斑點(diǎn)叉尾NK-lysin成熟肽在畢赤酵母中的表達(dá)

吳 慧，陶 妍

(上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306)

吳 慧，陶 妍

(上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306)

NK-lysin是自然殺傷細(xì)胞(NK)和毒性T細(xì)胞(CTLs)中產(chǎn)生的具有抗菌作用的陽(yáng)離子多肽，與顆粒溶素在結(jié)構(gòu)和功能上有很大的相似性[1,2]，是細(xì)胞免疫系統(tǒng)的效應(yīng)分子，在動(dòng)物抵御病毒、細(xì)菌等感染過(guò)程中起著非常重要的作用[3]。Andersson等首次從豬的小腸中提取到NK-lysin，并鑒定了其結(jié)構(gòu)和功能[4]；張殿卿等通過(guò)熒光定量RT-PCR法檢測(cè)了在不同濃度脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、不同時(shí)間刺激下，綿羊NK-lysin基因在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)量及在不同免疫器官中的表達(dá)情況[5]。魚(yú)類中也發(fā)現(xiàn)具有類似作用的NK-lysin，它是魚(yú)類在抵御病毒、細(xì)菌和寄生蟲(chóng)等感染過(guò)程中的先天性免疫成分[6-10]。迄今為止，關(guān)于NK-lysin的研究報(bào)道主要聚焦于基因克隆及其在不同組織器官中的表達(dá)[11]，但很少有涉及重組DNA表達(dá)方面的。

1 材料與方法

1.1 材料

pET-32a(+)-mNK-lysin來(lái)自于本研究室，用于質(zhì)粒復(fù)制的大腸桿菌DH5α購(gòu)自天根生物科技公司(北京)；限制性內(nèi)切酶(EcoRI、XbaI、SacI)、T4DNA連接酶、克隆質(zhì)粒pMD-19T simple vector購(gòu)自TaKaRa公司(日本)；胰蛋白胨、酵母粉為OXOID公司(英國(guó))產(chǎn)品；DNA割膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、酵母DNA提取試劑盒、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)和PCR反應(yīng)試劑購(gòu)自天根生物科技有限公司；博來(lái)霉素ZeocinTM、真核表達(dá)載體pPICZαA及野生型畢赤酵母X-33購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。其他試劑為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.2 方法

1.2.1 基于PCR的mNK-lysin成熟肽基因酶切位點(diǎn)和His標(biāo)簽的添加

以本研究室已有的原核重組表達(dá)載體pET-32a(+)-mNK-lysin為模板，以5’端添加EcoRI酶切位點(diǎn)和3’端添加4×His標(biāo)簽為目的，設(shè)計(jì)引物F1、R1(表1)用于第一次PCR，PCR反應(yīng)體系(20 μL)：上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL、10×PCR Buffer 2.0 μL、dNTPs (2.5 mmol/L) 1.6 μL、TaqDNA聚合酶(2.5 U/μL) 0.2 μL、DNA模板0.5 μL、無(wú)菌水14.1 μL；反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min、94 ℃變性30 s、53 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min。以第一次PCR產(chǎn)物為模板，以3’端依次添加2×His標(biāo)簽、終止密碼子和XbaI酶切位點(diǎn)為目的，設(shè)計(jì)引物F2、R2(表1)進(jìn)行第二次PCR,反應(yīng)體系和條件同上，除退火溫度改為56 ℃。割膠回收第二次PCR產(chǎn)物后，與pMD-19T質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜；挑選陽(yáng)性克隆用于DNA測(cè)序。

表1 引物序列

Tab.1 Sequences of the primers

引物引物序列長(zhǎng)度F1GGAATTCTGTTGGGCGTGTCAGTGG25R1ATGATGATGATGGATCTGCTTGTGGTGTTGTG’32F2GGAATTCTGTTGGGCGTGTCAGTGG25R2GCTCTAGACTAATGATGATGATGATGATGGATCTGCTT385’AOX1GACTGGTTCCAATTGACAAGC213’AOX1GCAAATGGCATTCTGACATCC21

