葉酸-O-羧甲基殼聚糖的制備與光譜分析

孫 雙，魏長平，傘 靖，汪鳳明，董麗丹

(長春理工大學化學與環(huán)境工程學院，吉林長春 130022)

葉酸-O-羧甲基殼聚糖的制備與光譜分析

孫 雙，魏長平?，傘 靖，汪鳳明，董麗丹

(長春理工大學化學與環(huán)境工程學院，吉林長春 130022)

殼聚糖經(jīng)羧甲基化制備出的O-羧甲基殼聚糖，采用離子交聯(lián)法與葉酸復合制備出葉酸-O-羧甲基殼聚糖復合物。通過紅外光譜、X射線衍射光譜、掃描電鏡等測試手段進行表征，探討了葉酸、O-羧甲基殼聚糖的質(zhì)量比對復合物結(jié)構(gòu)及性能的影響，利用斷尾取血法探究復合物的凝血、止血性能。結(jié)果顯示，葉酸-O-羧甲基殼聚糖凝血、止血效果顯著。當葉酸與O-羧甲基殼聚糖的質(zhì)量比為2∶5時，二者基團的作用力最強，復合物結(jié)構(gòu)最穩(wěn)定，凝血、止血效果最好。

殼聚糖；葉酸；O-羧甲基殼聚糖；光譜分析；止血性能

1 引 言

人體血液的主要成分之一是紅細胞，其細胞膜由蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、糖脂和無機離子等組成，表面帶負電荷，容易粘附在帶正電荷的材料表面[1]。殼聚糖作為甲殼素的脫乙?；苌?，是唯一帶正電荷的天然堿性多糖[2]，其氨基可與紅細胞細胞膜表面的氨酸殘基發(fā)生電荷反應(yīng)，使紅細胞大量黏附聚集于傷口處，形成血栓，從而使血液凝固[3]。同時殼聚糖具有生物相容性好、可生物降解性、免疫活性低[4-5]、止血、抑菌消炎的優(yōu)點[6-7]，在生物材料、醫(yī)學等領(lǐng)域的應(yīng)用備受關(guān)注。但殼聚糖只溶于酸性溶液，使其應(yīng)用受到限制。因此，人們將殼聚糖進行理化改性來改善其溶解性能，提高止血效果。O-羧甲基殼聚糖是殼聚糖經(jīng)過羧甲基化后的產(chǎn)物，同時含有羧基和氨基兩種基團，比殼聚糖具有更好的水溶性、免疫性、生物相容性及生物降解性等生物學特性[8-11]，同時保留了氨基的止血作用。

葉酸是水溶性的維生素，具有化學性質(zhì)簡單、方便易得、無免疫原性的優(yōu)點，葉酸-葉酸受體靶向是近年來備受青睞的一種新型藥物[12]。通過配體-受體中氨基的作用可將基因、藥物靶向?qū)敫弑磉_葉酸受體的病理組織和細胞中，而正常細胞不受影響，從而大大增加了治療的安全性和有效性[13]。本實驗制備了葉酸-O-羧甲基殼聚糖的復合物，探討了葉酸與O-羧甲基殼聚糖質(zhì)量比對復合物微觀結(jié)構(gòu)及性能的影響，利用光學測試手段對樣品進行了表征。采用成年雄性昆明鼠活體斷尾取血試驗，來考察復合物的凝血、止血性能。

2 實 驗

2.1 主要試劑

殼聚糖(生化試劑，國藥集團化學試劑有限公司)；氯乙酸(分析純)；葉酸(FA，生化試劑，惠世生化試劑有限公司)；二甲基亞砜(分析純，北京化工廠)；月桂酸鈉(分析純，阿拉丁)；乙酸鈉(分析純，沈陽市試劑四廠)。

2.2 實驗方法

稱取3.0 g殼聚糖分散于異丙醇溶液中，室溫下滴加5 mL NaOH溶液，30℃水浴下加入20 mL氯乙酸/異丙醇溶液。調(diào)pH約為7.0，洗滌、過濾、烘干，制得O-羧甲基殼聚糖(O-CMCS)。

