有氧運(yùn)動(dòng)抑制高血壓腦動(dòng)脈平滑肌RyR-BKCa通道功能耦聯(lián)上調(diào)

張嚴(yán)焱，劉雨佳，柏 平，吳 迎，石麗君

有氧運(yùn)動(dòng)抑制高血壓腦動(dòng)脈平滑肌RyR-BKCa通道功能耦聯(lián)上調(diào)

張嚴(yán)焱1，2，劉雨佳1，2，柏 平1，2，吳 迎2，石麗君1，2

目的：探討有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠腦動(dòng)脈平滑肌RyR-BKCa耦聯(lián)的影響。方法：12周齡雄性自發(fā)性高血壓大鼠(Spontaneous hypertension rat，SHR)以及正常血壓對(duì)照組(Wistar-Kyoto，WKY)，隨機(jī)分為正常血壓安靜組(WKY-SED)，正常血壓運(yùn)動(dòng)組(WKY-EX)，高血壓安靜組(SHR-SED)和高血壓運(yùn)動(dòng)組(SHR-EX)；運(yùn)動(dòng)組進(jìn)行8周中等強(qiáng)度跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練。8周后，取腦動(dòng)脈，酶消化法急性分離腦動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，分別采用穿孔膜片鉗和單通道內(nèi)面向外模式記錄瞬時(shí)外向電流(STOC)以及BKCa通道門(mén)控特性；鈣離子成像技術(shù)觀察胞內(nèi)鈣離子濃度變化；免疫熒光成像觀察平滑肌細(xì)胞BKCa通道α、β1亞基表達(dá)及分布情況。結(jié)果：1)經(jīng)8周有氧運(yùn)動(dòng)，WKY和SHR運(yùn)動(dòng)組收縮壓都顯著低于各自安靜組；2)穿孔膜片鉗結(jié)果顯示，SHR-SED組STOC幅值顯著高于WKY-SED組，SHR-EX組STOC幅值顯著低于SHR-SED組，而各組STOC頻率無(wú)顯著性改變；3)與WKY-SED組相比，SHR-SED組BKCa通道開(kāi)放概率(Po)顯著增加，SHR-EX組開(kāi)放概率顯著低于SHR-SED組，但WKY-EX組開(kāi)放概率卻高于WKY-SED組；4)在他莫昔芬激活下，WKY-SED和SHR-SED組BKCa通道開(kāi)放概率分別增加3.4倍和8.9倍，WKY-EX組開(kāi)放概率顯著高于WKY-SED組，但與SHR-SED組相比，運(yùn)動(dòng)顯著抑制SHR-EX組他莫昔芬誘發(fā)的開(kāi)放概率增加；5)STOC可被RyR激動(dòng)劑咖啡因激活；咖啡因能夠引起肌質(zhì)網(wǎng)鈣庫(kù)釋放，誘發(fā)全胞鈣瞬變，各組鈣釋放幅值無(wú)顯著性差異；6)BKCa通道α、β1亞基存在于平滑肌細(xì)胞質(zhì)膜上，β1亞基在胞內(nèi)也有散在分布，α亞基在各組表達(dá)無(wú)顯著性差異，β1亞基在WKY-EX和SHR-SED組中表達(dá)均顯著高于WKY-SED組，有氧運(yùn)動(dòng)顯著降低了SHR-EX組β1亞基表達(dá)量。結(jié)論：高血壓引起RyR-BKCa功能耦聯(lián)的增強(qiáng)是為了緩沖血管壓力增高誘發(fā)的腦動(dòng)脈收縮，而B(niǎo)KCa通道β1亞基功能上調(diào)是其重要因素之一；長(zhǎng)期規(guī)律有氧運(yùn)動(dòng)能有效地抑制這種病理性的代償，恢復(fù)腦血管功能。關(guān)鍵詞：高血壓；運(yùn)動(dòng)；雷諾丁受體；大電導(dǎo)鈣激活鉀通道Abstract：Objective:The purpose of this study was to investigate the effects of aerobic exercise on the functional coupling of RyR-BKCachannel in cerebral arterial smooth muscle cells from spontaneously hypertensive rats.Methods:12-week-old male SHR and WKY rats were randomly assigned to sedentary groups(SHR-SED,WKY-SED) and exercise training groups(SHR-EX,WKY-EX).Exercise groups were performed an 8-week moderate-intensity treadmill running.After 8 weeks,cerebral arterial smooth muscle cells were enzymatically isolated.Spontaneous transient outward currents(STOC) and BKCasingle channel currents were measured using whole-cell and inside-out patch,respectively.Cytosolic Ca2+response was acquired using Ca2+image;Immunofluorescence was performed to study the expression of BKCachannel α and β1protein.Results:1) After 8 weeks of exercise,SBP in both WKY-EX and SHR-EX were significantly lower than that of their sedentary counterparts.2) The amplitude of STOC in SHR-SED was significantly higher than that in WKY-SED;After exercise,it was significantly lower in the SHR-EX than in SHR-SED;There was no significant difference of the frequency among four groups.3) The Po of BKCachannels from SHR-SED was larger than that of WKY-SED;The Po in SHR-EX became lower than in SHR-SED;in normotensive rats,the Po after exercise training(WKY-EX) was significantly higher than WKY-SED.4) Tamoxifen evoked a 3.4-fold and 8.9-fold increase in the Po of BKCachannels in WKY-SED and SHR-SED patches,respectively;In WKY-EX,tamoxifen-evoked Po was significantly higher than in WKY-SED ones;However,in hypertensive rats,exercise training inhibited tamoxifen-evoked effects.5) The RyR agonist caffeine activated STOC effectively;Caffeine could lead to the release of SR Ca2+store,inducing cytosolic Ca2+transients,rapid application of caffeine evoked similar Ca2+transients in four groups.6) BKCachannel α and β1subunits were plasma membrane-localized in arterial myocytes,besides a large fraction of β1subunits were intracellular;The expression of α subunits was similar in four groups;Compared with WKY-SED,β1expression was significantly increased in WKY-EX and SHR-SED,exercise training markedly inhibited the upregulation of β1subunits in SHR-EX.Conclusions:These data indicate that hypertension leads to enhanced functional coupling of RyR-BKCato buffer pressure-induced constriction of cerebral arteries,which attributes to an upregulation of BKCaβ1subunit function.Regular aerobic exercise efficiently prevents the augmented functional coupling of RyR-BKCain hypertension,so alleviates the pathological compensation and restores cerebral arterial function.

