí)驗(yàn)證實(shí)[14-15]，使用CCK-AR可抵消高脂飲食引起的進(jìn)食量的降低和飽腹感。CCK作為中樞神經(jīng)遞質(zhì)，被認(rèn)為是一種飽感因子，是一個(gè)重要的“飽食中樞興奮”信號，不僅能與其他攝食相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)相互作用，還能通過介導(dǎo)CCK-AR對中樞攝食和飽腹感起調(diào)節(jié)作用。脾虛造模組在血漿和組織中均有CCK濃度升高，抑制胃腸運(yùn)動(dòng)[16-19]。

本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，脾氣虛組大鼠表現(xiàn)為倦怠乏力、食欲下降、體重減輕，CCK及CCK-AR在下丘腦和小腸組織中表達(dá)均有所提高，CCK抑制胃動(dòng)力，產(chǎn)生飽腹感而減少進(jìn)食，其作用結(jié)果與脾氣虛模型動(dòng)物消化功能下降吻合。一方面是通過它對胃腸道的直接作用，另一方面是通過與CCK-AR結(jié)合在中樞發(fā)揮作用而實(shí)現(xiàn)的。電針刺激“足三里”穴能明顯降低脾氣虛大鼠下丘腦和小腸組織CCK及CCK-AR的表達(dá)水平，從上述CCK的生理作用來看，這可能有利于促進(jìn)胃排空、縮短胃排空時(shí)間、增強(qiáng)食欲、增加進(jìn)食量，進(jìn)而改善脾氣虛大鼠食欲下降、攝食減少、體重減輕等癥狀，從而起到一定的調(diào)控作用。

[1] 孫亦農(nóng).《靈樞經(jīng)》中足三里穴的治療作用[J].南京中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),1994(6):37-38

[2] 苗明三.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].北京:中國中醫(yī)藥出版社,1997:142

[3] 林鶯,紀(jì)峰,黃桂榕,等.針刺實(shí)驗(yàn)研究中大鼠非經(jīng)非穴選取方法及思考[J].針刺研究,2013(4):334-338

[4] 蔡琴,程東慶.中醫(yī)脾虛證本質(zhì)的中西醫(yī)結(jié)合研究進(jìn)展[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥,2009,5(10):133-136

[5] 孫曉芬,程衛(wèi)東,段永強(qiáng),等.脾虛大鼠血清及胃組織中胃腸激素SS、GAS和CCK的變化及中藥干預(yù)研究[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥,2014,25(3):756-758

[6] 段永強(qiáng),程衛(wèi)東,杜娟,等.四君子湯對脾氣虛大鼠SP/CCK和Mapk14mRNA表達(dá)水平的影響[J].中藥材,2014,37(4):656-660

[7] 費(fèi)曉燕,謝建群,鄭昱,等.疏肝飲對腹瀉型腸易激綜合征模型大鼠胃動(dòng)素和膽囊收縮素的影響[J].上海中醫(yī)藥雜志,2008,42(4):63-65

[8] 鄒百倉.膽囊收縮素與消化道運(yùn)動(dòng)[J].國外醫(yī)學(xué)·消化系疾病分冊,2002,22(2):112-115

[9] Rehfeld JF.The New Biology of Gastrointestinal Hormones[J].Physiol Rev，1998,78(4)：1087-1108

[10] 嚴(yán)茂祥,陳芝蕓,項(xiàng)柏康.脾虛證大鼠血及結(jié)腸組織胃腸激素的變化[J].中國醫(yī)藥學(xué)報(bào),2003(2):71-72

[11] Thomas RP, Hellmich MR,Townsend CM JR,et al.Role of gastrointestinal hormones in the proliferation of normal and neoplastic tissues[J].EndocrRev,2003,24(5):571-599

[12] Yuan CS,Attele AS,Dey L,et al.Gastric effects of cholecystokinin and its interaction with leptin on brainstem neuronal activity in neonatal rats[J].J Pharmacol Exp Ther,2000,295(1):177-182

