香煙煙霧提取物誘導(dǎo)呼吸道上皮細(xì)胞間質(zhì)性轉(zhuǎn)化的實驗研究*

劉振峰，劉建英△，劉代順，周國旗，陳 乾，王海霞

(1.貴州省遵義市第一人民醫(yī)院呼吸科 563003；2.貴州省遵義市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 563003；3.江蘇省蘇州市科技城醫(yī)院呼吸科 215000)

論著·基礎(chǔ)研究

香煙煙霧提取物誘導(dǎo)呼吸道上皮細(xì)胞間質(zhì)性轉(zhuǎn)化的實驗研究*

劉振峰1，劉建英1△，劉代順1，周國旗1，陳 乾2，王海霞3

(1.貴州省遵義市第一人民醫(yī)院呼吸科 563003；2.貴州省遵義市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 563003；3.江蘇省蘇州市科技城醫(yī)院呼吸科 215000)

目的 探討香煙煙霧提取物(CSE)在呼吸道上皮細(xì)胞間質(zhì)性轉(zhuǎn)化(EMT)中的作用，為進(jìn)一步研究香煙煙霧提取物在慢性阻塞性肺疾病(COPD)氣道重構(gòu)發(fā)生機(jī)制提供新的線索。方法 用不同濃度(0%、0.5%、1.0%、2.5%、5.0%,其中濃度0作為對照組)的CSE刺激呼吸道上皮細(xì)胞BEAS-2B 72 h，逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測E鈣粘蛋白(E-cad)、N鈣粘蛋白(N-cad)mRNA表達(dá)情況，酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TGF-β1濃度；用2.5%CSE刺激BEAS-2B細(xì)胞不同時長(0、12、24、48 h，其中時間0 h作為對照)，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測E-cad、N-cad、補(bǔ)體C3 mRNA表達(dá)情況，ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TGF-β1、過敏毒素C3a濃度。結(jié)果 在不同濃度的CSE刺激BEAS-2B細(xì)胞72 h后，CSE各濃度刺激組較對照組E-cad mRNA表達(dá)下調(diào)，N-cad mRNA表達(dá)增加，且呈濃度依賴性(P<0.05)；ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TGF-β1水平，CSE各濃度刺激組較對照組增加(P<0.05)；2.5%CSE在不同時間點作用BEAS-2B細(xì)胞，刺激組細(xì)胞呈梭形改變，CSE各時間段刺激組較對照組 E-cad mRNA表達(dá)減少，補(bǔ)體C3、N-cad mRNA表達(dá)增加，且呈時間依賴性(P<0.05)，CSE各時間段刺激組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TGF-β1、C3a水平較對照組增加(P<0.05)。結(jié)論 CSE可誘導(dǎo)正常的呼吸道上皮細(xì)胞BEAS-2B發(fā)生EMT，補(bǔ)體C3激活可能參與此過程。

肺疾病,慢性阻塞性；香煙煙霧提取物；呼吸道上皮細(xì)胞；上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化；過敏毒素C3a

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一種常見的氣道慢性炎癥性疾病，其特征是持續(xù)的氣流受限，這種氣流受限通常進(jìn)行性加重。COPD病理學(xué)改變主要表現(xiàn)為氣道上皮細(xì)胞變性、壞死，上皮纖維化，基底膜增厚，黏液分泌腺肥大和杯狀細(xì)胞增多，黏液分泌增加。目前，COPD的病因和發(fā)病機(jī)制不清楚，普遍認(rèn)為與氣道和肺組織對香煙煙霧等有害氣體或有毒顆粒的異常反應(yīng)有關(guān)。

