細(xì)胞穿透肽VP22對抑癌蛋白PTEN體外抗腫瘤作用影響的研究*

李婷婷，楊 勤，余 嫻，何冠軍，雷 軍△

(1.川北醫(yī)學(xué)院麻醉學(xué)系，四川南充 637000；2.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院感染科，四川南充 637000；3.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院藥學(xué)部，重慶 400010；4.川北醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，四川南充 637000)

論著·基礎(chǔ)研究

細(xì)胞穿透肽VP22對抑癌蛋白PTEN體外抗腫瘤作用影響的研究*

李婷婷1，楊 勤2，余 嫻3，何冠軍4，雷 軍4△

(1.川北醫(yī)學(xué)院麻醉學(xué)系，四川南充 637000；2.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院感染科，四川南充 637000；3.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院藥學(xué)部，重慶 400010；4.川北醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，四川南充 637000)

目的 構(gòu)建表達(dá)細(xì)胞穿透肽融合蛋白第10號染色體同源缺失性磷酸酶-張力蛋白基因(PTEN)-VP22的真核表達(dá)質(zhì)粒，在食管癌細(xì)胞Eca109細(xì)胞中驗(yàn)證細(xì)胞穿透肽VP22能否增強(qiáng)抑癌蛋白PTEN體外抗腫瘤作用。方法 通過本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建成功的重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-PTEN、pcDNA3-PTEN-VP22和pcDNA3-VP22，轉(zhuǎn)染至Eca109細(xì)胞，以pcDNA3空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染作為陰性對照，細(xì)胞免疫熒光法檢測各組PTEN蛋白表達(dá)情況，Western blot法檢測各組PTEN蛋白和免抗磷酸化-Akt(p-Akt)蛋白的表達(dá)水平，CCK-8法檢測細(xì)胞增殖活性,流式細(xì)胞術(shù)測細(xì)胞凋亡率。結(jié)果 與pcDNA3相比，pcDNA3-PTEN、pcDNA3-PTEN-VP22都能抑制Eca109細(xì)胞增殖(P<0.05)，促進(jìn)Eca109細(xì)胞凋亡(P<0.05)；pcDNA3-PTEN-VP22抗腫瘤活性顯著高于pcDNA3-PTEN(P<0.05)，pcDNA3-PTEN-VP22的p-Akt表達(dá)顯著低于pcDNA3-PTEN(P<0.05)。結(jié)論 細(xì)胞穿透肽VP22能增強(qiáng)抑癌蛋白PTEN對Eca109細(xì)胞體外抗腫瘤活性，其機(jī)制可能與其下調(diào)p-Akt表達(dá)水平有關(guān)。

食管腫瘤；腫瘤蛋白質(zhì)類；重組融合蛋白質(zhì)類；轉(zhuǎn)染；肽類；PTEN；VP22；基因治療

食管癌是全球常見的十大惡性腫瘤之一，我國食管癌發(fā)病率、病死率高居榜首[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)第10號染色體同源缺失性磷酸酶-張力蛋白基因(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10,PTEN)表達(dá)下調(diào)與食管癌細(xì)胞分化程度、浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[3-5]，但基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率低阻礙了腫瘤基因治療的應(yīng)用。1型單純皰疹病毒(herpes simplex virus type 1,HSV-1)間層蛋白VP22是一種高效的細(xì)胞穿透肽，研究已經(jīng)報(bào)道了VP22能介導(dǎo)抑癌蛋白P27、P53在細(xì)胞間轉(zhuǎn)運(yùn)，并顯示出對多種腫瘤細(xì)胞顯著的抗腫瘤活性[6-7]。本研究通過構(gòu)建PTEN/VP22融合蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒，驗(yàn)證VP22能否增強(qiáng)PTEN的轉(zhuǎn)運(yùn)和表達(dá)，為研究體內(nèi)治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3由本實(shí)驗(yàn)室保存，購自美國Invitrogen公司；pcDNA3-PTEN、pcDNA3-PTEN-VP22、pcDNA3-VP22由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存[8]；人食管癌細(xì)胞Eca109由川北醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)研究所惠贈(zèng)；Lipofectamine 2000脂質(zhì)體購自美國invitrogen公司；兔抗PTEN單克隆抗體購自美國abcam公司；兔抗磷酸化-Akt((p-Akt)單克隆抗體購自美國Cell Signaling公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗兔IgG、HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG、鼠抗β-actin購自Beyotime公司；異硫氰酸熒光素(FITC)-羊抗兔IgG購自武漢博士德公司；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)辣根過氧化物酶顯示試劑盒、CCK-8試劑盒、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)凝膠配置試劑盒購自Beyotime公司；細(xì)胞凋亡Annexin V/碘化丙啶(PI)試劑盒購自聯(lián)科生物。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將Eca109細(xì)胞培養(yǎng)在含10%熱滅活的胎牛血清，100 U/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在37 ℃、含5%CO2的孵箱中孵育。

