微囊化轉(zhuǎn)VEGF基因成肌細(xì)胞在全厚皮片移植中的動物實驗研究

高崧瀛 ，孫健 ，黃巍 ，王鑫 ,李冰 ，單靜 ,孫洋 ，王鋒 ，湯維波

1.黑龍江省醫(yī)院整形頜面外科，黑龍江哈爾濱 150036；2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院體檢中心，黑龍江哈爾濱 150001；3.黑龍江省醫(yī)院血管外科，黑龍江哈爾濱 150036;4.黑龍江省醫(yī)院手術(shù)室，黑龍江哈爾濱 150036;5.黑龍江省醫(yī)院麻醉科，黑龍江哈爾濱 150036;6.黑龍江省醫(yī)院泌尿外科，黑龍江哈爾濱 150036

CHANG在1964年首次提出人工細(xì)胞的概念，此后諸多學(xué)者在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域?qū)嶒炑芯?。目前，微囊化技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域已廣泛應(yīng)用。微囊化技術(shù)具有免疫隔離作用對細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞，可由微囊外營養(yǎng)物質(zhì)提供營養(yǎng)，同時較大顆粒的免疫成分不會對微囊內(nèi)的細(xì)胞等進(jìn)行吞噬及其它免疫排斥。整形外科皮膚移植是最常見的操作之一，全厚皮片具有耐磨性、顏色接近正常皮膚、彈性好，治療疤痕攣縮及面部、手部皮膚缺損等效果較為理想等多方面優(yōu)點，但其較中厚、刃厚皮片成活率低，存在部分壞死風(fēng)險較高不易為患者所接受，臨床應(yīng)用受到限制[1-4]。

全厚皮片移植的成活，除與手術(shù)因素有關(guān)，受區(qū)的營養(yǎng)狀態(tài)及細(xì)胞因子的活性也有一定關(guān)系。VEGF是一種細(xì)胞因子，其對血管增殖、再生等有良好的促進(jìn)作用，但VEGF在體內(nèi)降解快，直接注射成本高，效果差。通過微囊化技術(shù)的免疫隔離，可使VEGF在一定時期內(nèi)持續(xù)分泌，促進(jìn)全厚皮片成活，由于微囊化細(xì)胞周圍纖維化、囊內(nèi)氧和營養(yǎng)不足等原因微囊化細(xì)胞逐漸死亡，作用消失，不會對機(jī)體產(chǎn)生遠(yuǎn)期未知影響。通過實驗研究，如能明顯提高全厚皮片移植的成活率，可進(jìn)一步應(yīng)用于臨床。因此，該研究以2016年1月購自吉林大學(xué)實驗動物中心健康Wistar大鼠50只為研究對象，對比研究微囊化轉(zhuǎn)VEGF基因成肌細(xì)胞對提高大鼠全厚皮片移植成活率的影響，為進(jìn)一步的臨床應(yīng)用提供理論及實踐依據(jù)。

1 材料及方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主要試劑 轉(zhuǎn)VEGF基因成肌細(xì)胞 （哈醫(yī)大四院實驗中心凍存）、海藻酸鹽（Sigma公司）、氯化鋇（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）、免疫組化檢測抗體（第VIII抗體）（美國DAKO公司）

1.1.2 主要儀器 DYY-5型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、SHZ-88A恒溫振蕩器、全自動凝膠圖像分析系統(tǒng)、小型臺式離心機(jī)、TGL-16M冷凍離心機(jī)、電子天平、醫(yī)用型潔凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、CO2孵箱、微囊發(fā)生器、倒置顯微鏡及成像系統(tǒng)。

1.1.3 手術(shù)器械及藥品 常規(guī)外科手術(shù)器械、敷料及巾單，1.0%戊巴比妥，75%醫(yī)用酒精，0.25%碘伏，生理鹽水。Wistar大鼠，50只，2016年1月購于吉林大學(xué)實驗動物中心，雌雄不限，清潔級。體重250～300 g。