氣道重塑是COPD患者氣流受限的病理生理學(xué)改變的基礎(chǔ)。氣道重塑可發(fā)生于多種氣道疾病，是氣道慢性炎癥所致氣道上皮下纖維化的結(jié)果。肌成纖維細(xì)胞在纖維化發(fā)生過程中起著重要作用，目前推測其主要來源有：循環(huán)中來源于骨髓的成纖維細(xì)胞的遷入、上皮細(xì)胞間質(zhì)性轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)、病灶局部成纖維細(xì)胞的活化，30%～40%的肌成纖維細(xì)胞來源于EMT[1]。EMT與損傷修復(fù)、組織再生和器官纖維化密切相關(guān)。普遍認(rèn)為香煙煙霧主要引起組織細(xì)胞產(chǎn)生過多的活性氧造成組織損傷，但是香煙煙霧在COPD患者氣道重塑過程中的作用并不清楚。香煙煙霧作為一種損傷性刺激，可以造成細(xì)胞功能和結(jié)構(gòu)損傷。最近研究顯示，免疫機(jī)制可能參與組織損傷修復(fù)過程。氣道上皮細(xì)胞修復(fù)與再生是一個動態(tài)過程，反復(fù)損傷導(dǎo)致上皮細(xì)胞修復(fù)信號通路持續(xù)激活，這種上皮細(xì)胞的修復(fù)過程與細(xì)胞或體液中產(chǎn)生的炎性介質(zhì)密切相關(guān)。過敏毒素C3a是其中的一種炎性介質(zhì)，它是補(bǔ)體系統(tǒng)活化過程中產(chǎn)生的具有炎性介質(zhì)作用的活性片段。研究發(fā)現(xiàn)，除了它的促炎作用外，過敏毒素C3a可能參與了組織損傷后的修復(fù)過程[2-4]。

本實驗旨在通過體外利用香煙煙霧提取物(cigarette smore extrac,CSE)刺激呼吸道上皮細(xì)胞，分別檢測上皮性細(xì)胞分子標(biāo)記和間葉性細(xì)胞分子標(biāo)記表達(dá)變化，驗證香煙煙霧是否在氣道EMT過程中起促進(jìn)作用及是否伴有補(bǔ)體C3的激活。

1 材料與方法

1.1 材料 BEAS-2B細(xì)胞購買于上海拜力生物科技有限公司，是SV40病毒轉(zhuǎn)染的人支氣管上皮細(xì)胞，核型接近于二倍體，在體外易于人工培養(yǎng)和傳代，能夠無限生長，無自發(fā)轉(zhuǎn)化能力，尚未獲得惡性轉(zhuǎn)化特性，符合研究細(xì)胞轉(zhuǎn)化實驗的細(xì)胞選用原則。

1.2 方法

1.2.1 100%CSE制備[5]使紅金龍牌香煙燃燒的煙霧通過液體后溶入PBS中，即為原液，含香煙煙霧的PBS在超凈工作臺內(nèi)經(jīng)0.22 μm針式過濾器過濾，然后調(diào)節(jié)吸光值A(chǔ)320=3.0±0.1，此時的溶液即為100%CSE，30 min內(nèi)用于實驗。用不同濃度(0%、0.5%、1.0%、2.5%、5.0%，其中濃度0作為對照組)的CSE刺激呼吸道上皮細(xì)胞BEAS-2B 72 h，用逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測E鈣黏蛋白(E-cadherin,E-cad)、N鈣黏蛋白(N-cadherin,N-cad)mRNA表達(dá)情況，酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TGF-β1濃度；用2.5% CSE在不同時間(0、12、24、48 h,其中0 h為對照組)刺激BEAS-2B細(xì)胞，0 h為對照組，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測E-cad、N-cad、C3 mRNA表達(dá)情況，ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TGF-β1、C3a濃度。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) BEAS-2B細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿，用RPMI-1640 (含25 ng/mL rhEGF、10 μg/mL INS、0.4 μg/mL HC、5%FBS、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素)培養(yǎng)基，置于5%CO2、飽和濕度、37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每2～3天傳代1次，實驗時取對數(shù)生長期細(xì)胞。參照文獻(xiàn)CSE細(xì)胞毒性實驗結(jié)果[5]，CSE刺激濃度分別為0%、0.5%、1.0%、2.5%、5.0%。

1.2.3 總RNA提取及PCR 用Trizol試劑參照說明書提取總RNA，測定A260/A280吸光度判斷純度和濃度后取2 μL總RNA使用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄DNA。實驗中所用引物由上海生工生物工程有限公司設(shè)計并合成，引物信息見表1。PCR反應(yīng)過程：反應(yīng)體系25 μL，94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個PCR循環(huán)；最后72 ℃總延伸10 min。