1.2.2 試驗(yàn)分組和細(xì)胞轉(zhuǎn)染 (1)試驗(yàn)分為4組，PTEN組、PTEN-VP22組、試驗(yàn)組(VP22組)，對照組(pcDNA3組)。(2)細(xì)胞轉(zhuǎn)染：取對數(shù)生長期的Eca109細(xì)胞接種于相應(yīng)的培養(yǎng)板中，待細(xì)胞長至50%～70%融合時(shí)更換無血清培養(yǎng)基，按lipofectamine2000說明書步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染，同時(shí)用熒光標(biāo)記的質(zhì)粒pEGFP-N1轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞，在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。

1.2.3 細(xì)胞免疫熒光檢測PTEN蛋白的表達(dá) 待24孔板中細(xì)胞長至50%～70%融合時(shí)按每孔轉(zhuǎn)染0.5 μg DNA，48 h后用含多聚甲醛免疫染色固定液固定10 min，含Triton X-100免疫染色洗滌液透化5 min，共兩次，rabbit anti-PTEN(1∶100) 一抗4 ℃過夜封閉，次日加入FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶50稀釋)，37 ℃孵育1 h，熒光顯微鏡下觀察PTEN蛋白的表達(dá)，并用熒光酶標(biāo)儀檢查熒光光密度(OD)值。

1.2.4 Western blot檢測PTEN蛋白和p-Akt蛋白的表達(dá) 待25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中細(xì)胞生長至50%～70%融合時(shí)按上述方法每瓶轉(zhuǎn)染10 μg DNA，48 h后用預(yù)冷刮刀刮取細(xì)胞至EP管中離心，加入50 μL裂解液(1 mmol/L PMSF) 4 ℃持續(xù)振搖裂解30 min后離心，上清液即為所提蛋白。按照碧云天二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒步驟測定蛋白濃度，與5×蛋白上樣緩沖液按照5∶1的比例混勻，沸水中加熱5 min充分變性，進(jìn)行10%SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，Western封閉液1 h，一抗4 ℃搖床過夜孵育，二抗室溫孵育1 h，DAB顯色，用Image-labe軟件讀取各組條帶灰度值。

1.2.5 CCK-8法細(xì)胞增殖活性檢測 取對數(shù)生長期細(xì)胞，以每孔1×104/100 μL接種到96孔板，當(dāng)細(xì)胞生長至50%融合時(shí)，分別用4組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，設(shè)置5個(gè)濃度梯度，即1、2、3、4、5 μg/mL，每組每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)24、48、72 h后按CCK-8試劑說明書進(jìn)行OD值的檢測。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)測細(xì)胞凋亡率 待6孔板中的細(xì)胞長至50%～70%融合時(shí)每孔轉(zhuǎn)染2.5 μg DNA，48 h后加入不含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶(0.25%)消化，1 200 r/min離心5 min收集1×105/管細(xì)胞沉淀，500 μL 1×binding buffer重懸細(xì)胞，加5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI，室溫暗室孵育5 min，400目篩網(wǎng)過濾后，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，Winmdi軟件分析細(xì)胞凋亡率。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞免疫熒光檢測PTEN蛋白和PTEN-VP22融合蛋白的表達(dá)情況 分別用4組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Ec109細(xì)胞48 h后，細(xì)胞免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)PTEN組和PTEN-VP22組可見發(fā)綠色熒光細(xì)胞，PTEN-VP22組綠色熒光蛋白的量明顯多于PTEN組，pcDNA3組和VP22組未見發(fā)綠色熒光的細(xì)胞(圖1)。通過熒光定量酶標(biāo)儀對各組綠色熒光蛋白的OD值進(jìn)行測量，發(fā)現(xiàn)PTEN組和PTEN-VP22組OD值明顯高于pcDNA3組(P<0.05)，PTEN-VP22組OD值明顯高于PTEN組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

A:PTEN組；B:PTEN-VP22組；C:pcDNA3組；D:VP22組。

圖1 細(xì)胞免疫熒光檢測PTEN蛋白在不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的表達(dá)情況(×20)

*：P<0.05，與pcDNA3組比較；#：P<0.05，與PTEN組比較。

圖2 各轉(zhuǎn)染組PTEN熒光蛋白定量OD值

2.2 Western blot檢測目的蛋白的表達(dá)情況 Western blot 結(jié)果顯示PTEN和PTEN-VP22組分別檢測到相對分子質(zhì)量為54×103的PTEN蛋白和相對分子質(zhì)量為90×103的PTEN-VP22融合蛋白的特異性條帶(圖3)。和pcDNA3組相比，PTEN組和PTEN-VP22組p-Akt蛋白的表達(dá)減少(P<0.05)，PTEN-VP22組p-Akt蛋白灰度值低于PTEN組(P<0.05)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖4、5。