高血壓是中風(fēng)、心肌梗死、血管病變和慢性腎病等疾病的主要危險(xiǎn)因素。長(zhǎng)期規(guī)律有氧運(yùn)動(dòng)，作為一種低成本且副作用相對(duì)較小的非藥物治療方法，在預(yù)防和控制心血管疾病上受到越來(lái)越多的關(guān)注[32]。流行病學(xué)上的很多研究都表明，運(yùn)動(dòng)能夠帶來(lái)系統(tǒng)的影響以及諸多的益處，包括降低慢性疾病危險(xiǎn)因素，如高血壓[14]。但目前，有關(guān)運(yùn)動(dòng)促進(jìn)體質(zhì)健康的潛在機(jī)制尚不清楚，運(yùn)動(dòng)預(yù)防高血壓的作用機(jī)理也尚未完全闡明。

持續(xù)性高血壓時(shí)，小動(dòng)脈和微動(dòng)脈會(huì)發(fā)生結(jié)構(gòu)和功能上的改變，從而適應(yīng)血管腔內(nèi)升高的壓力[18]。諸多研究發(fā)現(xiàn)，血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)膜上的離子通道也會(huì)發(fā)生電學(xué)重塑從而維持較高的血管張力[18]。大電導(dǎo)鈣激活鉀通道(large-conductance Ca2+-activated K+channel，BKCa)廣泛分布于VSMC上，在膜去極化和局部[Ca2+]i升高條件下激活[26,27]。細(xì)胞膜去極化減弱引起血管腔內(nèi)壓升高從而產(chǎn)生肌源性收縮，而B(niǎo)KCa通道能夠抵消這種肌源性收縮，促進(jìn)血管穩(wěn)態(tài)[27]。大多數(shù)研究證明，在高血壓時(shí)，VSMCs上BKCa通道功能表達(dá)增多[12,20,30]。這個(gè)重要的局部保護(hù)性機(jī)制使得在慢性高血壓時(shí)，腦血管血流能夠保持正常或者接近正常水平[8,16]。在腦動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(cerebral artery smooth muscle cell，CASMC)中，肌質(zhì)網(wǎng)(sarcoplasmic reticulum，SR)上一個(gè)或者若干個(gè)雷諾丁受體(rynodine receptor，RyR)隨機(jī)開(kāi)放引起內(nèi)鈣局部升高，即鈣火花(Ca2+spark)產(chǎn)生，由于RyR與BKCa通道非常接近(<20 nm)，從而活化附近的大電導(dǎo)鈣激活鉀通道，同時(shí)產(chǎn)生了瞬時(shí)外向鉀電流(spontaneous transient outward current，STOC)而使膜超極化。因此，本實(shí)驗(yàn)提出假設(shè)，高血壓時(shí)BKCa通道功能的上調(diào)，同時(shí)RyR-BKCa功能耦聯(lián)的增強(qiáng)，也許是腦動(dòng)脈限制血壓過(guò)度升高的代償機(jī)制。

運(yùn)動(dòng)，尤其是長(zhǎng)期規(guī)律的有氧運(yùn)動(dòng)，能夠有效預(yù)防控制高血壓，給腦血管帶來(lái)益處[5]。運(yùn)動(dòng)引起腦血管保護(hù)的可能機(jī)制是通過(guò)改變腦動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的鈣調(diào)控實(shí)現(xiàn)的，鈣調(diào)控在腦動(dòng)脈的收縮-舒張中扮演著重要角色；同時(shí)，長(zhǎng)期耐力運(yùn)動(dòng)能夠影響到鈣離子的動(dòng)態(tài)平衡[9,22,31]。鈣離子、鈣電流以及鉀通道之間的功能聯(lián)系引起鉀通道，如BKCa通道、電壓門(mén)控鉀通道(Kv)活動(dòng)的改變，也可能是運(yùn)動(dòng)引起腦血管保護(hù)的因素。

