紅景天苷對高糖誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞中線粒體過度分裂的作用及機(jī)制※

莊心宇，高秀芳，施海明

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·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)論著/研究·

紅景天苷對高糖誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞中線粒體過度分裂的作用及機(jī)制※

莊心宇，高秀芳，施海明

目的 探討中藥紅景天苷對高糖培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞 (VSMCs)增殖和線粒體動力學(xué)的調(diào)控作用及機(jī)制。方法 將對數(shù)增殖期的VSMCs隨機(jī)分為低糖(5 mmol/L)培養(yǎng)和高糖(25 mmol/L)培養(yǎng)兩組，每組再分為5個亞組，分別在普通培養(yǎng)基(對照組)、低濃度紅景天苷(0.3 mmol/L)、高濃度紅景天苷(0.5 mmol/L)、低濃度Mdivi-1(10 μmol/L)、高濃度Mdivi-1(25 μmol/L)5種干預(yù)條件下培養(yǎng)24 h，采用Western Blot和real time PCR檢測線粒體動力學(xué)相關(guān)蛋白Drp1和Mfn2的表達(dá)水平，采用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察線粒體內(nèi)膜情況，Image J軟件分析線粒體碎片計數(shù)(MFC)。后用siRNA抑制Mfn2，觀察VSMCs增值情況。結(jié)果 在高糖培養(yǎng)條件下，VSMCs過度增殖，同時線粒體分裂增多，Drp1表達(dá)增加，Mfn2表達(dá)減少。紅景天苷和Mdivi-1干預(yù)條件下，VSMCs，線粒體分裂，Drp1表達(dá)均明顯受抑制，而Mfn2表達(dá)增加。抑制Mfn2表達(dá)，VSMCs增殖部分恢復(fù)高糖水平。結(jié)論 紅景天苷可以部分通過抑制線粒體分裂(下調(diào)Drp1和上調(diào)Mfn2)抑制高糖誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞過度增殖。

紅景天苷；血管平滑肌細(xì)胞；細(xì)胞增殖；線粒體動力學(xué)

盡管有大量相關(guān)的基礎(chǔ)和臨床研究，心血管疾病仍然是全球患病率和死亡率最高的疾病之一[1]。糖尿病作為心血管疾病的等危癥，能夠顯著增加冠心病的風(fēng)險，并且在糖尿病相關(guān)死亡中由缺血性心血管并發(fā)癥導(dǎo)致的高達(dá)75%[2]。糖尿病動物模型和糖尿病病人的動脈組織病理檢查均顯示原本處于動脈中膜的血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)過度增殖，并遷移至動脈內(nèi)膜，伴隨細(xì)胞外基質(zhì)合成增多，最終導(dǎo)致動脈壁增厚和血管狹窄。因此，糖尿病病人冠心病死亡率和冠狀動脈支架后再狹窄率增加[3]。線粒體產(chǎn)能是哺乳動物主要的能量來源。線粒體動力學(xué)是通過調(diào)節(jié)線粒體融合和分裂過程來維持網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)態(tài)的過程。線粒體融合-分裂的相對速率影響線粒體形態(tài)、數(shù)量和分布特征，這一過程被與動力蛋白相關(guān)的GTP蛋白酶精細(xì)調(diào)控，包括線粒體融合相關(guān)蛋白-1(Mfn1)、線粒體融合相關(guān)蛋白-2(Mfn2)、線粒體分裂相關(guān)蛋白，如線粒體分裂蛋白1(Drp1)和分裂蛋白1(Fis1)[4]。其中，Drp1已被證實在細(xì)胞存活、凋亡和線粒體自噬中均發(fā)揮重要作用[5-7]。

線粒體分裂抑制劑(Mdivi-1)是一種高效的小分子物質(zhì)，通過阻斷Drp1自我組裝，選擇性地抑制其GTP蛋白酶活性，快速可逆性且劑量依賴性地抑制網(wǎng)絡(luò)狀線粒體形成[8-9]。已有研究提示Mdivi-1的半抑制濃度(IC50)為10 μmol/L并且最高作用劑量可達(dá)100 μmol/L[10]。近幾年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)線粒體動力學(xué)相關(guān)蛋白和血管平滑肌細(xì)胞增殖有關(guān)，并可能成為一個新的干預(yù)靶點。但是糖尿病情況下，通過影響線粒體動力學(xué)而影響VSMCs增殖的作用，還未有相關(guān)研究證實。