1.2 方法

（1）將凍存的轉(zhuǎn)VEGF基因成肌細(xì)胞進(jìn)行解凍、復(fù)蘇。加入有血清DMEM，放入37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并進(jìn)行傳代、擴(kuò)增。（2）微囊化過程將1 g海藻酸鈉加入到100 mL MilliQ水中，渦旋使部分海藻酸鹽溶解，然后將該溶液置于旋轉(zhuǎn)器上過夜。將無菌氯化鋇溶于無菌MilliQ水中，終濃度為30 mmol/L。使用前超凈臺紫外線滅菌30 min；準(zhǔn)備好用于微囊化的C2C12成肌細(xì)胞。對于成肌細(xì)胞，先用胰酶消化，然后轉(zhuǎn)移入一50 mL falcon試管中，500 rpm離心5 min，然后棄上清。以20 mL 0.9%NaCl重懸沉淀，500 rpm離心5 min，然后棄上清。重復(fù)上述步驟。以一個連有16G套管的1 mL注射器測量細(xì)胞沉淀的體積。用套管的尖將每100 μL 1%海藻酸鹽混合均勻。安裝微囊發(fā)生器和注射器，使用前高溫滅菌。使針尖距離沉淀培養(yǎng)皿20 cm。調(diào)整氧氣壓力至100 kpa，調(diào)節(jié)氧氣流量為8 L/min。將海藻酸鈉/細(xì)胞懸液裝入1 mL注射器中（裝入0.8 mL）。注意不要融入氣泡。將注射器裝在微囊發(fā)生器上，打開注射器驅(qū)動器，將海藻酸鈉/細(xì)胞懸液推入到微囊發(fā)生器中。用還有30 mL BaCl2的培養(yǎng)皿盛接微囊，放置2 min。收集微囊到含有20 mL生理鹽水的50 mL falcon試管中。500rpm離心3 min，棄上清。重復(fù)2遍。以含有DMEM的培養(yǎng)瓶懸浮微囊化細(xì)胞，在37℃/5%CO2孵箱中培養(yǎng)。（3）大鼠全厚皮片動物模型的構(gòu)建 以雙側(cè)髂棘連線為起始處，以背部中線為長軸標(biāo)記為4.0 cm×4.0 cm的范圍，作為皮片移植區(qū)。動物采用清潔級Wistar大鼠，重量250～300 g，雌雄不限。2016年1月購自吉林大學(xué)實驗動物中心，實驗動物在標(biāo)準(zhǔn)動物房內(nèi)飼養(yǎng)，標(biāo)準(zhǔn)飲食。（4）實驗動物分組 實驗動物總計50只，隨機(jī)化將其分為微囊化組和對照組。微囊化組按標(biāo)記范圍切取制備全厚皮片，在切取皮片后的創(chuàng)面上，給予多點注射轉(zhuǎn)VEGF基因成肌細(xì)胞混懸液，每點0.1 mL，縱橫間隔呈點陣樣，間隔均為1.0 cm。然后將切取的全厚皮片原位回植，打包包扎，放回籠中單籠飼養(yǎng)。對照組給予相應(yīng)位置等量生理鹽水注射，其他操作及步驟與微囊化組相同。（5）觀察指標(biāo) ①植皮成活面積觀察：植皮操作14 d后給予拆除打包包扎，觀察植皮成活情況，并攝影記錄。②大鼠植皮組織局部外源性VEGF檢測：取1 g大鼠移植皮膚，提取VEGF總蛋白。因該實驗所用的成肌細(xì)胞已轉(zhuǎn)染攜帶6his-tag，故通過鎳柱純化得到外源性VEGF蛋白，進(jìn)行Western blot特異性目的蛋白檢測（western blot所用抗體由美國Pierce公司提供，操作方法按說明書進(jìn)行），PVDF膜洗滌顯色后，固定，晾干。應(yīng)用掃描儀掃描得到結(jié)果。③單位面積血管計數(shù)：在微囊組和對照組，各隨機(jī)選取10只大鼠，于植皮區(qū)域隨機(jī)切取0.5 cm×0.5 cm面積，10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，HE染色，在10倍光鏡下計數(shù)12各視野下血管斷面數(shù)，并計算每平方厘米的微血管數(shù)。

1.3 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 微囊觀察

微囊近球形，大小較均勻，微囊之間無粘連。隨機(jī)選取10個微囊，測得平均直徑（75±15）μm。包裹細(xì)胞數(shù)目較恒定，平均20個/微囊，培養(yǎng)24 h后，觀察數(shù)目無明顯變化。

2.2 全厚皮片移植存活結(jié)果

應(yīng)用Image pro 5.0軟件對兩組植皮成活面積進(jìn)行測算，然后SPSS 15.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，微囊化組成活面積（14.1±0.61）cm2，對照組成活面積（13.5±0.55）cm2，微囊化組成活面積百分比（88.0±3.6）%，對照組成活面積百分比（84.5±3.5）%。微囊化組植皮成活面積百分比明顯高于對照組，兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.42，P＜0.01），見表 1。