本研究旨在觀察原發(fā)性高血壓時(shí)，腦動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的BKCa功能，RyR-BKCa耦聯(lián)是否發(fā)生改變，以及有氧運(yùn)動(dòng)能否抑制這些病理性改變，重塑腦血管功能。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及運(yùn)動(dòng)方案

12周齡雄性自發(fā)性高血壓大鼠(Spontaneous hypertension rat，SHR)以及正常血壓對(duì)照組(Wistar-Kyoto，WKY)，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；隨機(jī)分為正常血壓安靜組(WKY-SED)，正常血壓運(yùn)動(dòng)組(WKY-EX)，高血壓安靜組(SHR-SED)和高血壓運(yùn)動(dòng)組(SHR-EX)，各組24只。保持動(dòng)物飼養(yǎng)房?jī)?nèi)室溫22℃～24℃，濕度為40%～60%，自然光照，各組大鼠每天自由進(jìn)食飲水，按國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)固定混合飼料喂養(yǎng)。

每周測(cè)定大鼠體重(BW)、安靜收縮壓(SBP)。SBP采用尾動(dòng)脈無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)試儀監(jiān)測(cè)(BP-2010A，Softron Biotechnology，Beijing)。

1.2 腦動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞急性分離

大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(50 mg/kg)，麻醉后，取腦基底動(dòng)脈及willis環(huán)周?chē)綄俳M織，剝離干凈后置于分離液中；之后將基底動(dòng)脈及willis環(huán)剪成1 mm的小段，室溫平衡5 min后，置于酶消化液中，37℃恒溫水浴箱中消化20～25 min。待消化完全后，置于室溫下分離液漂洗3次終止消化，每次5 min。然后用拋光后的玻璃吸管輕輕吹打，吸取細(xì)胞懸液經(jīng)濾網(wǎng)過(guò)濾至細(xì)胞浴槽內(nèi)，置于4℃貼壁待用。酶消化液組成：2 mg/ml牛血清白蛋白(BSA)、4 mg/ml木瓜蛋白酶(Papain)、1 mg/ml二硫蘇糖醇(DDT)、0.6 mg/ml F型膠原酶溶于分離液中；分離液組成(mmol/L)：137 NaCl，5.6 KCl，1 MgCl2，10 Hepes，10 Glucose，0.42 Na2HPO4，0.44 NaH2PO4，4.2 NaHCO3，NaOH調(diào)pH至7.3。

1.3 穿孔膜片鉗紀(jì)錄

STOC電流采用穿孔膜片鉗記錄模式，浴液成分(mmol/L)：135 NaCl，5 KCl，1 MgCl2，1.8 CaCl2，10 Glucose，10 Hepes，NaOH調(diào)pH至7.4；電極內(nèi)液(mmol/L)：110 K-aspartate，30 KCl，10 NaCl，1 MgCl2，10 Hepes，0.05 EGTA，0.2 兩性霉素B，KOH調(diào)pH至7.4。記錄電極選用玻璃毛細(xì)管(OD 1.5 mm，ID 0.86 mm，Sutter Instrument，USA)于電極拉制儀(PC10，Narishige，Tokyo)上兩步拉制，充灌電極液后電極阻抗為4～5 MΩ。

STOC的幅值與頻率采用Mini-Analysis程序(Synaptosoft Software，Leonia，NJ)分析處理。

1.4 單通道紀(jì)錄

BKCa單通道電流采用膜片鉗內(nèi)面向外記錄模式，細(xì)胞內(nèi)、外液采用對(duì)稱(chēng)性高K+(145 mmol/L)方式，電極電阻10～15 MΩ，電極內(nèi)液成分(mmol/L)：100 KCl，45 K-aspartate，1 EGTA，10 Hepes，5 Glucose，KOH調(diào)pH至7.4。浴液中的游離Ca2+濃度([Ca2+]free)通過(guò)加入適量CaCl2和EGTA控制，所有CaCl2和EGTA的量利用WinMax C軟件(http://maxchelator.stanford.edu/webmaxc/webmaxcS.htm)計(jì)算得到。

1.5 鈣成像

急性分離的腦動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞種于玻底培養(yǎng)皿，室溫貼壁30 min。鈣離子染料Fluo-4 AM按比例溶于無(wú)鈣分離液中，制成Fluo-4 AM工作液(5 μmol/L)。分離液成分(mmol/L)：137 NaCl，5.6 KCl，1 MgCl2，10 Hepes，10 Glucose，0.03 硝普鈉，NaOH調(diào)pH至7.4。細(xì)胞室溫負(fù)載Fluo-4 AM工作液約30 min后，用含1.5 mmol/L CaCl2的分離液清洗3遍，每次10 min。負(fù)載上Fluo-4 AM的平滑肌細(xì)胞將基于Leica熒光顯微鏡系統(tǒng)(DM6000，Leica，Germany)捕捉全細(xì)胞鈣振蕩(Cytosolic Ca2+Oscillation)信號(hào)，采樣參數(shù)為3 s/page，圖片1 024×1 024像素，采集200張圖片，采集時(shí)間約為10 min。

