MGIT960分枝桿菌液體快速培養(yǎng)前處理方式的臨床評價(jià)

呂純芳 張濤 盧留珠 鄭文斌

?

MGIT960分枝桿菌液體快速培養(yǎng)前處理方式的臨床評價(jià)

呂純芳 張濤 盧留珠 鄭文斌

目的 探討原裝進(jìn)口配套試劑、傳統(tǒng)常用的4%氫氧化鈉前處理液與手工配制的NaOH-NALC前處理液對分枝桿菌液體快速培養(yǎng)指標(biāo)的影響，建立一種適合國內(nèi)現(xiàn)狀的分枝桿菌液體快速培養(yǎng)前處理方法。方法 通過原裝進(jìn)口樣本前處理液、4%氫氧化鈉樣本前處理液、手工配制的NAOH-NALC對五類抗酸染色級別不同的痰標(biāo)本進(jìn)行培養(yǎng)前平行處理，觀察不同前處理方法分枝桿菌培養(yǎng)陽性率、平均報(bào)陽天數(shù)及污染率并進(jìn)行試劑成本核算。結(jié)果 三種前處理方法陽性率一致。原裝進(jìn)口試劑組和NAOH-NALC手工配制組平均報(bào)陽時(shí)間為8天，兩組沒有明顯區(qū)別，而4%氫氧化鈉樣本處理組較另兩組平均報(bào)陽天數(shù)要長，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著(P<0.01)。三種處理方式的污染率差別不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。平均每例耗材花費(fèi)情況原裝進(jìn)口試劑組86.00元、4%氫氧化鈉樣本處理組73.50元、NAOH-NALC手工配制組77.30元。結(jié)論 NAOH-NALC手工配制組相較4%氫氧化鈉組明顯縮短了分枝桿菌快速培養(yǎng)的報(bào)陽天數(shù)，污染率無差別，而相比原裝進(jìn)口試劑組耗材花費(fèi)經(jīng)濟(jì)便宜。因此NAOH-NALC手工配制前處理方式適合成為MGIT960分枝桿菌液體快速培養(yǎng)前處理首選方式。

分枝桿菌；快速培養(yǎng)；前處理；MGIT960系統(tǒng)

結(jié)核分枝桿菌的培養(yǎng)技術(shù)一直以來都作為結(jié)核病診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”。2007年，WHO推薦在全球范圍包括中等及低收入國家廣泛采用結(jié)核分枝桿菌液體快速培養(yǎng)技術(shù)[1]，這使商品化MGIT 960系統(tǒng)取代傳統(tǒng)固體培養(yǎng)方法進(jìn)行大規(guī)模臨床應(yīng)用成為了現(xiàn)實(shí)可能。目前國內(nèi)在MGIT 960商品化結(jié)核分枝桿菌液體快培技術(shù)方面的臨床使用技巧與國外相比還有一定差距，例如同樣使用MGIT 960液體快培技術(shù)，國內(nèi)的平均報(bào)陽時(shí)間平均12天左右[2-3],而國外使用者的平均報(bào)陽時(shí)間多在7-10天[4-5]，可能與國內(nèi)臨床樣本的前處理技術(shù)的不完善有著較大關(guān)系。隨著MGIT 960商品化結(jié)核分枝桿菌液體快培技術(shù)在國內(nèi)的廣泛推開，樣本前處理技術(shù)方面的探討也將成為必然。

我們本次研究采用廠家原裝進(jìn)口配套樣本前處理液、國內(nèi)臨床常用的4%氫氧化鈉樣本前處理液、手工配制的NaOH-NALC樣本前處理液對臨床痰標(biāo)本進(jìn)行培養(yǎng)前平行處理，觀察不同前處理方式對分枝桿菌培養(yǎng)的陽性率、報(bào)陽天數(shù)及污染率的影響，并進(jìn)行試劑成本核算，尋找一種目前最適合國內(nèi)現(xiàn)狀的分枝桿菌液體快速培養(yǎng)的樣本前處理方式并建立標(biāo)準(zhǔn)化的臨床操作程序以期為結(jié)核病的防治提供實(shí)驗(yàn)室技術(shù)支持。

