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    福瑞鯉對氨氮脅迫的生理響應(yīng)

    2017-02-09 02:23:37李利紅袁宏利
    淡水漁業(yè) 2017年1期
    關(guān)鍵詞:幼魚氨氮抗氧化

    李利紅,袁宏利

    (山西省水產(chǎn)科學(xué)研究所,太原 030006)

    福瑞鯉對氨氮脅迫的生理響應(yīng)

    李利紅,袁宏利

    (山西省水產(chǎn)科學(xué)研究所,太原 030006)

    以福瑞鯉(Cyprinuscarpio)為材料,研究不同濃度氨氮(0、10、20和30 mg/L)處理對幼魚鰓組織中抗氧化系統(tǒng)和Na+/K+-ATP酶活力的影響。結(jié)果顯示,氨氮脅迫6 h誘導(dǎo)H2O2含量、總抗氧化能力(T-AOC)和超氧化物歧化酶(SOD)活性迅速顯著升高,并在脅迫24 h時(shí)達(dá)到最高水平。脅迫96 h后,各處理組H2O2含量、SOD 活性和總抗氧化能力均低于對照組水平,MDA含量顯著增加。氨氮脅迫后,Na+/K+-ATP酶基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白活性呈先降低后升高又降低的變化趨勢,參與脅迫過程中滲透壓的調(diào)控。研究結(jié)果表明,低濃度氨氮脅迫后,福瑞鯉鰓組織通過調(diào)節(jié)細(xì)胞抗氧化能力,提高Na+/K+-ATP酶活性,有效改善魚體的抗氨氮脅迫能力,但是高濃度氨氮脅迫對鰓組織造成氧化損傷。

    福瑞鯉(Cyprinuscarpio);氨氮;鰓組織;Na+/K+-ATP酶;抗氧化能力

    近年來,在規(guī)?;s化水產(chǎn)養(yǎng)殖中,高放養(yǎng)密度和高投飼率使得水體中的殘餌、肥料和生物排泄物等不斷增多,經(jīng)氨化作用產(chǎn)生大量的氨氮,成為目前水產(chǎn)養(yǎng)殖中影響魚類的主要脅迫因子之一[1-2]。養(yǎng)殖水體中的氨氮濃度經(jīng)常會(huì)在短時(shí)間內(nèi)急劇升高,通過魚鰓進(jìn)入體內(nèi),使魚體的鰓、腎和肝組織結(jié)構(gòu)發(fā)生病變、免疫力下降,生長、發(fā)育受阻,甚至導(dǎo)致死亡,嚴(yán)重影響水產(chǎn)品的產(chǎn)量和品質(zhì)[3-4]。目前,國內(nèi)外進(jìn)行了許多關(guān)于氨氮脅迫對水生動(dòng)物影響的研究。據(jù)報(bào)道,氨氮脅迫處理尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)、瓦氏黃顙魚(Pelteobagrusvachelli)后,造成組織中蛋白質(zhì)氧化和膜脂過氧化,導(dǎo)致肝功能衰竭,非特異性免疫防御系統(tǒng)遭到破壞[5]。然而,氨氮脅迫對魚體鰓組織抗氧化系統(tǒng)影響的研究甚少。

    福瑞鯉(FFRC strain common carp,Cyprinuscarpio)是2011年由建鯉和野生黃河鯉雜交獲得的鯉新品種,具有生長速度快、體型好、餌料轉(zhuǎn)化率高、適應(yīng)能力強(qiáng)和遺傳性狀穩(wěn)定等特點(diǎn),是農(nóng)業(yè)部“十二五”主推的大宗淡水養(yǎng)殖魚類之一[6]。本試驗(yàn)以福瑞鯉為材料,研究氨氮脅迫對福瑞鯉幼魚鰓組織抗氧化系統(tǒng)和Na+/K+-ATP酶活性的影響,探討氨氮對魚類的毒性機(jī)理以及福瑞鯉對養(yǎng)殖水體環(huán)境變化的適應(yīng)性,旨在為淡水魚類健康養(yǎng)殖提供科學(xué)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    試驗(yàn)用福瑞鯉幼魚購自長治沁縣漁場,體質(zhì)量(50.00±0.16)g。試驗(yàn)前室內(nèi)暫養(yǎng)2周,日投食2次。養(yǎng)魚用水為曝氣自來水,水溫(25±1)℃,pH 7.5±0.3,用充氧機(jī)連續(xù)充氣以保證溶解氧含量以上,正式實(shí)驗(yàn)前停食24 h。

    1.2 染毒實(shí)驗(yàn)