稱取0.221 g葉酸溶解于15 mL二甲基亞砜溶液，加入月桂酸鈉(FA與月桂酸鈉的量比為1∶1)至溶解。稱取一定量的O-羧甲基殼聚糖(葉酸、羧甲基殼聚糖質(zhì)量比分別為2∶3、2∶4、2∶5、2∶6、2∶7、2∶8)溶于醋酸-醋酸鈉緩沖溶液中，加入葉酸溶液，經(jīng)反應(yīng)、離心、洗滌、過濾、烘干，制得葉酸-O-羧甲基殼聚糖粉體(FA-O-CMCS)。

選用體重為25 g左右的雄性昆明鼠，采用斷尾取血法進行體外凝血、止血試驗，每組平行測試3次，取平均值。

2.3 樣品表征

采用傅里葉變換紅外光譜儀室溫下測試樣品的紅外光譜，測量范圍為4 000～400 cm－1、采用X射線衍射光譜儀分析樣品結(jié)構(gòu)，輻射源為Cu Kα線，測試范圍為10°～90°。采用掃描電子顯微鏡觀察樣品表面形貌。

3 結(jié)果與討論

3.1 紅外光譜分析

由圖1的殼聚糖與O-羧甲基殼聚糖的紅外光譜可知，—NH2的吸收峰3 434.98 cm－1偏移到3 444.63 cm－1，偏移了10 cm－1。3 334.69 cm－1為—OH的伸縮振動峰，經(jīng)過羧甲基取代后偏移到3 294.19 cm－1，偏移了40.5 cm－1，說明羧甲基與殼聚糖的氨基、羥基均發(fā)生了反應(yīng)。在羧甲基化過程中，殼聚糖的C—O吸收峰1 261.36 cm－1消失，1 159.14 cm－1吸收峰偏移到1 108.9 cm－1，說明殼聚糖羧甲基化過程中—OH發(fā)生了反應(yīng)。殼聚糖的1 326.93 cm－1吸收峰為C—NH2的伸縮振動峰，經(jīng)羧甲基后該峰無變化。綜上所述，羧甲基化時主要是在殼聚糖的C3—OH發(fā)生取代，從而制備了O-羧甲基殼聚糖。

圖1 CTS和O-CMCS的紅外光譜Fig.1 Infrared spectra of CTS and O-CMCS

圖2為葉酸-O-羧甲基殼聚糖、葉酸及O-羧甲基殼聚糖的紅外光譜。由圖可知，3 444.63 cm－1為O-羧甲基殼聚糖中—NH2的伸縮振動峰，與葉酸復合后偏移到3 400.27 cm－1，而1 020～1 340 cm－1處C—N伸縮振動峰無變化，說明葉酸基團取代了O-羧甲基殼聚糖氨基上的氫。葉酸中3 542.99，2 962.46，2 567.08 cm－1處的吸收峰均為羧酸中—OH的伸縮振動峰，復合后該峰消失，說明復合反應(yīng)主要是葉酸中的羧基上OH與O-羧甲基殼聚糖中氨基上的H脫水作用。

葉酸對機體無任何毒副作用，其活化量比為1∶1時復合效果最佳?？紤]到葉酸價格比殼聚糖高得多，為盡量提高復合物中具有止血作用的氨基含量、經(jīng)濟性等，我們對葉酸與O-羧甲基殼聚糖(O-CMCS)質(zhì)量比分別為2∶3、2∶4、2∶5、2∶6、2∶7、2∶8的復合物進行比較分析，其紅外光譜如圖3所示。對于質(zhì)量比為2∶3的復合物，3 431.31 cm－1是葉酸的氨基的吸收峰，隨著O-羧甲基殼聚糖含量的升高，當質(zhì)量比為2∶5時，該峰偏移到3 427.27 cm－1，這是由于引入了親水基團。當葉酸與O-羧甲基殼聚糖質(zhì)量比為2∶6、2∶7、2∶8時，該峰消失，這是由于葉酸含量低使反應(yīng)不充分?？梢?，當質(zhì)量比為2∶5時，葉酸-O-羧甲基殼聚糖中的氨基含量最高，此時的止血效果最好。

圖2 FA-OCMCS、FA、O-CMCS的紅外光譜。Fig.2 Infrared spectra of FA-O-CMCS，F(xiàn)A and O-CMCS，respectively.