鈣振蕩數(shù)據(jù)采用Image J圖像處理軟件(NIH，USA)和Matlab數(shù)學(xué)軟件(MathWorks，USA)自編程序進(jìn)行分析。采集圖片導(dǎo)入Image J后，沿細(xì)胞邊緣圈出所需ROI(region of interest)，得到ROI的平均灰度值(mean intensity)；之后導(dǎo)入Matlab，經(jīng)自編程序運(yùn)行，得到每個(gè)ROI對(duì)應(yīng)的鈣振蕩曲線。鈣振蕩分析為F/F0=(F-Fbaseline)/(F0-Fbaseline)，其中，F(xiàn)baseline為圖片背景熒光強(qiáng)度，F(xiàn)為每張圖片的ROI的平均熒光強(qiáng)度，F(xiàn)0為開(kāi)始采集信號(hào)但無(wú)鈣響應(yīng)發(fā)生時(shí)ROI的平均熒光強(qiáng)度值。本工作中鈣振蕩的認(rèn)定標(biāo)準(zhǔn)是ROI熒光強(qiáng)度(F)的升高>ROI無(wú)鈣響應(yīng)時(shí)熒光強(qiáng)度(F0)的1.2倍。

1.6 免疫熒光

急性分離的腦動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞4℃貼壁60 min后，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗3遍，加入0.2% Triton X-100膜打孔10 min，10%山羊血清封閉后，分別滴加一抗Rabbit Polyclonal to Anti-KCa1.1(濃度為1∶200，Alomone，Israel)，Rabbit Polyclonal to Anti-sloβ1(濃度為1∶200，Alomone，Israel)，4℃過(guò)夜；次日避光加入熒光二抗Alexa Fluor488 goat anti-rabbit IgG antibody(濃度為1∶1 000)室溫孵育1 h后，用抗淬滅封片劑ProLong Gold Antifade Mountant封片，室溫避光干燥保存，24 h后可用激光共聚焦系統(tǒng)(SP5 TCS，Leica，Germany)采集信號(hào)。

1.7 數(shù)據(jù)分析處理

2 結(jié)果

2.1 體重以及血壓

12周齡SHR與WKY在體重上無(wú)顯著性差異，SHR組的收縮壓為192.6±2.2 mmHg，顯著高于WKY組(134.2±2.5 mmHg，P<0.01)。經(jīng)8周有氧運(yùn)動(dòng)后，運(yùn)動(dòng)組體重(WKY-EX：338.2±2.2 g；SHR-EX：301.7±3.0 g)顯著低于所對(duì)應(yīng)安靜組(WKY-SED：349.1±4.1 g；SHR-SED：318.1±4.7 g；P<0.05)。同時(shí)，運(yùn)動(dòng)組的收縮壓，無(wú)論是WKY-EX(132.9±2.5 mmHg)，還是SHR-EX(181.3±2.2 mmHg)都分別顯著低于WKY-SED(137.5±2.0 mmHg，P<0.05)和SHR-SED(197.8±2.2 mmHg，P<0.05)。

2.2 運(yùn)動(dòng)抑制SHR腦動(dòng)脈平滑肌STOC上調(diào)

采用全細(xì)胞穿孔記錄模式，腦動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞在去極化狀態(tài)下STOC更容易被激活。不同鉗制電壓下記錄到的STOC電流如圖1A所示。隨著去極化電壓增大，各組STOC幅值和頻率都顯著增加。在相同鉗制電位(-40 mV，-20 mV，0 mV)下，SHR-SED組STOC幅值顯著高于WKY-SED組(P<0.05，圖1B)。經(jīng)有氧運(yùn)動(dòng)后，WKY-EX組的幅值在-20 mV和0 mV鉗制電壓下，顯著高于WKY-SED組；但在-40 mV、-20 mV和0 mV鉗制電壓下，SHR-EX組的幅值卻顯著低于SHR-SED組(P<0.05)。提示，高血壓時(shí)，腦動(dòng)脈STOC的幅值較正常血壓對(duì)照組有顯著增加，但有氧運(yùn)動(dòng)能夠緩解高血壓時(shí)STOC的增加。而在-20 mV和0 mV鉗制電壓下，各組STOC頻率無(wú)顯著性差異。在-40 mV鉗制電壓下，SHR-SED組STOC頻率顯著高于WKY-SED組；但經(jīng)有氧運(yùn)動(dòng)，WKY-EX與WKY-SED組，SHR-EX與SHR-SED組之間STOC頻率均未觀察到顯著性差異。

圖 1 各組大鼠腦動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞STOC電壓依賴(lài)性Figure 1. Voltage Dependence of STOC in Cerebral Artery Smooth Muscle Cells from Four Groups