    魚類染毒采用靜態(tài)水質(zhì)接觸染毒法。通過預(yù)實(shí)驗(yàn),在確定福瑞鯉幼魚96 h 氨氮半致死濃度(25 ℃,T-AN:35.6 mg/L)的基礎(chǔ)上,設(shè)置1個(gè)對照組(0 mg/L)和3處理組(總氨氮T-AN=10 、20 和30 mg/L),每個(gè)處理設(shè)3個(gè)平行組。用氯化銨(NH4Cl)配制各實(shí)驗(yàn)組總氨氮濃度100 L,隨機(jī)放入健康活潑的福瑞鯉20尾。實(shí)驗(yàn)期間每天定時(shí)換水,采用萘氏試劑法測定并調(diào)整總氨氮濃度。

    1.3 樣品采集與分析

    在染毒 6、24、48 和96 h后,各實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)取福瑞鯉3尾,分別用自來水、蒸餾水沖洗后迅速解剖。取新鮮的第2鰓弓上的鰓絲,用生理鹽水潤洗,濾紙吸干水分。準(zhǔn)確稱量組織質(zhì)量,按質(zhì)量體積比制成10%的組織勻漿,4 ℃下3 500 r/min離心10 min,取上清液待用。Na+/K+-ATP酶活性、H2O2含量、SOD活性、總抗氧化力(T-AOC)和丙二醛(MDA)含量均采用南京建成生物工程研究所試劑盒測定,測定方法及單位參照試劑盒說明書。

    數(shù)據(jù)為3個(gè)平行組的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD),用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)和Duncan 多重比較分析處理組與對照組間的差異顯著性,取*P<0.05為差異顯著,**P< 0.01為差異極顯著。

    1.4 RNA提取和Real-time PCR分析

    取對照組和20 mg/L處理組染毒 6、24、48 和96 h后福瑞鯉幼魚第2鰓弓上的鰓絲,利用TaKaRa RNAiso Reagent提取總RNA。以總RNA為模板,使用PrimeScriptTMRT Master Mix(TaKaRa)合成cDNA。根據(jù)建鯉Na+/K+-ATP酶基因序列,設(shè)計(jì)Na+/K+-ATP酶α1和β1引物對分別為ATPα1FG、ATPα1RG和ATPβ1FG、ATPβ1RG。以β-actin基因作內(nèi)參,引物對為Neican F和Neican R(表1)。利用SYBR?Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)試劑盒進(jìn)行Real-time PCR分析,反應(yīng)采用Applied Biosystems 7500 Real time PCR儀。每個(gè)樣品重復(fù)三次,使用2-ΔΔCt計(jì)算方法,各組間比較采用獨(dú)立樣品t檢驗(yàn),P< 0.05 時(shí)差異顯著。

    表1 Na+/K+-ATPα1和β1基因Real-time PCR所用引物

    Tab.1 The primers used by Na+/K+-ATPase α1and β1 genes

    引物序列ATPα1FG5'-GTGGGCCGATTTGATCATTTGC-3'ATPα1RG5'-CCTGGGCTGCGTCGAATGATAAG-3'ATPβ1FG5'-GCACAGGCAGCAGTTGGTTCAAG-3'ATPβ1RG5'-CGTATTATCGCTCATGGAGAAGCTGATC-3'NeicanF5'-GTTGTCAGCAATGCCTCCTGC-3'NeicanR5'-ACTGGCACCGCGACCATC-3'

    2 結(jié)果

    2.1 氨氮脅迫對福瑞鯉鰓組織H2O2含量的影響

    氨氮脅迫后,福瑞鯉幼魚鰓組織H2O2含量呈上升趨勢(圖1)。氨氮脅迫6 h時(shí),鰓組織H2O2含量迅速升高。脅迫24 h后,各脅迫組H2O2含量呈濃度依賴性增高,與對照組相比差異極顯著(P<0.01)。之后,隨著氨氮脅迫時(shí)間的延長,鰓組織H2O2含量增幅降低。氨氮脅迫96 h后,僅10 mg/L組與對照組差異顯著(P<0.05),其它各組均恢復(fù)至對照組水平。