資料與方法

一、儀器和試劑

BACTEC MGIT 960全自動分枝桿菌快速培養(yǎng)系統(tǒng)及其配套的培養(yǎng)管、營養(yǎng)添加劑、抑菌劑由BD公司生產(chǎn)。氫氧化鈉(NaOH)、N-乙酰半胱氨酸(NALC)由Sigma公司提供。二水合檸檬酸三鈉、磷酸鹽由廣東光華公司提供。

二、標(biāo)本來源

痰液標(biāo)本采自2015年1月至12月深圳市南山區(qū)慢性病防治院門診患者，涂片抗酸染色未發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌標(biāo)本40例，涂片抗酸染色陽性1+、2+、3+、4+標(biāo)本各40例，共200例。

三、前處理方式

原裝進(jìn)口配套試劑組：添加與樣本等量的 原裝商品NaOH-NALC-檸檬酸鹽溶液，振蕩，消化15min，添加磷酸鹽緩沖液至50mL,低溫離心3000g、 20min，傾去上清液，再加入少量1-2mL磷酸鹽緩沖液，重懸沉淀物，進(jìn)行MGIT培養(yǎng)管接種。4%氫氧化鈉樣本處理組：制備4% NaOH溶液，根據(jù)標(biāo)本的粘稠程度，加1-2倍體積的4%NaOH，振蕩，消化15min，添加磷酸鹽緩沖液至50mL,低溫離心3000g、20min，傾去上清液，再加入少量磷酸鹽緩沖液，重懸沉淀物，進(jìn)行MGIT培養(yǎng)管接種。NAOH-NALC手工配制組：制備2.9%的檸檬酸鈉溶液，高壓滅菌。使用之前先將等量的4%NaOH溶液與檸檬酸鈉溶液混合，添加NALC粉末，實(shí)現(xiàn)終濃度2% NaOH+0.5% NALC溶液，混合均勻并在同一天使用，超過24小時(shí)之后，NALC就會喪失活性。在標(biāo)本中加入標(biāo)本等量的混合溶液，振蕩，消化15min，添加磷酸鹽緩沖液至50mL,低溫離心3000g、 20min，傾去上清液，再加入少量1-2mL磷酸鹽緩沖液，重懸沉淀物，進(jìn)行MGIT培養(yǎng)管接種。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)的整理分析使用SAS9.1軟件。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的計(jì)量資料偏態(tài)分布采用中位數(shù)和四分位數(shù)間距表示，率的比較采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行，如果不滿足χ2檢驗(yàn)條件，則采用確切概率法進(jìn)行率的比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、抗酸染色級別不同的痰標(biāo)本MGIT960液體結(jié)核分枝桿菌分離培養(yǎng)陽性率和平均報(bào)陽時(shí)間

本實(shí)驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)將痰涂片陽性級別一致的痰涂片分為一組，每組40例(5組，共200例)，來消除痰涂片陽性級別對報(bào)陽時(shí)間的影響，每一份痰樣本分別采用原裝進(jìn)口配套試劑、傳統(tǒng)常用的4%氫氧化鈉前處理液與手工配制的NaOH-NALC前處理液平行前處理后培養(yǎng)，比較三組的陽性率、平均報(bào)陽時(shí)間。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示三組陽性率一致(見表1)。

表1 不同的痰標(biāo)本MGIT960液體結(jié)核分枝桿菌分離培養(yǎng)陽性率(陽新例數(shù)/總例數(shù))

平均報(bào)陽時(shí)間采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)的秩和檢驗(yàn)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示P<0.0001，表明三組平均報(bào)陽時(shí)間是不同的，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步進(jìn)行兩兩比較顯示原裝進(jìn)口試劑組和NAOH-NALC手工配制組平均報(bào)陽時(shí)間為8天，兩組沒有明顯區(qū)別，而4%氫氧化鈉樣本處理組較另兩組平均報(bào)陽天數(shù)要長，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著，P<0.01。(見表2)。

二、痰涂片抗酸染色級別不同MGIT960液體結(jié)核分枝桿菌分離培養(yǎng)污染情況

采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行率的比較，結(jié)果顯示P值均大于0.05，表明三種培養(yǎng)方式的污染情況差別不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(見表3)。

三、三種前處理方法耗材花費(fèi)

本次試驗(yàn)研究還對三種前處理方式MGIT960液體結(jié)核分枝桿菌分離培養(yǎng)所需試劑耗材進(jìn)行了試劑成本核算，為試驗(yàn)方法提供試劑花費(fèi)評估。NAOH-NALC手工配制組相比原裝進(jìn)口試劑組耗材花費(fèi)經(jīng)濟(jì)便宜。(見表4)。