1:PTEN組；2:PTEN-VP22組；3:pcDNA3組；4:VP22組。

圖3 Western blot檢測各轉(zhuǎn)染組PTEN、PTEN-VP22蛋白表達(dá)情況

1:pcDNA3組；2：PTEN組；3:PTEN-VP22組；4:VP22組。

圖4 Western blot 檢測 p-Akt蛋白在各轉(zhuǎn)染組中的表達(dá)水平

*：P<0.05，與pcDNA3組比較；#：P<0.05，與PTEN組比較。

圖5 Western blot分析p-Akt蛋白在不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組中表達(dá)水平

2.3 CCK-8檢測4組質(zhì)粒對Eca109細(xì)胞增殖活性的影響 與pcDNA3組相比，PTEN-VP22組和PTEN組Eca109生長呈現(xiàn)抑制作用(P<0.05)，其抑制作用具有時(shí)間、濃度依賴性，PTEN-VP22組在0.5 μg/mL處開始，較PTEN組出現(xiàn)顯著地抑制細(xì)胞增殖的活性(P<0.05)，作用48 h后在0.5 μg/mL濃度處其抑制率接近50%，而VP22對Eca109的生長未表現(xiàn)出抑制作用(P>0.05)，見圖6。

A:作用48 h時(shí)不同濃度藥物對細(xì)胞的生長抑制曲線；B:0.5 μg/mL藥物作用不同時(shí)間對細(xì)胞的生長抑制曲線。

圖6 CCK-8檢測各組細(xì)胞增殖活性

2.4 Annexin V/PI雙染法檢測4組質(zhì)粒對Eca109細(xì)胞凋亡的影響 PTEN組、PTEN-VP22組、VP22組細(xì)胞凋亡率分別為(30.66±0.99)、(69.55±0.38)%和(7.86±0.13)%，pcDNA3組凋亡率為(7.65±0.28)%。和pcDNA3組相比，PTEN組、PTEN-VP22組凋亡率明顯升高(P<0.05)，并且PTEN-VP22組凋亡率也明顯高于PTEN組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖7、8。

A:PTEN組；B:PTEN-VP22組；C:pcDNA3組；D:VP22。

圖7 流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡

*：P<0.05，與pcDNA3組比較；#：P<0.05，與PTEN組比較。

圖8 流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡

3 討 論

PTEN基因定位于人類染色體10q23.3，全長200 kb，有9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子，編碼的PTEN蛋白含有403個(gè)氨基酸。PTEN的基因產(chǎn)物是一種多功能蛋白，具有脂質(zhì)磷酸酶活性，可對抗磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositide 3-kinase，PI3K)調(diào)控的細(xì)胞生長因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，降低脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸(Phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate,PIP3)水平，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、促進(jìn)凋亡[8-9]。根據(jù)PTEN基因及其表達(dá)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)和PTEN在其他腫瘤表達(dá)下調(diào)機(jī)制的研究，發(fā)現(xiàn)PTEN基因遺傳學(xué)及表觀遺傳學(xué)異常導(dǎo)致食管癌中PTEN表達(dá)減少[10]。本研究通過外源性導(dǎo)入表達(dá)PTEN蛋白的重組質(zhì)粒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PTEN重組質(zhì)粒能在Eca109細(xì)胞中表達(dá)PTEN蛋白，發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，這與李菲[11]研究的轉(zhuǎn)染 PTEN 質(zhì)粒對食管癌細(xì)胞增殖具有一定的抑制作用的報(bào)道一致。

研究已經(jīng)證實(shí)，VP22融合蛋白能夠介導(dǎo)治療蛋白在相鄰的細(xì)胞間進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)，從而達(dá)到治療性蛋白發(fā)揮功效的水平，在整體上發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。本研究將重組質(zhì)粒pcDNA3-PTEN、pcDNA3-PTEN-VP22用脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)入細(xì)胞后進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PTEN-VP22組PTEN綠色熒光蛋白的表達(dá)量明顯高于PTEN組，說明VP22確實(shí)能夠介導(dǎo)PTEN蛋白在細(xì)胞間轉(zhuǎn)運(yùn)，增加PTEN蛋白的表達(dá)和分布，VP22介導(dǎo)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制大體是通過高爾基體依賴的途徑將其蛋白從最初轉(zhuǎn)染的細(xì)胞分泌，并且非常高效地轉(zhuǎn)運(yùn)至鄰近的細(xì)胞[12]。同時(shí)，本研究觀察到PTEN/VP22蛋白主要在細(xì)胞質(zhì)表達(dá)，細(xì)胞核也有少量的表達(dá)，這和PTEN蛋白的表達(dá)一致，所以VP22并不改變PTEN蛋白在細(xì)胞中的定位，這就決定了PTEN和其他只在細(xì)胞核發(fā)揮作用的腫瘤抑制基因不一樣，PTEN在調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的功能上都發(fā)揮著重要作用[13]。