1.2.4 瓊脂糖凝膠電泳及灰度定量 洗凈制膠板，并安插好梳子，晾干備用；稱取0.4 g瓊脂粉，放入燒杯中，取20 mL 0.5×TBE加入燒杯中；將燒杯放入微波爐中，中低火2 min，取出；冷卻至大約60 ℃后，加入3 μL Ⅰ型Glod view，充分混勻；將膠快速倒入制膠板中，避免氣泡形成，冷卻30 min；用6×Loading buffer與PCR產(chǎn)物按1∶5比例于一次性薄膜手套上混勻后加入上樣孔中；110 V，2 min出孔，80 V，45 min電泳，待溴酚藍(lán)距離邊沿還有1 cm時即可停止電泳；通過凝膠成像儀拍照，利用Quantity-One Ver 4.52凝膠定量分析軟件對所形成的電流條帶圖進(jìn)行定量分析。

表1 PCR基因引物序列信息

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度的CSE作用呼吸道上皮細(xì)胞,對E-cad、N-cad mRNA表達(dá)的影響 不同濃度(0.5%、1.0%、2.5%、5.0%)的CSE作用于呼吸道上皮細(xì)胞BEAS-2B 72 h后，與對照組比較，隨著CSE濃度的增加，上皮性細(xì)胞的分子標(biāo)記E-cad mRNA的表達(dá)逐漸減少，間質(zhì)性細(xì)胞分子標(biāo)記N-cad mRNA的表達(dá)逐漸增加，并且成濃度依賴性變化。本實驗對3次獨立實驗PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶進(jìn)行灰度變化的定量分析，得到同樣的結(jié)果(P<0.05)，見圖1；當(dāng)CSE的濃度為2.5%時，E-cad、N-cad mRNA的表達(dá)出現(xiàn)明顯變化，因此采用2.5%CSE進(jìn)行后續(xù)實驗。

*：P<0.05，與對照組比較。M:DNA分子標(biāo)記物；1:對照組；2:0.5%CSE組；3:1.0%CSE組；4:2.5%CSE組；5:5.0%CSE組。

圖1 CSE對E-cad、N-cad mRNA表達(dá)的影響

2.2 2.5%CSE作用不用時間后細(xì)胞形態(tài)變化 本實驗分別觀察了不同時間點(0 h、12 h、24 h、48 h)，正常呼吸道上皮細(xì)胞均成橢圓形生長，當(dāng)受到CSE刺激后，細(xì)胞形態(tài)呈梭形改變，同時實驗中觀察到，CSE刺激組細(xì)胞的生長較對照組增殖緩慢，見圖2。

圖2 觀察呼吸道上皮細(xì)胞BEAS-2B 形態(tài)改變(×100)

2.3 2.5%CSE不同時間對E-cad,N-cad mRNA表達(dá)的影響 用2.5%CSE刺激呼吸道上皮細(xì)胞BEAS-2B，在不同的時間點(0、12、24、48 h)，RT-PCR法檢測2.5%CSE對E-cad、N-cad mRNA表達(dá)的影響，與對照組比較，E-cad mRNA表達(dá)減少，N-cad mRNA表達(dá)增加，呈時間依賴性。本實驗對3次獨立實驗PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶進(jìn)行灰度變化的定量分析，得到同樣的結(jié)果(P<0.05)，見圖3。進(jìn)一步確定了CSE可誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞發(fā)生EMT過程。

*:P<0.05，與對照組比較。

圖3 2.5%CSE對E-cad、N-cad mRNA表達(dá)的影響

2.4 CSE誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β1表達(dá)增加 不同濃度的CSE(0%、0.5%、1.0%、2.5%、5.0%)刺激BEAS-2B細(xì)胞72 h后，與對照組比較，隨著CSE濃度增加，TGF-β1表達(dá)增加，呈濃度依賴性變化(P<0.05)；2.5%的CSE刺激BEAS-2B細(xì)胞，在不同的時間點(0、12、24、48 h)，與對照組比較，TGF-β1表達(dá)呈時間依賴性增加(P<0.05)，見圖4。

*:P<0.05，與對照組比較。

圖4 CSE對TGF-β1表達(dá)的影響

2.5 2.5%CSE激活補(bǔ)體C3系統(tǒng) 2.5%CSE刺激呼吸道上皮細(xì)胞BEAS-2B，在不同的時間點檢測補(bǔ)體C3 mRNA表達(dá)，與對照組比較，CSE各濃度刺激組C3 mRNA的表達(dá)逐步增加，呈時間依賴性變化(P<0.05)。2.5%CSE刺激呼吸道上皮細(xì)胞BEAS-2B，在不同的時間點檢測上清液中過敏毒素C3a水平，與對照組比較，CSE各濃度刺激組上清液中過敏毒素C3a的濃度逐步表達(dá)增加(P<0.05)，見圖5。