討 論

結(jié)核病全球疫情依然十分嚴(yán)重,據(jù)據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization, WHO)統(tǒng)計(jì)，全世界約每3個(gè)人中就有1個(gè)人感染了結(jié)核分枝桿菌，在某些發(fā)展中國家的成人中結(jié)核分枝桿菌攜帶率高達(dá)80%。作為感染性疾病的頭號殺手，全球每年都有數(shù)以百萬計(jì)的人口死于結(jié)核病。結(jié)核分枝桿菌傳統(tǒng)檢測方法主要是涂片抗酸染色和改良羅氏培養(yǎng)。隨著結(jié)核分枝桿菌液體快速培養(yǎng)技術(shù)MGIT 960在國內(nèi)外臨床的廣泛應(yīng)用[6-8]，其技術(shù)優(yōu)越性得到了充分發(fā)揮，陽性率顯著高于傳統(tǒng)羅氏培養(yǎng)法，培養(yǎng)報(bào)陽時(shí)間大幅縮短，從4周左右縮短到10-12天，為早期發(fā)現(xiàn)結(jié)核病人及對病人療效的評價(jià)起到了極大的促進(jìn)作用。

表2 抗酸染色級別不同的痰標(biāo)本MGIT960液體結(jié)核分枝桿菌分離培養(yǎng)平均報(bào)陽時(shí)間

注：因數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，采用中位數(shù)+四分位數(shù)間距表示。

表3 抗酸染色級別不同MGIT960液體結(jié)核分枝桿菌分離培養(yǎng)污染情況

表4 三種前處理方法耗材花費(fèi)(人民幣元/每人次)

由于大多數(shù)臨床痰樣本多含有大量雜菌，如果前處理去污染環(huán)節(jié)做不好，雜菌很有可能抑制分枝桿菌的生長甚至造成試驗(yàn)的污染。但過度的去雜菌防污染前處理環(huán)節(jié)也會抑制分枝桿菌的生長造成結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)的失敗[9]。因此分枝桿菌液體快培樣本前處理技術(shù)已成為商品化結(jié)核分枝桿菌快速培養(yǎng)成功與否的重要環(huán)節(jié)。國外近年來這方面的臨床研究較多，有人寄希望采用不同于傳統(tǒng)方法的新材料[10]，但更多的臨床試驗(yàn)還是集中于傳統(tǒng)方法的改良及微調(diào)[11-12]。

本研究通過采用國外廠家原裝進(jìn)口配套樣本前處理液、國內(nèi)臨床常用的4%氫氧化鈉樣本前處理液、手工配制的NaOH-NALC樣本前處理液對五類抗酸染色級別不同的痰標(biāo)本進(jìn)行培養(yǎng)前平行處理，結(jié)果顯示三種前處理方法陽性率一致。原裝進(jìn)口試劑組和NAOH-NALC手工配制組平均報(bào)陽時(shí)間為8天，兩組沒有明顯區(qū)別，而4%氫氧化鈉樣本處理組較另兩組平均報(bào)陽天數(shù)要長，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著(P<0.01)。三種處理方式的污染率差別不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。平均每例耗材花費(fèi)情況原裝進(jìn)口試劑組86.00元、4%氫氧化鈉樣本處理組73.50元、NAOH-NALC配制組77.30元。

綜上所述本研究表明NAOH-NALC手工配制組明顯縮短了分枝桿菌快速培養(yǎng)的報(bào)陽天數(shù)，污染率無差別，而相比原裝進(jìn)口試劑組耗材花費(fèi)經(jīng)濟(jì)便宜。因此NAOH-NALC手工配制前處理方式適合成為MGIT960分枝桿菌液體快速培養(yǎng)前處理首選方式。

[1] World Health Organization. Use of liquid TB culture and drug susceptibility testing (DST) in lowand mediumincome settings[R]. Geneva: World Health Organization, 2007.

[2] 張會芬，蘇俊華，李曉非，等. BACTEC MGIT960 儀的臨床應(yīng)用評價(jià)[J]. 國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2013,34(18):2453-2454.

[3] 宋媛媛，夏輝, 趙雁林.幾種液體分枝桿菌分離培養(yǎng)方法的多中心應(yīng)用評估[J].醫(yī)學(xué)研究雜志,2013,42(1):30-32.