    2.2 氨氮脅迫對福瑞鯉鰓組織抗氧化能力的影響

    氨氮脅迫對福瑞鯉幼魚鰓組織T-AOC和SOD活性產(chǎn)生顯著影響(圖2)。 氨氮脅迫6 h時(shí),鰓組織T-AOC迅速增加。脅迫24 h后,各脅迫組T-AOC達(dá)到最大,與對照組相比差異極顯著(P<0.01)。之后,隨著氨氮脅迫時(shí)間的延長,鰓組織T-AOC仍顯著高于對照組,但增幅降低。氨氮脅迫96 h后,各脅迫組T-AOC均低于對照組,20 mg/L脅迫組與對照組相比差異顯著(P<0.05)。氨氮脅迫6 h時(shí),鰓組織SOD活性迅速提高至最大,10 mg/L和20 mg/L脅迫組與對照組差異極顯著(P<0.01),30 mg/L脅迫組與對照組差異顯著(P<0.05)。隨著氨氮脅迫時(shí)間的延長,鰓組織SOD活性增幅降低。脅迫48 h后,30 mg/L脅迫組顯著降低(P<0.05),其余各組與對照組相比無顯著差異。

    氨氮脅迫后福瑞鯉鰓組織MDA含量呈時(shí)間和濃度依賴性提高(圖2)。脅迫6 h后,鰓組織MDA含量呈濃度依賴性增加,但與對照組間無顯著差異。脅迫24 h時(shí),30 mg/L脅迫組MDA含量顯著高于對照組(P<0.05),而其他各組差異不顯著。48 h時(shí),20 mg/L和30 mg/L脅迫組MDA含量顯著高于對照組(P<0.05)。脅迫96 h后,各脅迫組MDA含量均達(dá)到最大峰值,10 mg/L和20 mg/L脅迫組與對照組差異顯著(P<0.05),30 mg/L脅迫組與對照組差異極顯著(P<0.01)。

    圖1 氨氮脅迫對福瑞鯉幼魚鰓組織H2O2含量的影響Fig.1 Effects of ammonia exposure on H2O2 content in the gill of C.carpio

    圖2 氨氮脅迫對福瑞鯉幼魚鰓組織抗氧化能力的影響Fig.2 Effects of ammonia exposure on antioxidative capacity in the gill of C.carpio

    2.3 氨氮脅迫對福瑞鯉鰓組織Na+/K+-ATP酶基因轉(zhuǎn)錄和蛋白活性的影響

    福瑞鯉幼魚鰓組織Na+/K+-ATP酶基因轉(zhuǎn)錄和蛋白活性水平在氨氮脅迫過程中發(fā)生明顯改變(圖3)。氨氮脅迫6 h時(shí),Na+/K+-ATP酶α1和β1基因表達(dá)無明顯變化。之后,Na+/K+-ATP酶α1和β1基因表達(dá)量隨著脅迫時(shí)間的延長逐漸升高,Na+/K+-ATP酶α1基因在脅迫48 h 時(shí)達(dá)到最大。Na+/K+-ATP酶β1基因表達(dá)變化較Na+/K+-ATP酶α1基因更為明顯,脅迫24 h即達(dá)到最大,脅迫48 h時(shí)仍顯著增高。氨氮脅迫96 h后,Na+/K+-ATP酶α1和β1基因表達(dá)量迅速下降,Na+/K+-ATP酶β1基因轉(zhuǎn)錄水平顯著降低。

    氨氮脅迫6 h時(shí),鰓組織Na+/K+-ATP酶活性迅速下降,但脅迫組與對照之間無顯著差異。之后,隨著氨氮脅迫時(shí)間的延長,鰓組織Na+/K+-ATP酶活性呈濃度依賴性增高,在脅迫48 h后,Na+/K+-ATP酶活性達(dá)到最大,與對照組相比差異極顯著(P<0.01)。氨氮脅迫96 h時(shí),鰓組織Na+/K+-ATP酶活性回落,但除30 mg/L組顯著降低外(P<0.05),其余各組與對照組相比無顯著差異。

    圖3 氨氮脅迫對福瑞鯉幼魚鰓組織Na+/K+-ATP酶的影響Fig.3 Effects of ammonia exposure on Na+/K+-ATPase in the gill of C.carpio