紅景天苷(p-對羥基苯-bD-葡萄糖苷)是傳統(tǒng)中藥紅景天中的主要活性成分[11]。先前研究發(fā)現(xiàn)紅景天苷對神經(jīng)、心臟、肝臟和血管均可發(fā)揮一定的保護(hù)作用并且參與調(diào)節(jié)血糖代謝[12-16]。同時，在體外試驗中，利用次氯酸誘導(dǎo)的紅細(xì)胞內(nèi)發(fā)生氧化應(yīng)激，證實紅景天苷能夠?qū)寡趸瘧?yīng)激效應(yīng)[17-18]。上述結(jié)果提示紅景天苷可以成為抑制高糖情況下VSMCs增殖，調(diào)控線粒體動力學(xué)的有效藥物治療。

本實驗旨在研究紅景天苷是否能通過調(diào)節(jié)線粒體動力學(xué)從而抑制高糖誘導(dǎo)的VSMCs過度增殖，同時比較紅景天苷和Mdivi-1對線粒體動力學(xué)的調(diào)節(jié)作用差異，初步探討紅景天苷發(fā)揮保護(hù)作用的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 大鼠VSMCs購自上海然泰生物制品公司，低糖DMEM和高糖DMEM培養(yǎng)液購自Gibco公司，胎牛血清購自Sigma公司，紅景天苷購自雷允上藥業(yè)，BrdU試劑盒、鼠抗Drp 1、抗Mfn2抗體購自Abcam公司，Mito-Tracker紅購自Beyotime生物科技，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自Millipore公司，兔抗GAPDH抗體購自Santa Cruz生物科技，總RNA提取試劑盒、cDNA合成逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒購自TAKARA公司。

1.2 方法

1.2.1 VSMCs培養(yǎng) 用含10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2飽和濕度的恒溫箱中培養(yǎng)，每2 d～3 d換液1次。

1.2.2 實驗分組 將對數(shù)增殖期的VSMCs隨機(jī)分為低糖(5 mmol/L)和高糖(25 mmol/L)培養(yǎng)組，每一組又分為5個亞組，分別在普通培養(yǎng)基(對照組)、低濃度紅景天苷(0.3 mmol/L)、高濃度紅景天苷(0.5 mmol/L)、低濃度Mdivi-1(10 μmol/L)、高濃度Mdivi-1(25 μmol/L)5種干預(yù)條件下培養(yǎng)24 h后，進(jìn)行下游實驗。

1.2.3 BrdU法檢測VSMCs增殖情況 各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后根據(jù)BrdU試劑盒說明書操作，測定各組細(xì)胞增殖情況，實驗獨立重復(fù)3次，每次每組設(shè)3個復(fù)孔。

1.2.4 激光掃描共聚焦顯微鏡觀察 觀察各組細(xì)胞Mito-Tracker紅染色30 min后線粒體內(nèi)膜情況。放大倍數(shù)為400×和3 000×。Image J軟件分析線粒體碎片計數(shù)(MFC)。

1.2.5 Western blot檢測VSMCs中Drp-1和Mfn2蛋白表達(dá)水平 紅景天苷和Mdivi-1干預(yù)各組細(xì)胞24 h后，根據(jù)Western blot常規(guī)操作流程，一抗4 ℃過夜，各亞組分別用鼠抗Drp1(1∶500)和鼠抗Mfn2(1∶500)和兔抗GAPDH (1∶1 000)。洗滌后加入二抗(1∶5 000)作用1 h。利用ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行信號檢測。

1.2.6 實時定量PCR分析 提取VSMCs中的總RNA，根據(jù)cDNA合成逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒說明進(jìn)行，引物序列設(shè)計如表1。利用SYBR?3Premix Ex TaqTMII定量實時PCR，根據(jù)相對mRNA 表達(dá)比例計算公式[19]計算。