[13] McMinn JE,Sindelar DK,Havel PJ,et al.Leptin deficiency induced by fasting impairs the satiety response to cholecystokinin[J].Endocrinology,2000,141(12):4442-4448

[14] Matzinger D,Degen L,Drewe J,et al.The role of long chain fatty acids in regulating food intake and cholecystokinin release in humans[J].Gut,2000,46:688-693

[15] 于文靖,陳蘇寧,李慎賢,等.胃痛消痞方對功能性消化不良大鼠血清及胃腸組織中CCK、VIP的影響[J].實(shí)用藥物與臨床,2012,15(8):461-463

[16] Sheng B,MoranTH.Actionsof CCKin the controlsof food intake and body weight:lessons from the CCK-A receptor deficient OLETF rat[J].Neuropeptide,2002,36(2-3):171-181

[17] Pan XZ,Cai LM.Current status of gastrointestinal hormones[J].Shijie huaren xiaohua zazhi,1999,7:464-466

[18] Bi S,Scott KA,Kopin AS,et al.Differential roles for cholecystokinin A receptors in energy balance in rats and mice[J].Endocrinology,2004,145(8):3873-3880

[19] Hidalgo L,Clara P,Estorch M,et al.Effect of cholecystokinin_A receptor blockade on postprandial insulinaemia and gastric emptying in humans[J].Neurogastroenterol Motil,2002,14(5):519-525

Effect of Acupuncture at “Zusanli”(ST36) on the Expression of CCK and CCK-AR in the Small Intestine and Hypothalamus in Rats with Spleen Qi Deficiency Syndrome

XUE Ya-nan1,QU Yi2,WANG Jian-bo1,LI Xin-xin1,YONG Ru-lin1,ZHANG Li-de△

(1.LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shenyang110032,China; 2.KeyLaboratoryofMinistryofEducationofTheoryandApplicationofTCMViscera,LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shenyang110847,China)

Objective：To observe the effect of electroacupuncture at bilateral “Zusanli” on the expression of cholecystokinin (CCK) and its receptor(CCK-AR) in small intestine and hypothalamus of spleen Qi deficiency model rats.Methods：40 SD rats were randomly divided into four groups,normal group,spleen Qi deficiency group,Zusanli group and non-acupoint group,with 10 in each group.Except the normal group, other three groups received exhaustive swimming and irregular diet to establish the models of spleen Qi deficiency syndrome.Zusanli group was given interventive treatment by acupuncturing at bilateral “Zusanli” after modeling based on the standard for modeling evaluation,using density wave,1 time/d, 20 min/time,lasting six days;after treatment,with 10% chloral hydrate intraperitoneal anesthesia,take out the small intestine and hypothalamus.The changes of CCK content in small intestine tissue of rats were detected by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA).Detect CCK and mRNA CCK-AR expression in rats’ small intestine and hypothalamus by fluorescence quantitative PCR.Results：The CCK and CCK-AR mRNA expression levels in hypothalamus and small intestine tissues in spleen Qi deficiency group and non-acupoint group were significantly higher than those in normal group(P<0.05);CCK and CCK-AR mRNA expression levels in hypothalamus and small intestine tissue were significantly decreased in Zusanli group compared with those in the spleen Qi deficiency group (P<0.05).Conclusion：Acupuncture at “Zusanli” can regulate the abnormal secretion of CCK and CCK-AR in small intestine and hypothalamus of rats with spleen Qi deficiency,playing a regulative role of peripheral and central action in the function of spleen Qi deficiency syndrome.

Acupuncture;Zusanli;Small intestine;Hypothalamus;CCK

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(973計(jì)劃)，編號：2012CB518503；遼寧省教育廳創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目，編號:LT2014021。

薛亞楠(1991-)，女，2016級針灸推拿專業(yè)碩士研究生。

△通訊作者：張立德(1959-)，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，研究方向：針刺機(jī)理研究。

R245.2

A

1005-0779(2017)01-0046-04

2016-07-04