    3 討論

    水體中高濃度氨氮會(huì)阻斷魚體內(nèi)氨的排泄,使血液和組織中氨氮的含量上升。同時(shí),環(huán)境中氨通過鰓上皮滲入魚體內(nèi),對魚體細(xì)胞產(chǎn)生一系列毒害作用[7]。當(dāng)受到環(huán)境脅迫時(shí),魚體細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧,使蛋白質(zhì)、核酸、膜脂等生物大分子結(jié)構(gòu)損傷、功能異常,導(dǎo)致細(xì)胞生理活動(dòng)紊亂,引起細(xì)胞凋亡等[8-9]。生物體內(nèi)存在一套完整的抗氧化防御系統(tǒng),包括抗氧化物質(zhì)和抗氧化酶等,可以清除胞內(nèi)過量的活性氧,從而維持相對的動(dòng)態(tài)平衡[10-11]。研究表明,氨氮脅迫誘導(dǎo)青魚、羅非魚和凡濱濱對蝦出現(xiàn)氧化應(yīng)激,過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶和谷胱甘肽含量等發(fā)生改變[7,11]。本研究中,氨氮脅迫初期,福瑞鯉幼魚鰓組織內(nèi)產(chǎn)生大量的H2O2,SOD活性和T-AOC迅速增高,MDA含量較低,說明氨氮脅迫后福瑞鯉幼魚鰓組織中抗氧化能力提高,有效清除脅迫產(chǎn)生的活性氧,維持細(xì)胞正常的生理功能。但隨著氨氮脅迫時(shí)間的延長,胞內(nèi)過量的活性氧不能及時(shí)清除,從而造成組織細(xì)胞損傷,SOD活性降低,MDA含量顯著增加。MDA是膜脂過氧化的產(chǎn)物,可間接反映細(xì)胞的損傷程度,同時(shí)又可與蛋白質(zhì)的游離氨基作用,引起蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的交聯(lián),進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞損傷[12]。這預(yù)示著隨著氨氮脅迫時(shí)間的延長,福瑞鯉鰓組織脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強(qiáng),細(xì)胞抗氧化酶活性降低,從而引起細(xì)胞生理活動(dòng)紊亂。

    Na+/K+-ATP 酶是生物膜上存在的一種蛋白酶,由一個(gè)α亞基和一個(gè)β亞基組成[13]。據(jù)報(bào)道,許多環(huán)境因素如鹽度、重金屬及臭氧等都可影響到鰓組織Na+/K+-ATP酶活性[14]。研究結(jié)果表明,氨氮脅迫后,福瑞鯉幼魚鰓組織Na+/K+-ATP酶α1和β1基因表達(dá)量產(chǎn)生明顯影響,且基因轉(zhuǎn)錄水平的變化與氨氮脅迫濃度相關(guān),這為從分子水平上闡明脅迫過程中的滲透調(diào)節(jié)機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。Na+/K+-ATP 酶活性先下降后升高,最后又回到對照水平。氨氮脅迫初期,環(huán)境中高濃度氨氮滲入魚體細(xì)胞,使得Na+/K+-ATP 酶蛋白結(jié)構(gòu)改變而導(dǎo)致酶活力下降。之后,鰓主動(dòng)滲透調(diào)節(jié)機(jī)制被激活,Na+/K+-ATP 酶活性提高。最后,由于鰓組織中積累了大量的活性氧,脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物破壞Na+/K+-ATP 酶結(jié)構(gòu),導(dǎo)致酶活力降低[7,15]。

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    (責(zé)任編輯:陳細(xì)華)

    Physiological response of FFRC strain common carp to ammonia stress

    LI Li-hong,YUAN Hong-li

    (FisherySciencesResearchInstituteofShanxiProvince,Taiyuan030006,China)

    The effects of ammonia-N on antioxidant system and Na+/K+-ATPase were studied in the gill of FFRC strain common carp (CyprinuscarpioL.).The carp were transferred off the freshwater and exposed to different ammonia-N levels (0,10,20 and 30 mg/L),and each ammonia-N level was randomly triplicate and sampled at 0,6,24,48 and 96 h,respectively.The results showed that with the concentration of ammonia-N increased,the H2O2content,total antioxidant capacity (T-AOC) and superoxide dismutase (SOD) activity enhanced significantly at first 6 h and reached the maximun after 24 h exposure.Then,the H2O2content,SOD activity and T-AOC decreased,and MDA content increased significantly in all ammonia-N treatment group after 96 h exposure.The gene expression level of Na+/K+-ATPaseα1 and Na+/K+-ATPaseβ1 increased at 24 h,and then decreased to be lower than that of control group after 96 h exposure.Meanwhile,Na+/K+-ATPase activities decreased at first 6 h,and then increased gradually and reached the maximum at 48 h,showing the induction of Na+/K+-ATPase in response to ammonia-N stress.These results indicated that ammonia-N stress induced changes in antioxidant system and Na+/K+-ATPase level,which play a key role in preventing ammonia-N damage in gill cells.

    carp;ammonia stress;gill;Na+/K+-ATPase;antioxidant system

    2016-03-31;

    2016-05-24

    山西省青年科技研究基金(2013021022-5)

    李利紅(1982- ),女,博士,工程師,主要從事魚類生態(tài)毒理學(xué)研究。E-mail:lihongli19821129@163.com

    S965.89

    A

    1000-6907-(2017)01-0097-04

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