*:P<0.05，與對照組比較。

圖5 C3a mRNA在不同時間點的表達(dá)水平

3 討 論

吸煙是COPD發(fā)病的主要危險因素，本實驗通過體外CSE刺激呼吸道上皮細(xì)胞模擬COPD患者香煙煙霧暴露，尋求吸煙與COPD發(fā)病(或氣道重構(gòu))的相關(guān)性。目前已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)，COPD患者的支氣管上皮細(xì)胞波形蛋白的表達(dá)增加，E-cad的表達(dá)減少[6]，表明EMT過程確實存在于COPD患者肺組織，這與體外細(xì)胞實驗結(jié)果相符。CSE可誘導(dǎo)正常的呼吸道上皮細(xì)胞發(fā)生EMT，這一過程可能參與了氣道損傷的組織修復(fù)，但是反復(fù)損傷所致的EMT表現(xiàn)為氣道上皮纖維化發(fā)生。各濃度CSE僅僅是作為其中的一種危險因子，香煙煙霧可能只是一種損傷性的刺激，可以引起呼吸道上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的損傷，EMT參與的修復(fù)過程可能是普遍存在的。

實驗過程中觀察到CSE刺激組的呼吸道上皮細(xì)胞較對照組細(xì)胞增殖緩慢，推測其原因可能是受刺激的細(xì)胞存在損傷，氧化應(yīng)激可能是在細(xì)胞損傷過程中起作用。另外，細(xì)胞衰老表現(xiàn)為細(xì)胞的增殖能力衰退，新陳代謝過程中產(chǎn)生的氧自由基對細(xì)胞的損傷是其發(fā)生的一個主要機(jī)制。最近研究表明COPD的發(fā)病與肺泡上皮細(xì)胞和氣道上皮細(xì)胞衰老增加相關(guān)，這些細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞增殖能力下降和衰老相關(guān)的細(xì)胞因子的異常分泌[7-9]。香煙煙霧可引起細(xì)胞氧自由基產(chǎn)生增加，本實驗過程中，觀察到CSE刺激組，BEAS-2B細(xì)胞較對照的增殖緩慢，可能這些受刺激的細(xì)胞就存在衰老。

COPD是一種多因素相關(guān)的呼吸道疾病，目前，針對COPD氣道炎癥和氣道重塑的治療仍然是世界性的難題。香煙煙霧可刺激呼吸道上皮細(xì)胞，誘導(dǎo)其向間質(zhì)性細(xì)胞轉(zhuǎn)化，如肌成纖維細(xì)胞，有助于氣道纖維或氣道重塑發(fā)生，因此戒煙仍不失為一種有效的預(yù)防措施。激素和抗炎劑的應(yīng)用，雖可以減輕呼吸系統(tǒng)癥狀和延緩疾病的進(jìn)展，但是COPD患者肺部已經(jīng)形成的結(jié)構(gòu)改變，目前治療水平尚且無法逆轉(zhuǎn)。干細(xì)胞在COPD發(fā)病及損傷修復(fù)過程中的作用也成了當(dāng)今世界研究的熱點。研究發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞MSCs可以減輕香煙煙霧誘發(fā)的小鼠肺部炎性反應(yīng)和肺氣腫，這可能是通過抑制肺巨噬細(xì)胞環(huán)氧化酶COX-2和COX-2介導(dǎo)的PGE2產(chǎn)生起作用的[10]。因此，在今后筆者對干細(xì)胞的研究，包括基底細(xì)胞，有望在COPD治療中會有重大突破。

[1]Nho RS.Current concept for the pathogenesis of idiopathic pulmonary fibrosis[J].Clin Res Pulmonol,2013,1(1):1008.

[2]Markiewski MM,Mastellos D,Tudoran R,et al.C3a And C3b activation products of the third component of complement (C3) are critical for normal liver recovery after toxic injury[J].J Immunol,2004,173(2):747-754.

[3]Markiewski MM,Deangelis RA,Strey CW,et al.The regulation of liver cell survival by complement[J].J Immunol,2009,182(9):5412-5418.

[4]Lara-Astiaso D,Izarra A,Estrada JC,et al.Complement anaphylatoxins C3a and C5a induce a failing regenerative program in cardiac resident cells.Evidence of a role for cardiac resident stem cells other than cardiomyocyte renewal[J].Springerplus,2012(1):63.