圖3 不同質(zhì)量比FA-O-CMCS的紅外光譜Fig.3 Infrared spectra of FA-O-CMCS with different quality proportion

3.2 XRD分析

圖4為殼聚糖、O-羧甲基殼聚糖和葉酸-O-羧甲基殼聚糖的XRD譜圖，峰的強度與其結(jié)晶性成正比。殼聚糖在19.74°及20.36°出現(xiàn)相關(guān)衍射峰，兩峰重疊。改性后的O-羧甲基殼聚糖兩峰合并為19.68°處的強衍射峰，峰形較尖銳，這說明O-羧甲基殼聚糖的結(jié)晶性較好，同時與其溶解性較差相對應(yīng)。葉酸-O-羧甲基殼聚糖在21.1°和21.98°兩次處出現(xiàn)衍射峰，兩峰部分重合，說明葉酸-O-羧甲基殼聚糖復合物的結(jié)晶性更強，基團間作用力較大，復合物結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定。

圖4 CTS、O-CMCS及FA-O-CMCS的XRD譜圖。Fig.4 XRD patterns of CTS，O-CMCS and FA-O-CMCS，respectively.

圖5為葉酸與O-羧甲基殼聚糖不同質(zhì)量比的樣品的XRD譜圖。當質(zhì)量比為2∶3時，樣品在21.72°和22.42°兩處出現(xiàn)強衍射峰；隨著O-羧甲基殼聚糖質(zhì)量的增加，峰逐漸尖銳，在24.1°處出現(xiàn)新的衍射峰；當質(zhì)量比為2∶6時，樣品的衍射峰位置改變，且24.1°處的峰消失，說明晶型發(fā)生變化；當質(zhì)量比為2∶7、2∶8時，復合物的衍射峰位置不穩(wěn)定，即晶型不穩(wěn)定，說明此時物質(zhì)結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定?？梢?，葉酸與O-羧甲基殼聚糖的質(zhì)量比為2∶5是復合物的最佳質(zhì)量比。

圖5 不同質(zhì)量比FA-O-CMCS的XRD譜圖Fig.5 XRD patterns of FA-O-CMCS with different quality proportion

3.3 SEM分析

O-羧甲基殼聚糖與葉酸-O-羧甲基殼聚糖的掃描電鏡圖如圖6所示。O-羧甲基殼聚糖為規(guī)則塊狀顆粒，顆粒大小均勻，平均粒徑約為650～700 nm；葉酸-O-羧甲基殼聚糖顆粒呈均勻球狀，分散性較好，樣品的平均粒徑約為0.9～1 μm。這說明O-羧甲基殼聚糖與葉酸復合后，通過與葉酸的鍵合作用，復合物結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定。

圖6 O-CMCS(a)與FA-O-CMCS(b)的SEM圖Fig.6 SEM images of O-CMCS(a)and FA-O-CMCS(b)

3.4 性能分析

空白試驗、殼聚糖、O-羧甲基殼聚糖、葉酸-O-羧甲基殼聚糖的凝血、止血性能測試結(jié)果如表1、表2所示，數(shù)據(jù)為平行3組測試的平均值。由表可知，殼聚糖及其衍生物在縮短凝血、止血時間上有較明顯的作用。殼聚糖平均凝血、止血時間為231 s和533 s，較空白試驗分別縮短了89 s和565 s；O-羧甲基殼聚糖的凝血、止血時間分別為200 s和471 s，復合葉酸后的葉酸-O-羧甲基殼聚糖的凝、止血時間分別為139 s和266 s，時間又縮短了61 s和205 s。復合物的凝血、止血效果較為顯著，結(jié)合微觀結(jié)構(gòu)分析可知，葉酸的復合大大增加了復合物中氨基的含量，由于氨基的止血作用及靶向作用，使復合物達到了快速止血的目的。