注：下劃線標(biāo)記的序列分別為EcoRI和XbaI的酶切位點(diǎn)。

1.2.2 真核重組表達(dá)載體pPICZαA-mNK-lysin的構(gòu)建及電轉(zhuǎn)至畢赤酵母X-33

經(jīng)DNA 測(cè)序確證的陽(yáng)性菌落經(jīng)培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒，采用EcoRI和XbaI對(duì)其雙酶切后獲得目的片段“mNK-lysin”；將此片段與經(jīng)相同限制性酶處理過(guò)的pPICZαA 連接(圖1)，在T4DNA連接酶作用下，16 ℃反應(yīng)過(guò)夜；轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。通過(guò)菌落PCR、雙酶切和DNA測(cè)序鑒定重組表達(dá)載體pPICZαA-mNK-lysin；采用SacI對(duì)其進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)回收后與畢赤酵母X-33感受態(tài)細(xì)胞以1∶8(V/V)混合，轉(zhuǎn)入預(yù)冷的0.2 cm電轉(zhuǎn)杯中，冰浴5 min，1.5 kV、25 μF、200電擊5 ms，立即加入1 mL預(yù)冷的1 mol/L山梨醇，離心后菌體涂布于含100 μg/mL博來(lái)霉素的YPDS平板(酵母粉10 g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L、山梨醇182.2 g/L、瓊脂20 g/L)，30 ℃孵育至單菌落產(chǎn)生。

圖1 重組表達(dá)載體pPICZαA-mNK-lysin的構(gòu)建

1.2.3 甲醇利用快速型高拷貝酵母轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定

挑取6個(gè)長(zhǎng)勢(shì)良好的菌落分別接種至含100 μg/mL博來(lái)霉素的YPD平板(酵母粉10 g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂20 g/L)，篩選高拷貝酵母轉(zhuǎn)化子。將篩選到的轉(zhuǎn)化子分別接種到MM平板(YNB13.4 g/L、生物素0.4 mg/L、甲醇5 mL/L,瓊脂15 g/L)和MD平板(無(wú)氨基酸酵母氮源(yeast nitrogen base without amino acids,YNB)13.4 g/L、生物素0.4 mg/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂15 g/L)，篩選甲醇利用快速型轉(zhuǎn)化子。對(duì)篩選到的轉(zhuǎn)化子提取酵母基因組DNA，以此為模板，采用pPICZαA的通用引物5’AOX1和3’AOX1(表1)進(jìn)行PCR鑒定。

1.2.4 mNK-lysin的誘導(dǎo)表達(dá)及Tricine-SDS-PAGE

挑取上述優(yōu)良轉(zhuǎn)化子(高拷貝、甲醇利用快速型、經(jīng)PCR鑒定合格)在50 mL BMG培養(yǎng)基(YNB13.4 g/L、生物素0.4 mg /L、甘油10 mL/L、磷酸鉀緩沖液100 mmol/L,pH6.0)中，29 ℃、250 rpm培養(yǎng)至 OD600為3.0～6.0，8 000 rpm離心5 min收集菌體，重懸于500 mL BMM培養(yǎng)基(配方同BMG培養(yǎng)基，除了甲醇取代甘油)中，調(diào)OD600至1.0；29 ℃、250 rpm培養(yǎng)120 h，每隔24 h補(bǔ)加占總體積0.5%的甲醇。收集不同發(fā)酵時(shí)間的培養(yǎng)液用作Tricine-SDS-PAGE分析(濃縮膠濃度4%、夾層膠濃度10%、分離膠濃度15.5%)，超低分子量蛋白Marker由中科瑞泰(北京)生物科技有限公司提供。

