穩(wěn)定表達人BACE1啟動子及熒光素酶報告基因HEK293細胞株的建立*

鄧常青，朱炳林，龍 艷，羅 偉，陳國俊△

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)病學(xué)重點實驗室，重慶 400016；2.重鋼總醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，重慶 400037)

論著·基礎(chǔ)研究

穩(wěn)定表達人BACE1啟動子及熒光素酶報告基因HEK293細胞株的建立*

鄧常青1,2，朱炳林1，龍 艷1，羅 偉1，陳國俊1△

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)病學(xué)重點實驗室，重慶 400016；2.重鋼總醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，重慶 400037)

目的 對人β位點裂解酶-1(BACE1)基因核心啟動子進行克隆，構(gòu)建攜帶BACE1基因啟動子的熒光素酶報告載體，篩選穩(wěn)定表達細胞株并分析其轉(zhuǎn)錄活性。方法 提取人胚腎HEK293細胞基因組DNA，以其為模板，PCR擴增BACE1核心啟動子(-691～+67)并克隆至熒光素酶報告載體pGL4.21中，構(gòu)建BACE1基因啟動子熒光素酶報告載體pGL4.21-BACE1，將其轉(zhuǎn)染HEK293細胞(無啟動子的pGL4.21載體作陰性對照)，利用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定表達株后檢測其轉(zhuǎn)錄活性。結(jié)果 成功擴增到758 bp的BACE1核心啟動子，pGL4.21-BACE1載體經(jīng)雙酶切鑒定正確；HEK293細胞被該載體轉(zhuǎn)染后經(jīng)嘌呤霉素篩選得到6株穩(wěn)定表達BACE1啟動子的細胞株，其轉(zhuǎn)錄活性分別是對照組(HEK293/pGL4.21)的(134.7±22.3)、(634.0±13.9)、(437.6±6.1)、(805.5±5.5)、(492.8±59.1)、(1 021.1±46.6)倍(P=0.001)。結(jié)論 成功構(gòu)建了人BACE1基因啟動子熒光素酶報告載體。

β位點裂解酶-1；核心啟動子；熒光素酶報告載體；高通量藥物篩選

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)是一種神經(jīng)退行疾病，近年來其發(fā)病率不斷增高?，F(xiàn)有許多證據(jù)支持淀粉樣蛋白(amyloid beta,Aβ)的沉積是AD主要致病機制之一[1]。因此，減少Aβ沉積成為治療AD的一條重要途徑。β位點裂解酶-1(BACE1)是體內(nèi)主要的β-分泌酶，是裂解淀粉樣前體蛋白(APP)產(chǎn)生Aβ的限速酶。Aβ具有神經(jīng)毒性，可引起神經(jīng)突觸功能障礙、神經(jīng)元丟失，進而導(dǎo)致認知功能受損[2]。研究表明，在小鼠腦內(nèi)注射BACE1的小干擾RNA可減輕APP轉(zhuǎn)基因小鼠的Aβ沉積和提高認知功能[3-6]，這說明抑制BACE1表達會改善Aβ相關(guān)的認知功能障礙，因此β-分泌酶BACE1被作為開發(fā)AD藥物的潛在靶點。

目前，BACE1基因單核苷酸多態(tài)性與AD發(fā)病是否相互作用尚未定論[7-8]，而針對BACE1分子的靶向治療有望為治療AD提供新思路，但對于BACE1分子的上游調(diào)控機制仍不清楚。為此本試驗通過克隆人BACE1基因核心啟動子區(qū)，構(gòu)建熒光素酶報告系統(tǒng)并篩選其穩(wěn)定表達細胞株，為進一步研究BACE1基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、多態(tài)性分析及其高通量藥物篩選提供有力工具。

1 材料與方法

1.1 材料 人胚腎HEK293細胞為本實驗室保存；Phanta HS高保真DNA聚合酶購自Vazyme公司；限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶購自NEB公司；無內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提試劑盒、膠回收試劑盒、熒光素酶報告質(zhì)粒pGL4.21、熒光素酶檢測試劑購自Promega公司；TRIzol、脂質(zhì)體2000購自Invitrogen公司；DMEM培養(yǎng)基、Opti-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司；嘌呤霉素、二甲基亞砜(DMSO)購自Sigma公司；感受態(tài)細胞DH5α購自北京鼎國公司；引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。其余試劑為進口分析純。