注：A，各組不同鉗制電位下STOC電流代表圖；B，各組不同鉗制電位下STOC幅值和頻率統(tǒng)計(jì)圖(各組n=6)；*P< 0.05，有顯著性差異，下同。

2.3 運(yùn)動(dòng)抑制SHR腦動(dòng)脈平滑肌BKCa通道功能增強(qiáng)

采用單通道內(nèi)面向外記錄模式對(duì)各組大鼠腦動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞BKCa通道的單通道功能及門(mén)控特性進(jìn)行鑒定。

如圖2所示，在[Ca2+]free為0.3 μmol/L，鉗制電壓為+40 mV下，SHR-SED組BKCa通道開(kāi)放概率(Po)顯著大于WKY-SED組(P<0.01)；8周有氧運(yùn)動(dòng)后，SHR-EX組的Po顯著低于SHR-SED組(P<0.01)，然而,運(yùn)動(dòng)卻增強(qiáng)了正常血壓組BKCa通道活動(dòng)，WKY-EX組的Po明顯增加，高于WKY-SED組(P<0.01)。

2.4 運(yùn)動(dòng)對(duì)SHR腦動(dòng)脈平滑肌BKCa通道藥理學(xué)特性的影響

他莫昔芬(tamoxifen)，BKCa通道β1亞基特異性激動(dòng)劑，是一種雌激素受體拮抗劑，可與β1亞基相結(jié)合，通過(guò)非基因組效應(yīng)明顯激活平滑肌BKCa通道[10]，因此，tamoxifen具有檢測(cè)β1亞基對(duì)BKCa通道調(diào)控的作用。

從圖3可知，在[Ca2+]free為100 nmol/L，膜鉗制電位為+40 mV下，1 μmol/L tamoxifen能增加各組大鼠BKCa通道的開(kāi)放概率，使WKY-SED組開(kāi)放概率增加3.4倍，SHR-SED組增加8.9倍；有氧運(yùn)動(dòng)后，tamoxifen增加了WKY-EX組BKCa通道開(kāi)放概率4.3倍，顯著高于WKY-SED組(P<0.01)；然而，在高血壓組，SHR-EX組增加4.6倍，與SHR-SED相比，運(yùn)動(dòng)顯著抑制了tamoxifen引起的BKCa通道開(kāi)放概率的增加(P<0.01)。

圖 2 大鼠腦動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞BKCa單通道電流Figure 2. Recording of Single BKCa Channel Current of Cerebral Arterial Myocytes

注：A，膜鉗制電位(HP)為 +40 mV，浴液游離鈣濃度([Ca2+]free)為300 nmol/L，各組BKCa單通道電流代表圖;B，300 nmol/L [Ca2+]free時(shí)，BKCa通道開(kāi)放概率(Po)統(tǒng)計(jì)圖(各組n=6)。

圖 3 Tamoxifen對(duì)BKCa通道活動(dòng)的影響Figure 3. Effects of Tamoxifen on BKCa Channel Activity

注：A，HP= +40 mV，[Ca2+]free=100 nmol/L，1 μmol/L tamoxifen誘發(fā)BKCa通道開(kāi)放示意圖；B，tamoxifen誘發(fā)BKCa通道開(kāi)放概率(Po)改變統(tǒng)計(jì)圖，各組n=6。

提示，SHR腦動(dòng)脈平滑肌β1亞基的功能上調(diào)，導(dǎo)致了BKCa通道活性增強(qiáng)，而有氧運(yùn)動(dòng)在一定程度上能夠改變BKCa通道β1亞基的功能，來(lái)抑制SHR腦動(dòng)脈平滑肌BKCa通道功能的上調(diào)。

2.5 Caffeine對(duì)RyR功能及STOC的影響

RyR的特異性激動(dòng)劑咖啡因(caffeine)能夠引起全胞鈣瞬變(Ca2+transients)，活細(xì)胞實(shí)時(shí)成像結(jié)果可見(jiàn)圖4A-a。鈣振蕩對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)分為0 s、15 s、21 s、33 s、60 s；細(xì)胞在0 s時(shí)存在一定濃度的靜息水平鈣，加入10 mmol/L caffeine后，15 s時(shí)胞內(nèi)鈣離子濃度開(kāi)始升高，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)；到達(dá)21 s時(shí)熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，胞內(nèi)鈣離子濃度達(dá)到峰值，RyR Ca2+釋放完全，引起全胞鈣濃度迅速上升；33 s胞內(nèi)鈣離子濃度下降，至60 s時(shí)逐漸恢復(fù)至開(kāi)始靜息水平，此時(shí)肌質(zhì)網(wǎng)SR對(duì)胞內(nèi)鈣離子回收，胞內(nèi)鈣離子恢復(fù)靜息水平。但各組之間由caffeine誘發(fā)的鈣振蕩幅值無(wú)顯著性差異(P>0.05，圖4A-b)。提示，各組大鼠平滑肌細(xì)胞肌質(zhì)網(wǎng)雷諾丁受體(RyR)鈣庫(kù)儲(chǔ)量(Ca2+store)未發(fā)生變化。