1.2.5 重組體mNK-lysin的分離純化和Western blot鑒定

重組體mNK-lysin的C端帶有6×His標(biāo)簽，因此可用鎳親和層析的方法純化目的蛋白。1.2 L表達(dá)72 h的培養(yǎng)液經(jīng)離心得上清，用去離子水透析后上Profinia蛋白質(zhì)純化儀，通過(guò)Tricine-SDS-PAGE分析其純度。電泳后的凝膠用于Western blot分析，陰性對(duì)照為含pPICZαA空載體的酵母表達(dá)上清；轉(zhuǎn)膜條件為100 V恒壓1 h，PVDF膜依次用抗His標(biāo)簽鼠單克隆抗體和HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG孵育，最后用HRP-DAB顯色試劑盒顯色。

2 結(jié)果

2.1 添加酶切位點(diǎn)和6×His標(biāo)簽的mNK-lysin基因的擴(kuò)增

第一次PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果顯示，在292 bp處有清晰條帶(圖2A)，該片段在mNK-lysin成熟肽基因的5’端加上了EcoRI酶切位點(diǎn)，3’端添加了4×His的密碼子；以第一次PCR產(chǎn)物為模板，第二次PCR獲得了1個(gè)309 bp的片段(圖2B)，該片段在3’端依次添加了2×His的密碼子、終止密碼子和XbaI酶切位點(diǎn)。DNA測(cè)序證明2個(gè)酶切位點(diǎn)和6×His標(biāo)簽的密碼子被正確添加。除去2個(gè)酶切位點(diǎn)和終止密碼子，其余291 bp編碼了97個(gè)氨基酸殘基，內(nèi)含6個(gè)保守的半胱氨酸殘基(圖3)，它們可以在空間上形成3對(duì)二硫鍵以穩(wěn)定mNK-lysin的結(jié)構(gòu)。

圖2 對(duì)目的片段添加酶切位點(diǎn)和His標(biāo)簽的PCR擴(kuò)增

圖3 mNK-lysin的核苷酸及其推斷的氨基酸序列Fig.3 Nucleotide and deduced amino acid sequences of the mNK-lysin gene 下劃線標(biāo)記的是EcoRⅠ和XbaⅠ的酶切位點(diǎn)，方框內(nèi)是保守的半胱氨酸殘基，星號(hào)是終止密碼子

2.2 重組表達(dá)載體pPICZαA-mNK-lysin的構(gòu)建及其鑒定

將上述片段與pPICZαA連接，構(gòu)建重組表達(dá)載體pPICZαA-mNK-lysin后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，經(jīng)培養(yǎng)后挑取陽(yáng)性菌落為模板，使用載體通用引物5’AOX1和3’AOX1進(jìn)行PCR，得到一個(gè)832 bp的片段(圖4A)；另一方面，對(duì)重組表達(dá)載體pPICZαA-mNK-lysin純化后，使用EcoRI和XbaI對(duì)其進(jìn)行雙酶切，獲得303 bp的mNK-lysin片段(圖4B)。DNA測(cè)序顯示序列正確(結(jié)果未顯示)。據(jù)此可以證明重組表達(dá)載體pPICZαA-mNK-lysin已成功構(gòu)建。

2.3 經(jīng)篩選和鑒定的甲醇利用快速型高拷貝酵母轉(zhuǎn)化子

將線性化的重組表達(dá)載體pPICZαA-mNK-lysin電轉(zhuǎn)進(jìn)畢赤酵母細(xì)胞后，通過(guò)博來(lái)霉素篩選、甲醇利用速度篩選，獲得6個(gè)長(zhǎng)勢(shì)良好的酵母轉(zhuǎn)化子，選取1個(gè)長(zhǎng)勢(shì)最好的轉(zhuǎn)化子提取其基因組DNA作為模板，以載體的通用引物5’AOX1和3’AOX1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果顯示，在2 200 bp和832 bp處有明顯條帶(圖5)，前者為畢赤酵母X-33中因存在醇氧化酶基因AOX1自身的引物結(jié)合位點(diǎn)而擴(kuò)增的條帶，后者為含目的基因的擴(kuò)增條帶，與理論值相符。

圖4 重組表達(dá)載體pPICZαA-mNK-lysin的菌落PCR(A)和雙酶切鑒定(B)