表1 樣品的凝血測試結(jié)果Tab.1 Coagulation test results of the sampless

圖7為空白對照組與葉酸與O-羧甲基殼聚糖在質(zhì)量比分別為2∶3、2∶4、2∶5、2∶6、2∶7、2∶8時的凝血、止血時間。由圖可知，與空白對照組相比，改性復合物有較好的止血效果。質(zhì)量比為2∶3時，復合物的凝血、止血時間分別為166 s和290 s。隨著O-羧甲基殼聚糖含量的增加，凝血、止血時間均逐漸縮短。直至質(zhì)量比為2∶5時，凝血、止血時間分別為139 s和266 s，達到最低點。然后隨著O-羧甲基殼聚糖含量的增加，凝血、止血時間又開始延長?？梢姡斮|(zhì)量比為2∶5時，復合物具有最好的凝血、止血性能。

表2 樣品的止血測試結(jié)果Tab.2 Hemostasis test results of the sampless

圖7 不同質(zhì)量比樣品的凝血、止血性能。Fig.7 Clotting and hemostatic performance of the sample with different quality proportion

4 結(jié) 論

葉酸羧基上的—OH與O-羧甲基殼聚糖氨基脫水作用生成了葉酸-O-羧甲基殼聚糖復合物，結(jié)晶性較強，顆粒大小均勻(約為0.9～1 μm)，結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定。葉酸-O-羧甲基殼聚糖的凝血、止血效果顯著，凝血、止血時間分別為139 s和266 s，有一定的凝血、止血效果。葉酸與O-羧甲基殼聚糖的質(zhì)量比為2∶5時，二者基團的作用力最強，復合物結(jié)構(gòu)最穩(wěn)定，凝血、止血效果較好。

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孫雙(1991－)，女，遼寧撫順人，碩士研究生，2014年于渤海大學獲得學士學位，主要從事醫(yī)用基礎(chǔ)功能材料的研究。

E-mail:lemondave＠sina.com

魏長平(1960－)，女，吉林長春人，教授，博士生導師，1999年于吉林大學獲得博士學位，主要從事醫(yī)用基礎(chǔ)功能材料的研究。

E-mail:changpingwei＠hotmail.com

Preparation and Spectral Analysis of Folic Acid-O-Carboxymethyl Chitosan

SUN Shuang，WEI Chang-ping?，SAN Jing，WANG Feng-ming，DONG Li-dan
(School of Chemistry and Environment Engineering，Changchun University of Science and Technology，Changchun 130022，China)?Corresponding Author，E-mail:changpingwei＠hotmail.com

O-carboxymethyl chitosan was prepared by the carboxymethyl chitosan，and the folic acid-O-carboxymethyl chitosan compounds were prepared by ion crosslinking method.The samples were characterized by means of infrared spectroscopy，X-ray diffraction and scanning electron microscopy.The influences of the mass ratio of folic acid and carboxymethyl chitosan on the composite microstructure and properties were discussed.The coagulant and hemostatic properties of the folic acid-O-carboxymethyl chitosan compounds were explored by tail blood method.The results show that the blood coagulation and hemostatic effects of the folic acid-O-carboxymethyl chitosan compounds are remarkable.When the mass ratio of folic acid and carboxymethyl chitosan is 2∶5，the interaction force between folic acid and carboxymethyl chitosan is the strongest，the complex structure is the most stable，and the blood coagulation and hemostatic effect is the best.

chitosan；folic acid；O-carboxymethyl chitosan；spectral analysis；hemostatic properties

O614

A

10.3788/fgxb20173802.0160

1000-7032(2017)02-0160-05

2016-06-28；

2016-09-24