如圖4B所示，caffeine同時(shí)能夠有效地激活STOC，當(dāng)鉗制電壓在-30 mV時(shí)，浴液中加入1 mmol/L caffeine后，STOC幅值和頻率分別增加了32.9%±2.3%和438.1%±51.8%。

圖 4 Caffeine對(duì)RyR功能及STOC的影響Figure 4. Effects of Caffeine on RyR and STOC

注：A-a，10 mmol/L caffeine誘發(fā)的全胞鈣瞬變代表圖；A-b，各組平滑肌細(xì)胞由caffeine誘發(fā)的鈣瞬變曲線圖，n為各組細(xì)胞個(gè)數(shù)。B，HP=-30 mV時(shí)，1 mmol/L caffeine增強(qiáng)STOC活動(dòng)代表圖。

2.6 運(yùn)動(dòng)對(duì)SHR腦動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞BKCa通道α、β1亞基表達(dá)及分布的影響

免疫熒光技術(shù)及激光共聚焦成像觀察各組大鼠腦動(dòng)脈單個(gè)平滑肌細(xì)胞BKCa通道α、β1亞基表達(dá)及分布。如圖5Aa～d所示，BKCa通道α亞基主要分布于平滑肌細(xì)胞質(zhì)膜表面，而胞內(nèi)無(wú)明顯陽(yáng)性信號(hào)；各組平滑肌細(xì)胞α亞基表達(dá)量無(wú)顯著性差異(P>0.05，圖5B)。如圖5Ae～h，BKCa通道β1亞基除在平滑肌細(xì)胞膜表面有較多表達(dá)外，在細(xì)胞質(zhì)中也有散在分布；SHR-SED組β1亞基表達(dá)較WKY-SED組顯著上調(diào)(P<0.05)；經(jīng)有氧運(yùn)動(dòng)后，WKY-EX組β1亞基表達(dá)發(fā)生上調(diào)(P<0.05)，而SHR-EX組較SHR-SED組β1亞基表達(dá)發(fā)生顯著下調(diào)(P<0.01，圖5B)。

圖 5 腦動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞BKCa通道α、β1亞基表達(dá)及分布Figure 5. Fluorescent Microphotographs of Confocal Microscopy Images and Quantitative Analysis of BKCa α and β1 Subunits on Arterial Myocytes

注：A，a～d：各組熒光標(biāo)記BKCa通道α亞基腦動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞代表圖；e～h：各組熒光標(biāo)記BKCa通道β1亞基腦動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞代表圖；i～j：腦動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞明場(chǎng)圖，以及未加入α、β1亞基抗體陰性對(duì)照代表圖；標(biāo)尺：20 μmol/L；B，各組細(xì)胞相對(duì)熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)圖，n=6。

3 討論

本研究結(jié)果表明，在原發(fā)性高血壓時(shí)，RyR與BKCa通道功能耦聯(lián)的上調(diào)是一種適應(yīng)性機(jī)制，為了對(duì)抗壓力誘發(fā)的收縮，從而預(yù)防腦缺血；BKCa通道β1亞基上調(diào)是RyR-BKCa功能耦聯(lián)增強(qiáng)的重要因素之一。長(zhǎng)期規(guī)律的有氧運(yùn)動(dòng)能有效逆轉(zhuǎn)這種病理性代償，重塑腦血管功能。

瞬時(shí)外向鉀電流(STOC)由鈣火花，即SR上RyR開(kāi)放，從而激活鄰近的BKCa通道產(chǎn)生。STOC不僅反映SR上RyR開(kāi)放情況，也反映了膜上BKCa通道的活動(dòng)[15]。有研究表明，當(dāng)腦動(dòng)脈的鈣火花被阻斷后，BKCa通道在血管張力調(diào)節(jié)中的負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用無(wú)法發(fā)揮[19]。因此，STOC可作為評(píng)價(jià)RyR與BKCa耦聯(lián)的重要指標(biāo)，在血管張力、平滑肌收縮和興奮性調(diào)節(jié)中起到重要作用[23]。