圖5 高拷貝酵母轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定

2.4 發(fā)酵上清的Tricine-SDS-PAGE分析

圖6是在29 ℃，250 rpm，0.5%甲醇誘導(dǎo)條件下，發(fā)酵培養(yǎng)不同時(shí)間的發(fā)酵液上清的Tricine-SDS-PAGE分析結(jié)果。可以發(fā)現(xiàn)，表達(dá)不同時(shí)間的樣品均在約11.5 kD處有條帶，但空白對(duì)照(泳道1)在此位置未顯示條帶。經(jīng)蛋白質(zhì)濃度測(cè)定，表達(dá)時(shí)間為72 h的樣品蛋白質(zhì)濃度最高，據(jù)此，將表達(dá)時(shí)間確定為72 h。

圖6 發(fā)酵上清的Tricine-SDS-PAGE分析

2.5 經(jīng)親和層析獲得純化的重組體mNK-lysin

將擴(kuò)大體積培養(yǎng)72 h的發(fā)酵上清經(jīng)過(guò)Vivaflow200超濾膜包濃縮脫鹽后，采用固化金屬離子親和層析(IMAC)對(duì)其純化。Tricine-SDS-PAGE分析顯示，純化產(chǎn)物在11.5 kD處有單一條帶(圖7)，證明獲得較高純度的重組體mNK-lysin。進(jìn)一步將凝膠上的條帶電轉(zhuǎn)至PVDF膜，與抗His標(biāo)簽的鼠單克隆抗體(一抗)和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(二抗)反應(yīng)，進(jìn)行Western blot鑒定,經(jīng)DAB顯色,在11.5 kD處有明顯條帶(圖8)，因Western blot分析的靈敏度高于Tricine-SDS-PAGE分析，故該條帶較圖7中的條帶明顯，此結(jié)果進(jìn)一步證明重組體mNK-lysin在畢赤酵母X-33中得到成功表達(dá)。

圖7 純化產(chǎn)物的Tricine-SDS-PAGE分析

圖8 純化產(chǎn)物的Western blot分析

3 討論

[1]陳 菲,許 偉.Granulysin結(jié)構(gòu)和功能的研究進(jìn)展[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)免疫學(xué)分冊(cè),2005,(02):96-100.

[2]Kandasamy S,Mitra A.Characterization and expression profile of complete functional domain of granulysin/NK-lysin homologue (buffalo-lysin) gene of water buffalo (Bubalusbubalis) [J].Vet Immunol & Immunopathol,2009,128(4):413-417.

[3]吳 南,張永安.魚(yú)類自然殺傷樣細(xì)胞的研究進(jìn)展[J].水生生物學(xué)報(bào),2012,36(6):1176-1183.

[4]Andersson M,Curstedt T,J?rnvall H,et al.An amphipathic helical motif common to tumourolytic polypeptide NK-lysin and pulmonary surfactant polypeptide SP-B.[J].Febs Letters,1995,362(3):328-32.

[5]張殿卿,李 蕊,陳鵬博,等.不同濃度脂多糖誘導(dǎo)綿羊免疫器官中NK-Lysin基因表達(dá)的研究[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī),2014,(07):44-49.

[6]單 紅,周國(guó)勤,朱銀安,等.魚(yú)類抗菌肽的研究進(jìn)展[J].水產(chǎn)養(yǎng)殖,2012,33(1):20-25.

[7]張書(shū)劍.幾種魚(yú)類抗菌肽的研究進(jìn)展[J].飼料研究,2007,(12):58-61.

[8]Pereiro P,Varela M,Diaz-Rosales P,et al.ZebrafishNk-lysins:First insights about their cellular and functional diversification [J].Develop & Compara Immunol,2015,51:148-159.

[9]Zhang M,Hao L,Li S.A NK-lysin from Cynoglossus semilaevis enhances antimicrobial defense against bacterial and viral pathogens [J].Develop & Compara Immunol,2013,40(s3-4):258-265.