[4] Jayakumar KV,Forster T,Kyi MS.Improved detection of Mycobacterium spp. using the BACTEC MGIT 960 system[J].Br J Biomed Sci,2001,58(3):154-158.

[5] Apers L,Mutsvangwa J,Magwenzi J,et al.A comparison of direct microscopy, the concentraion method and the Mycobacteria Growth Indicator Tube for the examination of sputum for acid fast bacilli[J].Int J Tuberc Lung Dis,2003,7(4),376-381.

[6] Hanna BA, Ebrahimzadeh A, Elliott LB, et al. Multicenter evaluation of the BACTEC MGIT 960 system for recovery of mycobacteria[J]. J Clin Microbiol, 1999,37(3):748-752.

[7] Kontos F, Petinaki E, Nicolaou S, et al. Multicenter evaluation of the fully automated bactec MGIT 960 system and three molecular methods for the isolation and the identification of mycobacteria from clinical specimens[J]. Diagn Microbiol Infect Dis, 2003,46(4):299-301.

[8] 張濤, 呂純芳, 盧留珠，等. BACTEC MGIT960系統(tǒng)快速培養(yǎng)分枝桿菌的效果評價(jià)[J]. 臨床肺科雜志, 2011,16(5):717-718.

[9] Frieden TR,Sterling TR, Munsiff SS, et al.Tuberculosis[J].Lancet,2003,362(9387):887-899.

[10] Wilson S, Lane A, Rosedale R,et al.Concentration of Mycobacterium tuberculosis from sputum using ligand-coated magnetic beads[J]. Int J Tuberc Lung Dis,2010,14(9):1164-1168.

[11] Buijtels PC, Petit PL. Comparison of NaOH-N-acetyl cysteine and sulfuric acid decontamination methods for recovery of mycobacteria from clinical specimens[J]. J Microbiol Methods, 2005,62(1):83-88.

[12] Peres RL, Maciel EL, Morais CG, et al. Comparison of two concentrations of NALC-NaOH for decontamination of sputum for mycobacterial culture[J]. Int J Tuberc Lung Dis,2009,13(12):1572-1575.

Clinical evaluation of the pretreatment method for rapid culture of Mycobacterium tuberculosis MGIT960 system

LYUChun-fang,ZHANGTao,LULiu-zhu,ZHENWen-Bin

ShenzhenNanshanCenterforChronicDiseaseControl,Shenzhen,Guangdong518054,China

Objective To establish a pretreatment method for mycobacterium tuberculosis rapid culture in the domestic situation and to discuss the effect on indicators of the rapid culture for mycobacterium tuberculosis comparing the pretreatment methods which include original imported kit, traditional 4% sodium hydroxide pretreatment solution and handcrafted NaOH-NALC pretreatment liquid. Methods Parallel pretreatment culture of the five level of acid fast staining sputum were through original imported kit, traditional 4% sodium hydroxide pretreatment solution and handcrafted NaOH-NALC pretreatment liquid. The positive reporting days, positive rate, contamination rate and reagent cost were analyzed. Results The positive rate of the three methods were consistent. There was no significant difference between the original import reagent group and the NAOH-NALC preparation group. The average positive report time was 8 days. The average positive report days of the 4% sodium hydroxide group was longer, which was statistically significant difference with the other two groups (P<0.01). The pollution rate of the three treatments was not statistically significant. The average cost of each case was 86.00 Yuan in the original import reagent group, 73.50 Yuan in the 4% sodium hydroxide group, and 77.30 Yuan in the handcrafted NaOH-NALC group. Conclusion Compared with the 4% sodium hydroxide group, the positive report days of rapid culture of mycobacterium in the handcrafted NaOH-NALC group is significantly reduced and the pollution rate has no difference, but the average cost in the handcrafted NaOH-NALC group is cheaper than the original import reagents group. Therefore, the handcrafted NaOH-NALC pretreatment method is suitable to become the preferred pretreatment method of MGIT960 Mycobacterium liquid rapid culture.

mycobacteria; rapid culture; pretreatment; MGIT960 system

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.03.038

深圳市南山區(qū)科技創(chuàng)新局資助(No 2014018)

518054 廣東 深圳，深圳市南山區(qū)慢性病防治院

2016-05-06]