本研究中，穿孔膜片鉗記錄證明，在相同鉗制電位下，SHR腦動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞STOC的幅值顯著增加。提示，在高血壓時(shí)，細(xì)胞膜上的BKCa通道與SR鈣釋放耦聯(lián)顯著增強(qiáng)。這種增強(qiáng)可能的原因：1)SR上RyR鈣釋放增多；2)鈣火花與BKCa通道之間耦聯(lián)效率增強(qiáng)；3)膜上BKCa通道表達(dá)增多。免疫熒光結(jié)果分析BKCa通道α亞基表達(dá)量在4組中無(wú)顯著性差異，但β1亞基在高血壓大鼠中的表達(dá)卻顯著增多。因此，β1亞基表達(dá)上調(diào)，BKCa單通道開(kāi)放時(shí)間和電壓敏感性的改變，或許可以解釋高血壓時(shí)腦動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞STOC活動(dòng)的增強(qiáng)。本研究單通道記錄結(jié)果顯示，高血壓時(shí)BKCa通道的開(kāi)放概率顯著增加，這與高血壓動(dòng)脈BKCa通道β1亞基表達(dá)上調(diào)是一致的。Tamoxifen能夠直接與β1亞基相結(jié)合通過(guò)非基因組效應(yīng)顯著激活平滑肌BKCa通道[10]，因此，tamoxifen具有檢測(cè)β1亞基對(duì)BKCa通道調(diào)控的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與WKY-SED組相比，tamoxifen誘導(dǎo)的BKCa單通道活動(dòng)在SHR-SED組顯著增強(qiáng)，但運(yùn)動(dòng)抑制了高血壓大鼠中的BKCa單通道活動(dòng)的上調(diào)。同時(shí)，高血壓腦動(dòng)脈BKCa通道β1亞基表達(dá)的上調(diào)經(jīng)有氧運(yùn)動(dòng)后也顯著下降。綜上，SHR腦動(dòng)脈平滑肌STOC幅值的增加，首先歸因于BKCa單通道活動(dòng)增強(qiáng)導(dǎo)致，其次，BKCa通道β1亞基表達(dá)上調(diào)也是其重要原因。

除去BKCa通道固有生物物理特性的改變，SHR腦動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞STOC增強(qiáng)也可能與SR上RyR鈣釋放增強(qiáng)有關(guān)。胞內(nèi)Ca2+是無(wú)處不在的信號(hào)分子，往往同一種鈣離子在同一細(xì)胞中介導(dǎo)多種多樣，甚至截然相反的生物學(xué)功能，鈣信號(hào)分子在時(shí)間與空間上多樣的存在形式，賦予了Ca2+獨(dú)特的高效性、特異性以及多功能性[7]。而VSMC中亦存在眾多鈣信號(hào)分子，如鈣瞬變、鈣火花、鈣星(Ca2+sparklet)等，這些鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在決定和調(diào)控VSMC功能上起著重要重用[6]。因此，本研究中，采用活細(xì)胞實(shí)時(shí)鈣離子成像技術(shù)檢測(cè)了肌質(zhì)網(wǎng)上鈣庫(kù)儲(chǔ)量情況。RyR特異性的激動(dòng)劑caffeine能夠引起SR鈣庫(kù)耗竭，導(dǎo)致全胞鈣瞬變。各組之間由caffeine誘發(fā)的鈣振蕩幅值無(wú)顯著性差異，提示，各組大鼠平滑肌細(xì)胞肌質(zhì)網(wǎng)RyR鈣庫(kù)儲(chǔ)量未發(fā)生變化。鈣火花是肌質(zhì)網(wǎng)上成簇分布的RyR自發(fā)或者協(xié)同開(kāi)放所產(chǎn)生的鈣釋放事件[17,29]。在一些血管病變中，鈣火花與BKCa通道耦聯(lián)發(fā)生了改變，因此，鈣火花是重要的治療靶點(diǎn)。但本研究中未檢測(cè)腦動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞自發(fā)性鈣火花情況，只通過(guò)穿孔膜片鉗得到SHR腦動(dòng)脈平滑肌STOC的幅值顯著增加，在一定程度上說(shuō)明細(xì)胞膜上的BKCa通道與SR上鈣釋放耦聯(lián)增強(qiáng)，但高血壓時(shí)鈣火花幅值與頻率的具體變化情況還需在今后的實(shí)驗(yàn)中通過(guò)激光共聚焦系統(tǒng)加以檢測(cè)。

綜上，在正常血壓組，有氧運(yùn)動(dòng)能夠引起B(yǎng)KCa通道β1亞基的上調(diào)，從而增強(qiáng)BKCa通道的活動(dòng)，調(diào)節(jié)血管張力。然而，在高血壓時(shí)，為代償腦動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)升高的Ca2+濃度，RyR-BKCa通道耦聯(lián)增強(qiáng)，BKCa通道β1亞基的上調(diào)是這種耦聯(lián)增強(qiáng)的重要因素之一，有氧運(yùn)動(dòng)抑制了高血壓時(shí)β1亞基的上調(diào)，改善了高血壓引起的血管病理性重構(gòu)。其潛在機(jī)制之一可能是運(yùn)動(dòng)直接重塑高血壓引起的BKCa通道病理變化，β1亞基的上調(diào)抑制；其次，也可能與運(yùn)動(dòng)有效降低了血壓有關(guān)，血壓與膜上Cav1.2通道活動(dòng)有著密切關(guān)系，運(yùn)動(dòng)有效降低血壓，隨后Cav1.2通道活動(dòng)下調(diào)，鈣內(nèi)流減少[1]，RyR鈣火花活動(dòng)減弱，BKCa通道β1亞基呈現(xiàn)下調(diào)，BKCa通道活動(dòng)在血管張力調(diào)節(jié)中的負(fù)反饋?zhàn)饔脺p弱，具體機(jī)制還需后續(xù)進(jìn)一步研究。Mokelke等[25]發(fā)現(xiàn)，糖尿病血脂異常時(shí)，冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞鈣激活鉀通道(KCa)與鈣釋放功能耦聯(lián)增強(qiáng)，而耐力運(yùn)動(dòng)抑制了鈣釋放與KCa耦聯(lián)的上調(diào)；但是在另一個(gè)研究中，他們同時(shí)又發(fā)現(xiàn)，在冠狀動(dòng)脈的微血管中，鈣火花與STOC貢獻(xiàn)發(fā)生了下調(diào)，運(yùn)動(dòng)同樣抑制了這種下調(diào)[24]。提示，STOC與鈣火花在血管調(diào)節(jié)中的機(jī)制是非常復(fù)雜的，但運(yùn)動(dòng)似乎都能夠抑制這些病理性的改變。