[10]Wang Q,Wang Y,Xu P,Liu Z.NK-lysin of channel catfish:Gene triplication,sequence variation,and expression analysis [J].Molecular Immunology,2006,43(10):1676-1686.

[11]Zhang M.NKLP27:A Teleost NK-Lysin Peptide that Modulates Immune Response,Induces Degradation of Bacterial DNA,and Inhibits Bacterial and Viral Infection [J].Plos One,2014,9(9):e106543-e106543.

[12]謝帝芝,劉 臻,王賞初,等.青魚(yú)生長(zhǎng)激素在畢赤酵母中的表達(dá)[J].淡水漁業(yè),2011,41(6):19-24.

[13]王樹(shù)云,李江宇,高志強(qiáng),等.鯉春病毒血癥病毒糖蛋白基因在畢赤酵母中的分泌表達(dá)[J].淡水漁業(yè),2015,(4):31-35.

[14]蘇 嵐,曾令兵,周 勇,等.草魚(yú)呼腸孤病VP6蛋白在畢赤酵母中表達(dá)的初步研究[J].淡水漁業(yè),2012,42(6):38-42.

[16]范翠英,馮利興,樊金玲,等.重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)的研究進(jìn)展[J].生物技術(shù),2012,22(2):76-80.

[17]郜趙偉.葡萄糖氧化酶基因密碼子優(yōu)化及其在畢赤酵母中的高效表達(dá)[D].西南大學(xué),2010.

[18]劉 朔.納豆激酶基因密碼子優(yōu)化設(shè)計(jì)與合成及在畢赤酵母中的高效表達(dá)[D].南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2007.

(責(zé)任編輯：張瀟峮)

Expression of Ictalurus punctatus NK-lysin Mature Peptide in Pichia pastoris

WU Hui,TAO Yan

(ShanghaiEngineeringResearchCenterofAquatic-ProductProcessing&Preservation,CollegeofFoodScienceandTechnology,ShanghaiOceanUniversity,Shanghai201306,China)

NK-lysins are antimicrobial peptides that are produced in cytotoxic T lymphocytes (CTLs) and natural killer (NK) cells and play an important role in immune response against microbial invasion.Thus,they are considered to be good substitutes for traditional antibiotics.In the present study,the prokaryotic recombinant expression vector “pET-32a(+)-mNK-lysin” forIctaluruspunctatusNK-lysin mature peptide,which was constructed in previous study,was used as the template of PCR.EcoRⅠandXbaⅠrestriction sites were added to 5’ and 3’ ends of themNK-lysinfragment respectively,and 6 x His tag was also added to 3’end to purify the target protein easily.ThemNK-lysinfragment was ligated to pPICZαA vector to construct a recombinant expression vector pPICZαA-mNK-lysin,which then was transformed into competentPichiapastorisX-33.The yeast transformants containing multicopy gene insertions were selected by using Zeocin and PCR identification for genomic DNA from yeast transformants.Recombinant mNK-lysin was induced with 0.5% methanol at 29 ℃and 250rpm.The expression product was purified by immobilized metal affinity chromatography (IMAC).Tricine-SDS-PAGE analysis indicated that molecular mass of the purified recombinant mNK-lysin was 11.5kD.Furthermore,Western blot analysis demonstrated that the recombinant mNK-lysin was expressed successfully inP.pastoris.

Channel catfish;NK-lysin mature peptide;Pichiapastoris;Recombinant DNA expression

2016-03-24；

2016-00-00

上海市教育委員會(huì)產(chǎn)學(xué)研項(xiàng)目(No.15CXY30)和農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)(南方)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金(No.UA201307)

吳 慧(1989- )，女，碩士，專業(yè)方向?yàn)樗a(chǎn)生物蛋白質(zhì)生物化學(xué)與分子生物學(xué)，E-mail:470621868@qq.com

陶 妍。ytao@shou.edu.cn

Q786

A

1000-6907-(2017)01-0078-06