大量研究發(fā)現(xiàn)PTEN的基因產(chǎn)物是一種具有蛋白和脂類雙重磷酸酶活性的抑癌蛋白，并且大多數(shù)腫瘤相關(guān)PTEN基因的突變都聚集在磷酸酶結(jié)構(gòu)域，提示PTEN磷酸酶活性在控制腫瘤的發(fā)生中起著重要的作用。PTEN蛋白能夠使局部黏著斑激酶(FAK)、Shc信號分子去磷酸化，F(xiàn)AK是調(diào)節(jié)細(xì)胞與細(xì)胞間黏附的關(guān)鍵分子，Shc與細(xì)胞的擴(kuò)散和遷移調(diào)控有關(guān)。PTEN的脂質(zhì)磷酸酶活性在調(diào)控PI3K細(xì)胞增殖信號通路中發(fā)揮著重要作用，同時(shí)PTEN也能抑制PI3K下游目標(biāo)絲氨酸/蘇氨酸激酶(Akt/PKB)活性，此活性被認(rèn)為是PTEN抗腫瘤作用的關(guān)鍵[14]。研究還發(fā)現(xiàn)PTEN過表達(dá)會(huì)減少Akt信號通路的激活，使其下游作用分子p-Akt表達(dá)量下降[15]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PTEN-VP22和PTEN組中p-Akt蛋白的量低于陰性對照組和空白對照組，PTEN-VP22組蛋白水平又低于PTEN組，說明抑癌蛋白PTEN確實(shí)能減少p-Akt蛋白表達(dá)水平，同時(shí)VP22能增強(qiáng)PTEN-VP22融合蛋白表達(dá)，并且保留PTEN蛋白的生物學(xué)活性，即負(fù)性調(diào)控PI3K/Akt信號通路，降低Akt的磷酸化水平，從而發(fā)揮抑癌活性。

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Research on influence of cell penetrating peptides VP22 on in vitro anti-tumor effect of tumor suppressor protein PTEN*

LiTingting1,YangQin2,YuXian3,HeGuanjun4,LeiJun4△

(1.DepartmentofAnesthesiology,NorthSichuanMedicalCollege,Nanchong,Sichuan637000,China;2.DepartmentofInfectiousDisease,AffiliatedHospitalofNorthSichuanMedicalCollege,Nanchong,Sichuan637000,China;3.DepartmentofPharmacy,SecondAffiliatedHospital,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400010,China;4.CollegeofPharmacy,NorthSichuanMedicalCollege,Nanchong,Sichuan637000,China)

Objective To construct the eukaryotic expression plasmid of cell penetrating peptides fusion protein PTEN-VP22 and to verify whether cell penetrating peptides VP22 could enhance the in vitro anti-tumor effect of tumor suppressor protein PTEN in esophageal cancer Eca109 cells.Methods The recombinant eukaryotic expression plasmid pcDNA3-PTEN,pcDNA3-PTEN-VP22 and pcDNA3-VP22 constructed by our laboratory at earlier stage were transfected into Eca109 cells respectively,and the cells transfected with empty plasmid pcDNA3 were used as negative control group.Immunofluorescence was used to detected the expression of PTEN protein in each group and PTEN-VP22 fusion protein,Western blot were used to determine the expression levels of PTEN and p-Akt protein,the cell proliferation activities were measured by CCK-8 method and the cell apoptosis rate was analyzed by flow cytometry.Results Compared with the pcDNA3 control group,the pcDNA3-PTEN group and pcDNA3-PTEN-VP22 group both inhibited the proliferation of Eca109 cells(P<0.05) and promoted the apoptosis of Eca109 cells(P<0.05) and the anti-tumor activities in pcDNA3-PTEN-VP22 group was significantly higher than that in the pcDNA3-PTEN group(P<0.05).The expression level of p-Akt in the pcDNA3-PTEN-VP22 group was significantly lower than that in the pcDNA3-PTEN group(P<0.05).Conclusion The cell penetrating peptides VP22 can enhance the anti-tumor activity in vitro of PTEN protein to Eca109 cells,its mechanism may be associated with the down-regulation of p-Akt expression level.

esophageal neoplasms;neoplasm proteins；recombinant fusion proteins；transfection；peptides;PTEN;VP22;gene therapy

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.03.007

四川省科技廳資助項(xiàng)目(2009JY0122)。 作者簡介：李婷婷(1990-)，助教，碩士，主要從事生物技術(shù)藥物藥理學(xué)方面研究?！?/p>

R966

A

1671-8348(2017)03-0308-04

2016-07-13

2016-10-04)