1.2 方法

1.2.1 人基因組模板的制備 取對數(shù)生長期的HEK293細胞，采用TRIzol法[9]提取基因組DNA，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 人BACE1基因啟動子的擴增 以基因組DNA為模板，采用 Phanta HS高保真DNA聚合酶以特異性引物擴增BACE1基因上游約758 bp的核心啟動子(-691～+67)區(qū)，上游引物：5′-CTA GCT AGC CAG CCA TTT CTC CTC AGT CTG-3′，下游引物：5′-CCG CTC CTC GAG TCA GGC CAC CAT AAT CCA GCT-3′，下劃線分別為NheI和XhoI酶切位點。PCR反應(yīng)體系為：10×PCR緩沖液3.0 μL，dNTPs 1.0 μL，上下游引物各0.5 μL (10 μmol/L)，Phanta HS酶0.5 μL，基因組DNA 3.0 μL，加ddH2O補至30.0 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火60 s，72 ℃延伸30 s，共30個循環(huán)；72 ℃延伸7 min，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.3 BACE1基因啟動子熒光素酶報告載體的構(gòu)建 PCR產(chǎn)物和pGL4.21載體經(jīng)NheI和XhoI雙酶切后，在T4 DNA連接酶作用下16 ℃連接過夜并轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細胞，挑取2個氨芐青霉素篩選的陽性克隆。再經(jīng)NheI和XhoI雙酶切鑒定后送上海英駿公司測序，測序正確的命名為pGL4.21-BACE1，提取質(zhì)粒后-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 細胞培養(yǎng)及穩(wěn)定表達株的篩選 HEK293細胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清，100 U/mL青霉素和 100 μg/mL鏈霉素的 DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將匯合度約80%的HEK293細胞以4×105接種6孔板，待細胞貼壁生長至約70%～80%匯合度時進行轉(zhuǎn)染。用Opti-MEM培養(yǎng)基分別稀釋載體pGL4.21-BACE1(每孔5 μg)和脂質(zhì)體(每孔5 μL)(單獨轉(zhuǎn)染pGL4.21作為陰性對照組)，室溫孵育5 min，載體和脂質(zhì)體混合后室溫孵育20 min，加入HEK293細胞中，37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后48 h采用1 μg/mL濃度的嘌呤霉素篩選，篩選第14天時采用96孔板有限稀釋法克隆化，待單細胞長滿后轉(zhuǎn)至24孔板繼續(xù)培養(yǎng)，然后依次轉(zhuǎn)至12孔板、6孔板及10 cm培養(yǎng)皿繼續(xù)擴大培養(yǎng)(此過程2～3個月)。得到來自6株單克隆擴大培養(yǎng)的穩(wěn)定表達細胞株，用化學(xué)發(fā)光儀檢測其轉(zhuǎn)錄活性。選取熒光強度最高的進行后續(xù)試驗并命名為HEK293/pGL4.21-BACE1(陰性對照組命名為HEK293/pGL4.21)。

1.2.5 熒光素酶活性測定 熒光素酶活性測定按照熒光素酶活性檢測試劑盒說明書進行操作。簡單來說，將HEK293/pGL4.21-BACE1和HEK293/pGL4.21(陰性對照組)細胞以2×104接種96孔板(各3個重復(fù)孔)，培養(yǎng)24 h后每孔加與培養(yǎng)基等體積的Luciferase Reagent，輕輕混勻。室溫裂解10 min后在化學(xué)發(fā)光儀Glomax 96(Promega)中測量螢火蟲熒光素酶活性。

2 結(jié) 果

2.1 BACE1基因啟動子擴增產(chǎn)物的鑒定 提取HEK293細胞基因組DNA，以其為模板進行PCR擴增BACE1基因上游長度758 bp的核心啟動子(-691～+67)，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳可見大小約758 bp的條帶，與目的片段大小相符，見圖1。

M:DNA相對分子質(zhì)量標準; 泳道1～5:BACE1基因啟動子。

圖1 BACE1基因啟動子的PCR擴增

2.2 熒光素酶報告載體pGL4.21-BACE1的構(gòu)建與鑒定 758 bp的PCR產(chǎn)物與攜帶螢火蟲熒光素酶基因的pGL4.21分別以NheI和XhoI雙酶切，連接并轉(zhuǎn)化DH5α后挑取2個陽性克隆子。經(jīng)NheI和XhoI雙酶切后可見大小約5 532 bp(pGL4.21)與758 bp(BACE1啟動子)的2個片段出現(xiàn)(圖2A)。測序驗證也正確，這說明本研究成功構(gòu)建攜帶BACE1啟動子的熒光素酶報告載體，見圖2B。

A:熒光素酶報告載體pGL4.21-BACE1的酶切鑒定；B:攜帶BACE1基因啟動子的熒光素酶報告載體結(jié)構(gòu)圖。Luc2P:螢火蟲熒光素酶基因；PSV40:SV40啟動子；Puro:嘌呤霉素抗性基因；1:1號克隆子；2:2號克隆子。

圖2 熒光素酶報告載體pGL4.21-BACE1的鑒定及結(jié)構(gòu)圖

2.3 構(gòu)建穩(wěn)定表達BACE1啟動子的細胞系 pGL4.21-BACE1和陰性對照pGL4.21轉(zhuǎn)染HEK293細胞(6孔板)后48 h，培養(yǎng)基中加入嘌呤霉素進行穩(wěn)定篩選。培養(yǎng)第14天時采用有限稀釋法克隆化，最后篩選得到6株單克隆穩(wěn)定表達細胞株HEK293/pGL4.21-BACE1(克隆子1～6)。