表1 兩組中成活面積及百分比比較

表1 兩組中成活面積及百分比比較

組別 平均成活面積 （cm2） 成活面積百分比（%）微囊化組（n=25）對照組（n=25）t P 14.1±0.61 13.5±0.55 3.42＜0.01 88.0±3.6 84.5±3.5 4.65＜0.01

2.3 血管計數(shù)結(jié)果

微囊化組與對照組中，隨機(jī)切取的皮膚進(jìn)行微血管計算比較，微囊化組較對照組的微血管計數(shù)高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。 見表 2。

表2 兩組中微血管計數(shù)比較[，cm2]

表2 兩組中微血管計數(shù)比較[，cm2]

組別平均微血管數(shù)微囊化組（n=10）對照組（n=10）t P 25.8±3.99 20.6±5.46 2.43＜0.05

2.4 外源性VEGF蛋白檢測結(jié)果

通過鎳柱純化得到pcDNA6/HisA-VEGF(外源性VEGF蛋白)表達(dá)的Western blotting結(jié)果顯示微囊化組有外源性VEGF蛋白表達(dá)，對照組沒有檢測到外源性蛋白表達(dá)。

3 討論

全厚皮片移植是整形外科較為常見的治療手段之一。它被廣泛用于各種皮膚缺損的修復(fù)，如面部各種創(chuàng)傷（如外傷或燒傷）、腫瘤切除后等遺留的創(chuàng)面，重要功能部位的皮膚缺損等。植皮作為整形外科的基本治療技術(shù)，有著非常多的優(yōu)點，如操作簡單，不需要吻合血管等復(fù)雜操作，全厚皮片移植成活后耐磨性好，皮膚顏色、彈性、質(zhì)地較好，不存在供區(qū)知名血管、肌肉、神經(jīng)損傷等風(fēng)險，且植皮可選擇隱蔽部位作為供區(qū)，不受受區(qū)皮膚條件的限制。但全厚皮片移植的存活常不理想，除與術(shù)中臨床操作有一定關(guān)系，最主要因素為全厚皮片所需營養(yǎng)較刃厚、薄中厚皮片多，新生的毛細(xì)血管不足，不能及時長入，影響其成活。刃厚或薄中厚皮片雖較易成活，但耐磨性、易攣縮、恢復(fù)后皮膚顏色多為花斑樣等，常不能為理想的修復(fù)方法，局部皮瓣雖能彌補(bǔ)刃厚或薄中厚皮片的缺點，但常存在供區(qū)皮膚量不足等情況，應(yīng)用也受到限制。丁菲菲等[5]對56例患者進(jìn)行面部皮膚移植治療，其中全厚皮片15例，1例成活不佳，中厚皮片38例，全部成活。丁菲菲等又對142例患者，157只手部瘢痕攣縮的患者進(jìn)行皮膚移植，其中115只手采用全厚皮片移植，2只手厚中厚皮片移植，40只手中厚皮片移植，全厚皮片中5例完全成活，75例基本成活，33例成活不佳，2例完全壞死；而中厚皮片移植中2例完全成活，34例成活良好，4只基本成活。此數(shù)據(jù)表明，中厚皮片較全厚皮片更易成活。全厚皮片動物模型的報道不多，該研究采用大鼠背部構(gòu)建全厚皮片移植主要因為前期曾進(jìn)行大鼠缺血皮瓣的實驗研究，大鼠皮下組織疏松，切取全厚皮片操作簡單，設(shè)計4.0 cm×4.0 cm的皮瓣對大鼠來說，屬較大面積植皮，更具說服力。因沒有類似的大鼠全厚皮片移植結(jié)果作為對比，故采用對照研究，以獲得較為客觀的數(shù)據(jù)。該實驗應(yīng)用微囊化組和對照組各25只大鼠，全厚皮片成活面積顯示，微囊化組成活面積高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），與文獻(xiàn)資料記載臨床觀察相符合。