表1 實時RT-PCR分析引物序列

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分

用t檢驗，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析(組間兩兩比較用SNK法)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 紅景天苷抑制高糖條件下VSMCs的增殖 與低糖條件相比，高糖可明顯誘導(dǎo)VSMCs增殖。低糖條件下，各亞組間VSMCs的增殖差異無統(tǒng)計學(xué)意義；高糖條件下，與對照組比較，0.5 mmol/L紅景天苷對VSMCs增殖有明顯抑制作用；與0.3 mmol/L紅景天苷相比，0.5 mmol/L紅景天苷對VSMCs增殖的抑制作用更明顯。詳見圖1。

注：與低糖對照組比較，*P<0.01；與高糖對照組比較，**P<0.01。

圖1 紅景天苷對低糖和高糖條件下VSMCs增殖的作用

2.2 紅景天苷抑制高糖條件下線粒體過度分裂(見圖2～圖4) 高糖能夠誘導(dǎo)球狀線粒體增加并導(dǎo)致線粒體聚集。從線狀線粒體顯著增加的比例和線粒體密度減低可以看出紅景天苷和Mdivi-1可以抑制線粒體分裂，促進(jìn)線粒體融合，且作用均顯示出濃度依賴性(線粒體融合定義為：球狀線粒體占據(jù)總線粒體<35%；線粒體分裂定義為：球狀線粒體占據(jù)總線粒體>65%)?？紤]到紅景天苷可以抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖，同時也可以抑制線粒體分裂，因此認(rèn)為其對于血管平滑肌細(xì)胞增殖的抑制作用可能是通過抑制線粒體分裂實現(xiàn)的。

注：與高糖對照組相比，*P<0.05，**P<0.01。

圖2 免疫熒光顯微鏡觀察線粒體密度和形態(tài)

圖4 紅景天苷對高糖條件下球狀線粒體/總線粒體比例的影響

2.3 紅景天苷對VSMCs中線粒體動力學(xué)相關(guān)蛋白的作用(見圖5) 在高糖條件下，Drp1水平上調(diào)，伴隨線粒體分裂增加。Mdivi-1可以有效地抑制該現(xiàn)象并且劑量依賴性的上調(diào)Mfn2。紅景天苷對Drp1和Mfn2有相似的調(diào)節(jié)作用。盡管0.3 mmol/L紅景天苷亞組和高糖對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，抑制趨勢已經(jīng)明顯存在。而0.5 mmol/L紅景天苷和10 μmol/L Mdivi-1在下調(diào)Drp1和上調(diào)Mfn2水平上作用差異無統(tǒng)計學(xué)意義。提示紅景天苷可能對線粒體動力學(xué)失衡發(fā)揮治療作用。

注：A、B、C為Drp1和Mfn2的相對蛋白表達(dá)水平；D、E為Drp1和Mfn2的相對mRNA表達(dá)水平，每組實驗重復(fù)3次。

圖5 紅景天苷對高糖條件下VSMCs中Drp1和Mfn2的作用

2.4 紅景天苷通過上調(diào)Mfn2表達(dá)抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖 與單用紅景天苷干預(yù)的亞組相比，Mfn2-siRNA亞組VSMCs增殖明顯增加，盡管其增殖水平仍然和高糖對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。這一結(jié)果提示Mfn2是紅景天苷抑制高糖誘導(dǎo)的VSMCs增殖作用過程中的調(diào)節(jié)靶點，但不是唯一的作用靶點。詳見圖6。

圖6 紅景天苷通過上調(diào)Mfn2表達(dá)抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖

3 討 論

線粒體動力學(xué)受到一組相關(guān)蛋白(例如Drp1和Mfn2)的調(diào)控[20]，這一過程對于維持線粒體穩(wěn)態(tài)十分重要。而線粒體功能失調(diào)可能導(dǎo)致一系列疾病的發(fā)生和進(jìn)展[21]。Mashboom等研究報道Mdivi-1能夠?qū)τ诜蝿用}高壓有治療作用，通過有效地抑制肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖，下調(diào)Drp1表達(dá)，同時，在過負(fù)荷心衰小鼠[22]頸動脈放置支架模型中，證實Mdivi-1可逆轉(zhuǎn)上調(diào)的Drp1和下調(diào)的Mfn2水平，抑制動脈管壁增厚和血管平滑肌細(xì)胞過度增殖。重要的是，病毒轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)Mfn2過表達(dá)[23]可能防治支架放置后狹窄。這些研究反映出線粒體動力學(xué)相關(guān)蛋白和血管平滑肌細(xì)胞增殖的緊密聯(lián)系。但是目前仍然沒有關(guān)于高糖情況下抑制線粒體分裂對于血管平滑肌細(xì)胞增殖的治療作用的研究。本實驗發(fā)現(xiàn)：Mdivi-1作為Drp1特異性抑制劑，可以通過下調(diào)Drp1和上調(diào)Mfn2在基因和蛋白水平的表達(dá)情況而抑制線粒體分裂和重新構(gòu)建線粒體網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)態(tài)，并且抑制高糖誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞過度增殖。