國(guó)內(nèi)、外大量研究證明，BKCa在血管調(diào)節(jié)方面的重要作用，但對(duì)其在高血壓的發(fā)病機(jī)制中所起的作用仍有較大爭(zhēng)論。目前，多數(shù)研究證實(shí)，BKCa通道的功能和表達(dá)在高血壓時(shí)是上調(diào)的，但也有相反的報(bào)道[3,4,18,28]。Amberg等[3,4]報(bào)道，無(wú)論是在血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的高血壓還是遺傳性高血壓中，BKCa通道β1亞基呈現(xiàn)下調(diào)，此變化減弱了BKCa通道對(duì)鈣火花的敏感性，即在高血壓時(shí)RyR與BKCa耦聯(lián)減弱。但本研究的結(jié)果與Amberg的報(bào)道并不一致，具體原因仍需更多的研究加以闡明。Liu等[20,21]研究證明，SHR和WKY大鼠靜息時(shí)腦動(dòng)脈直徑未有顯著差異，說(shuō)明高血壓時(shí)BKCa通道上調(diào)并非產(chǎn)生主動(dòng)擴(kuò)張，而是緩沖腦部阻力血管收縮時(shí)所增加的張力，即高血壓時(shí)，BKCa上調(diào)可能作為一種代償性機(jī)制緩沖血管興奮性，以便調(diào)節(jié)慢性高血壓腦動(dòng)脈的靜息張力，這與本研究結(jié)果是一致的。

越來(lái)越多的研究表明，長(zhǎng)期規(guī)律的有氧運(yùn)動(dòng)能夠降低血壓，改善血管功能[13]。運(yùn)動(dòng)能夠引起血管平滑肌離子通道發(fā)生良性重構(gòu)。以往研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)能夠增加平滑肌細(xì)胞BKCa通道電流和蛋白表達(dá)[2,11,33]，中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)能夠抑制高血壓引起的腸系膜動(dòng)脈Cav1.2通道功能和蛋白表達(dá)的上調(diào)，有效逆轉(zhuǎn)高血壓Cav1.2通道重構(gòu)，改善血管功能[1]。本研究通過(guò)膜片鉗技術(shù)、鈣離子成像、免疫熒光技術(shù)，分別從BKCa通道宏觀活動(dòng)STOC，單通道電流，RyR鈣庫(kù)儲(chǔ)量，BKCa通道亞基表達(dá)，證明了有氧運(yùn)動(dòng)可以有效抑制高血壓導(dǎo)致的腦動(dòng)脈平滑肌RyR-BKCa通道耦聯(lián)上調(diào)，為運(yùn)動(dòng)維持高血壓腦血管穩(wěn)態(tài)和重塑研究提供了相關(guān)證據(jù)。

4 結(jié)論

高血壓引起RyR-BKCa功能耦聯(lián)的增強(qiáng)是為了緩沖血管壓力增高誘發(fā)的腦動(dòng)脈收縮，而B(niǎo)KCa通道β1亞基功能上調(diào)是其重要因素之一，長(zhǎng)期規(guī)律有氧運(yùn)動(dòng)能有效地抑制這種病理性代償，恢復(fù)腦血管功能。

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Inhibition of Aerobic Exercise on Enhanced Functional Coupling of RyR-BKCaChannel in Hypertension Cerebral Arterial Smooth Muscle Cells

ZHANG Yan-yan1，2,LIU Yu-jia1，2,BAI Ping1，2,WU ying2,SHI Li-jun1，2

hypertension;exercise;ryanodinereceptor;BKCachannel

1000-677X(2017)01-0055-07

10.16469/j.css.201701005

體育科學(xué)

2016-10-19；

2017-01-03

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31371201)；國(guó)家體育總局全民健身領(lǐng)域課題(2015B035)。

張嚴(yán)焱，女，在讀博士研究生，主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)和心血管生理學(xué)，E-mail：15210574247@163.com；石麗君，女，教授，博士，博士研究生導(dǎo)師，主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)和心血管生理學(xué)，E-mail：l_j_shi72@163.com。

1.北京體育大學(xué) 運(yùn)動(dòng)與體質(zhì)健康教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100084；2.北京體育大學(xué) 運(yùn)動(dòng)生理教研室，北京 100084 1.Key Laboratory of Physical Fitness and Exercise,Ministry of Education,Beijing Sport University,Beijing 100084，China；2.Beijing Sport University,Beijing 100084,China.

G804.2

A