VEGF作為一種內(nèi)皮細(xì)胞的特異性有絲分裂原，也是一種有效的血管形成和血管通透性誘導(dǎo)因子。VEGF具有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移、誘導(dǎo)毛細(xì)血管管腔形成的作用。理論上可能有促進(jìn)移植組織成活的作用。VEGF、bFGF等生長因子在皮片、皮瓣移植方面應(yīng)用的動物實驗研究也常見報道，但通過局部皮內(nèi)或皮下注射給藥方式并不理想，因VEGF體內(nèi)半衰期僅6 min，通常不及擴(kuò)散就被降解消失，連續(xù)給藥會加重局部的組織損傷，所以，我們提出微囊化注射的方法，能解決上述的不足。轉(zhuǎn)VEGF基因成肌細(xì)胞能持續(xù)分泌VEGF，但在體內(nèi)由于排斥反應(yīng)很快被免疫系統(tǒng)破壞。已有實驗研究證實，微囊化與否對轉(zhuǎn)VEGF基因成肌細(xì)胞分泌VEGF蛋白過程沒有顯著影響[6]。李保國等[7]也對微囊化間充質(zhì)干細(xì)胞活力檢測方法進(jìn)行比較，目前已有較多手段對微囊化細(xì)胞活力進(jìn)行檢測。曾進(jìn)行微囊化轉(zhuǎn)VEGF基因成肌細(xì)胞治療大鼠缺血皮瓣的研究，獲得較理想的效果，對該實驗進(jìn)行全厚游離皮片移植也是一個啟示和佐證[8]。該次在微囊化組及對照組中，隨機(jī)各切取了10個標(biāo)本進(jìn)行微血管計數(shù)檢測，結(jié)果顯示，微囊化組微血管數(shù)高于對照組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。再一次證實了VEGF的作用。微囊化細(xì)胞由于周圍纖維細(xì)胞增生，使氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)供給阻斷，最終微囊化細(xì)胞壞死，這是至今仍未解決的問題[9]。目前的研究結(jié)果，人工細(xì)胞還不能達(dá)到生命體那樣自我復(fù)制、自我修復(fù)、自我進(jìn)化[10]。但這些對全厚皮片移植沒有任何影響，相反地，排除了微囊化細(xì)胞持續(xù)分泌VEGF，有誘發(fā)腫瘤的潛在風(fēng)險[11]，是一種較為安全的方法。

綜上所述，經(jīng)該實驗證實，微囊化轉(zhuǎn)VEGF基因成肌細(xì)胞在全厚皮片移植受區(qū)創(chuàng)面多點注射，能顯著提高全厚皮片移植的成活率。通過進(jìn)一步實驗及臨床研究，將此方法早日應(yīng)用于臨床，為整形外科和燒傷科醫(yī)生提供多一種理想的選擇方法。

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[1]慕森，李仔儒，杜曉明.全厚皮片移植在面部皮膚缺損修復(fù)中的應(yīng)用[J].臨床皮膚科雜志，2014,43(4):255-256.

[2]慕森，趙春燕，高成貴，等.全厚皮片移植修復(fù)皮膚缺損34例[J].中華皮膚科雜志，2015，48(6):431-432.

[3]郝永紅，許明火，高全文，等.全厚皮片移植修復(fù)手部瘢痕攣縮畸形[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2015,24(8):14-15.

[4]孫天駿，焱福.微囊化基因工程細(xì)胞的研究進(jìn)展[C].中華醫(yī)學(xué)會燒傷外科學(xué)分會2011年學(xué)術(shù)年會論文匯編,2012.

[5]丁菲菲，林源，蒙誠躍，等.手指瘢痕攣縮屈曲嚴(yán)重畸形的矯形治療[J].中華損傷與雜志,2015,10(1):30-32.

[6]高崧瀛，劉長松，黃巍.微囊化對轉(zhuǎn)VEGF基因成肌細(xì)胞血管內(nèi)皮生長因子分泌的實驗研究[J].黑龍江醫(yī)學(xué),2012,36(6):417-419.

[7]李保國，劉榮，佀國寧.微囊化間充質(zhì)干細(xì)胞活力檢測方法比較[J].上海理工大學(xué)學(xué)報,2016,38(6):594-597.

[8]Weihua Chen,Daping Yang,Peng Wang，et al.Microencapsulated Myoblasts Transduced by the Vascular Endothelial Growth Factor(VEGF)Gene for the Ischemic Skin Flap[J].Aesthetic Plastic Surgery,2011,35(3):326-332.

[9]王貫喬，朱海，劉堯娟，等.微囊化胰島細(xì)胞移植在抗纖維增生方面的相關(guān)研究[J].實用器官移植電子雜志,2016,4(6):341-344.

[10]劉巍，李培森，李可，等.人工細(xì)胞制備的研究進(jìn)展[J].天津工業(yè)大學(xué)學(xué)報,2016,35(5):11-19.

[11]李玉靈，趙華，任秀寶.VEGF及其受體與免疫抑制細(xì)胞關(guān)系的研究進(jìn)展[J].山東醫(yī)藥,2016,56(17):105-107.