[5]Cortijo J,Mata M,Milara J,et al.Aclidinium inhibits cholinergic and tobacco smoke-induced MUC5AC in human airways[J].Eur Respir J,2015,17(4):385-395.

[6]Gohy ST,Hupin C,Fregimilicka C,et al.Imprinting of the COPD airway epithelium for dedifferentiation and mesenchymal transition[J].Eur Respir,2015,17(4):385-395.

[7]Chilosi M,Carloni A,Rossi A,et al.Premature lung aging and cellular senescence in the pathogenesis of idiopathic pulmonary fibrosis and COPD/emphysema[J].Transl Res,2013,162(3):156-173.

[8]Campisi J.Cellular senescence:putting the paradoxes in perspective[J].Curr Opin Genet Dev,2011,21(1):107-112.

[9]Aoshiba K,Nagai A.Senescence hypothesis for the pathogenetic mechanism of chronic obstructive pulmonary disease[J].Proc Am Thorac Soc,2009,6(7):596-601.

[10]Gu W,Song L,Li XM,et al.Mesenchymal stem cells alleviate airway inflammation and emphysema in COPD through down-regulation of cyclooxygenase-2 via p38 and ERK MAPK pathways[J].Sci Rep,2015(5):8733.

Cigarette smoke extrac induced epithelial-mesenchymal transition in respiratory epithelial cells*

LiuZhengfeng1,LiuJiangying1△,LiuDaishun1,ZhouGuoqi1,ChenQian2，WangHaixia3

(1.DepartmentofRespiration,theFirstHospitalofZunyiCity,Zunyi,Guizhou563003,China;2.DepartmentofNeurology,theFirstHospitalofZunyiCity,Zunyi,Guizhou563003,China；3.DepartmentofRespiration,ScienceandTechnologyCityHospitalofSuzhouCity,Suzhou,Jiangsu215000,China)

Objective To investigate the epithelial-mesenchymal transition in respiratory epithelial cells stimulated by cigarette smoke extract in vitro for the new clue of the airway remodeling of COPD due to cigarette smoke.Methods The messenger ribonucleic acid levels of E-cadherin,N-cadherin were measured by RT-PCR combined with agarose gel electrophoresis after the treatment of different concentrations cigarette smoking extract (0%,0.5%,1.0%,2.5%,5.0%) for 72 hours in respiratory epithelial cells.The concentration of TGF-β1 was quantified by enzyme linked immunosorbent assay in the supermatant.After the treatment of 2.5% cigarette smoking extract in respiratory epithelial cells,the morphological changes measured by inversion microscope,the messenger ribonucleic acid levels of E-cadherin,N-cadherin and complement component C3 by RT-PCR combined with agarose gel electrophoresis and the protein concentration of TGF-β1 and complement component C3a in the supermatant by enzyme linked immunosorbent assay were conducted at different times(0,12,24,48 h).Results The stimulation of different concentrations CSE for 72 hours in BEAS-2B cells decreased the level of E-cadherin mRNA expression accompanied by rising expression of the messenger ribonucleic acid level of N-cadherin compared with the control group in a concentration dependent manner,Simultaneously,after different stimulations there was a significant increase in TGF-β1 protein level in the supermatant (P<0.05).After the treatment of 2.5% cigarette smoking extract in respiratory epithelial cells at different times,BEAS-2B cells acquired an elongated,shuttle-like shape in morphology,besides which there was an inverse change that the mRNA expression of E-cadherin was reduced compared with the control group as a significant increase in a time dependent manner in the mRNA expression of N-cadherin and complement component C3 (P<0.05),as well as the protein level of TGF-β1 and complement component C3a in the supermatant were elevated after BEAS-2B cells treated with 2.5% CSE exposure at different times (P<0.05).Conclusion Cigarette smoke extract may be induced epithelial to mesenchymal transition,in which the activation of complement C3 may play a role.

pulmonary disease,chronic obstructive；cigarette smoke extract;respiratory epithelial cells;epithelial mesenchymal transition;anaphylatoxin C3a

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.03.010

貴州省科學(xué)技術(shù)基金項目(黔科合J字[2013]2301)。 作者簡介：(1978-)，副主任醫(yī)師，博士，主要從事慢性阻塞性肺疾病方面研究?！?/p>

R714.253

A

1671-8348(2017)03-0318-04

2016-07-18

2016-10-15)