紅景天苷是一種從原生植物紅景天中提取的苯丙素苷，已有研究證明其改善內(nèi)皮功能和延緩動脈粥樣硬化的作用[14]。在自發(fā)性糖尿病(Goto-Kakizaki)大鼠動物模型中，紅景天苷顯示出對擴(kuò)張血管的保護(hù)性作用[15]。本研究證實紅景天苷能夠抑制高糖誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞過度增殖和線粒體過度分裂。鑒于沒有關(guān)于高糖情況下線粒體動力學(xué)對于血管平滑肌細(xì)胞增殖作用的研究，我們首次證明紅景天苷可以部分的通過抑制線粒體分裂(下調(diào)Drp1和上調(diào)Mfn2)來抑制高糖誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞過度增殖。盡管確切的抑制還需要進(jìn)一步研究，但紅景天苷可以通過維持線粒體動力學(xué)穩(wěn)態(tài)治療心血管疾病。

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(本文編輯郭懷印)

Impact of Salidroside on Mitochondrial Fission in Vascular Smooth Muscle Cells under High Glucose Conditions and Its Possible Mechanism

Zhuang Xinyu，Gao Xiufang，Shi Haiming

Huashan Hospital，F(xiàn)udan University，Shanghai 200036，China

Gao Xiufang

Objective To investigate the impact of salidroside on vascular smooth muscle cells (VSMCs) proliferation and mitochondrial dynamics under high glucose conditions，and its possible mechanism.Methods The VSMCs in proliferative phase were randomly divided into two groups：low glucose group cultured low glucose (5 mmol/L)，and high glucose group cultured high glucose (25 mmol/L).Then VSMCs in each group were divided into five subgroups：control group，low concentration salidroside group (0.3 mmol/L)，high concentration salidroside group (0.5 mmol/L)，low concentration Mdivi-1 group (10 μmol/L)，high concentration Mdivi-1 group (25 μmol/L).VSMCs were cultured by low or high concentration of salidroside or Mdivi-1 under high glucose or low glucose condition for 24 hours.The expressions of proteins related to mitochondrial dynamics including dynamin-related protein (Drp1) and mitofusin 2(Mfn2) were tested by western blot and real-time polymerase chain reaction (PCR).The mitochondria inner membrane was observed under laser scanning confocal microscope (LSCM).The mitochondrial fission count (MFC) was analyzed by Image J software.Then Mfn2 was inhibited by small interfering RNA (siRNA).VSMCs proliferation was observed.Results VSMCs was abnormally proliferated，mitochondrial fission increased，Drp1 expression increased，and Mfn2 expression reduced under high glucose condition.Salidroside and an inhibitor of Drp1 (Mdivi-1) can inhibit VSMCs proliferation，Drp1 expression and mitochondrial fission and up-regulate Mfn2 expression (all P<0.05).After using siRNA to silence Mfn2 expression，the inhibitive effect on VSMCs proliferation can be partly reversed.Conclusion Salidroside can inhibit VSMCs proliferation induced by high-glucose and may act its therapeutic effect via inhibiting mitochondrial fission by down-regulation of Drp1 expression and up-regulation of Mfn2 expression.

salidroside；vascular smooth muscle cells；proliferation；mitochondrial dynamics

復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院(上海 200036)

高秀芳，E-mail：sophiakao@126.com

R329.2 R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.01.008

1672-1349(2017)01-0029-05

2016-10-08)

※第十四次全國中西醫(yī)結(jié)合心血管病學(xué)術(shù)會議獲獎?wù)撐?/p>

引用信息：莊心宇，高秀芳，施海明.紅景天苷對高糖誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞中線粒體過度分裂的作用及機(jī)制[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2017，15(1)：29-33.