2.4 穩(wěn)定表達細胞株具有轉(zhuǎn)錄活性 本研究對篩選到的6株穩(wěn)定表達細胞株進行熒光素酶活性檢測(把陰性對照組HEK293/pGL4.21的熒光值看作1)。結(jié)果表明，克隆子1～6均具有較強的熒光活性，其熒光值分別為對照組(HEK293/pGL4.21)的(134.7±22.3)、(634.0±13.9)、(437.6±6.1)、(805.5±5.5)、(492.8±59.1)、(1 021.1±46.6)倍(P=0.001)。其中，6號克隆子熒光活性最強，作為后續(xù)試驗使用。

3 討 論

BACE1是人體內(nèi)唯一的β分泌酶，它能剪切APP生成Aβ，且在AD患者腦中，Aβ是淀粉樣炎癥斑的主要組成成分，Aβ沉積在AD的發(fā)生、發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。抑制BACE1活性以降低Aβ生成成為治療AD的靶點。目前對AD治療的研究均致力于開發(fā)β-和γ-分泌酶抑制劑，以抑制Aβ的產(chǎn)生[10-13]，但是APP還可以被α-和γ-分泌酶裂解產(chǎn)生可溶性且具有神經(jīng)營養(yǎng)和神經(jīng)保護作用的sAPPα片段。所以非特異性地抑制γ-分泌酶會導(dǎo)致生理功能紊亂[14]。有報道稱在AD發(fā)病過程中，Aβ隨著BACE1的上調(diào)而增多，并與AD發(fā)病呈正相關(guān)[15]；用BACE1 siRNA處理神經(jīng)干細胞后Aβ產(chǎn)生明顯減少[6]。BACE1過表達或活性增強可能導(dǎo)致Aβ過度產(chǎn)生，最終誘導(dǎo)認知功能損傷。因此，針對BACE1的靶向治療可能成為治療AD的一種新途徑[10-12]。因此，構(gòu)建攜帶BACE1基因的熒光素酶報告載體來研究BACE1基因的調(diào)控和功能具有重要意義。

利用熒光素酶報告載體研究啟動子對下游基因的調(diào)控，可以避免下游基因表達產(chǎn)物對啟動子的干擾，能較好地反映外在因素對調(diào)控序列的影響。近年來，利用熒光素酶報告基因載體的藥物篩選方法得到廣泛應(yīng)用。本試驗通過克隆人BACE1基因核心啟動子，構(gòu)建螢火蟲熒光素酶報告載體pGL4.21-BACE1，并成功篩選到6株穩(wěn)定表達該啟動子的HEK293細胞株。本研究構(gòu)建的HEK293/pGL4.21-BACE1細胞株具有較強的轉(zhuǎn)錄活性，雖然比瞬時轉(zhuǎn)染時的轉(zhuǎn)錄活性低1～2個數(shù)量級，但是穩(wěn)定表達更利于藥物的高通量篩選，減少了組間差異。

綜上所述，本試驗成功構(gòu)建BACE1啟動子驅(qū)動的熒光素酶報告載體，并篩選到了穩(wěn)定表達細胞株，將為高通量藥物篩選及進一步研究BACE1基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控提供重要的細胞學(xué)研究手段。

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Construction of HEK293 cell line stably expressing human BACE1 promoter and luciferase reporter gene*

DengChangqing1,2,ZhuBinglin1,LongYan1,LuoWei1,ChenGuojun1△

(1.KeyLaboratoryofNeurology,FirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China; 2.DepartmentofIntensiveMedicine,ChonggangGeneralHospital,Chongqing400037,China)

Objective To clone human β-site APP cleaving enzyme (BACE1) gene core promoter for constructing luciferase reporter gene vector carrying BACE1 gene promoter and screening stable expression cell line,and to investigate its transcriptional activity.Methods The human embryo kidney HEK293 cell genome DNA was extracted as the template,BACE1 core promoter(-691～+67) was amplified by PCR,then was inserted into luciferase reporter vector pGL4.21.BACE1 gene promoter luciferase reporter vector pGL4.21-BACE1 was constructed,which was transfected into HEK293 cell (pGL4.21 vector without promoter as the negative control),after screening stable expression cell line by puromycin,the transcriptional activity was detected.Results About 758 bp BACE1 gene core promoter was successfully amplified by PCR.pGL4.21-BACE1 vector was correct by double enzyme identification.After transfecting HEK293 cell by this vector,6 cell strains stably expressing BACE1 promoter were obtained,and their transcriptional activities were (134.7±22.3),(634.0±13.9),(437.6±6.1),(805.5±5.5),(492.8±59.1),(1 021.1±46.6) times(P=0.001) of the control group(HEK293/pGL4.21) respectively.Conclusion Luciferase reporter vector of BACE1 gene promoter is constructed successfully.

β-site APP cleaving enzyme-1;core promoter;luciferase reporter gene vector;high-throughput drug screening

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.03.005

國家自然科學(xué)基金國際合作重大項目(81220108010)；國家自然科學(xué)基金 (81171197)；重慶市衛(wèi)生局重點基金 (2011-1-018) 。 作者簡介：鄧常青(1980- )，主治醫(yī)師，本科，主要從事阿爾茨海默病發(fā)病機制方面研究?！?/p>

Q291

A

1671-8348(2017)03-0302-03

2016-07-12

2016-10-06)