不同貯藏時間普洱生茶水提物的特征性成分分析

曾 亮，田小軍，羅理勇,3，官興麗，高林瑞,*

不同貯藏時間普洱生茶水提物的特征性成分分析

曾 亮1,2,3，田小軍1，羅理勇1,3，官興麗2,4，高林瑞2,4,*

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400716；2.云南大益茶業(yè)集團(tuán)，云南 昆明 650217；3.西南大學(xué)茶葉研究所，重慶 400716；4.云南省普洱茶發(fā)酵工程研究中心，云南 昆明 650217）

以同公司、同批號、不同貯藏時間的普洱生茶（7542）為研究對象，真空冷凍干燥制備普洱生茶水提取物，利用分光光度計(jì)和超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）檢測其內(nèi)含成分，并進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）和聚類分析（cluster analysis，CA），得出不同貯藏時間普洱生茶水提物的特征性成分和聚類樹狀圖。結(jié)果表明，不同貯藏時間的普洱生茶水提物，隨著貯藏時間的延長，茶多酚、兒茶素和游離氨基酸呈逐漸下降趨勢，黃酮呈逐漸上升趨勢，可溶性總糖和咖啡堿呈不規(guī)則變化；不同貯藏時間的普洱生茶提取物經(jīng)UPLC-MS/MS共檢測到107 種化合物，經(jīng)PCA，得到不同貯藏時間普洱生茶水提物的特征性成分包括檸檬酸、沒食子酸、表兒茶素、茶氨酸、咖啡堿、表沒食子兒茶素沒食子酸酯等26 種物質(zhì)；CA表明，貯藏年份越接近的普洱生茶水提物樣越易聚為一類，貯藏時間達(dá)到3 a和8 a時，茶葉聚類分類發(fā)生較大變化。

普洱生茶；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）；特征性成分；多元統(tǒng)計(jì)分析

普洱茶是因地名而得名的一類茶，在清代設(shè)有普洱府，因作為貢茶而聞名天下。2008年國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局將普洱茶設(shè)定為地理標(biāo)志產(chǎn)品，并定義為以云南大葉種曬青毛茶為原料，采用特定加工工藝制成，有獨(dú)特品質(zhì)風(fēng)格的茶葉，可分為普洱生茶和普洱熟茶[1]。

普洱生茶是將精制過的曬青茶經(jīng)蒸壓成型、干燥等工藝加工而成的緊壓茶，其干茶色澤墨綠、滋味濃厚回甘、香氣持久、湯色綠黃明亮、葉底肥厚；且因其獨(dú)特的品質(zhì)特點(diǎn)和保健功效備受大眾喜愛。不同貯藏時間的普洱生茶具有不同的品質(zhì)風(fēng)格，有普洱茶越陳越香和售價越高的說法[2]。普洱 生茶新茶品質(zhì)接近綠茶，陳茶湯色呈琥珀黃、口感濃厚回甘，老茶入口順滑生津，達(dá)到一定貯藏時間的老茶濃郁爽口。研究表明普洱茶具有抗菌、抗誘變[3]、解毒、助消化、降甘油三酯和膽固醇、減肥[4]、保護(hù)肝臟、抗癌[5]、防治心血管類疾病[6]等作用；此外普洱生茶含有的抗氧化活性化合物較多，抗氧化活性、清除自由基和保護(hù)細(xì)胞的效果均優(yōu)于普洱熟茶[7]，且具有抗疲勞的效果[8]。貯藏時間對普洱生茶化學(xué)成分有較大影響，隨著貯藏時間的延長，水分含量和黃酮類物質(zhì)逐漸增加，茶多酚類物質(zhì)尤其兒茶素類、咖啡堿及氨基酸呈逐漸下降趨勢[7,9]。

基于貯藏時間對普洱生茶成分和品質(zhì)的影響，本實(shí)驗(yàn)以2013—2004年大益普洱生茶（7542）為原料，采用分光光度計(jì)和超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）分析不同貯藏時間普洱生茶水提物的化學(xué)成分；同時結(jié)合簡單分析和主成分分析（principal component analysis，PCA）篩選出供試普洱生茶水提物的主要特征性成分；采用聚類分析（cluster analysis，CA）方法對不同貯藏時間的供試普洱生茶水提物進(jìn)行分類聚類研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2013—2004年大益普洱生茶（7542）樣品由云南大益集團(tuán)提供；均采用同一標(biāo)準(zhǔn)采摘的云南大葉種加工而成；貯藏于大益集團(tuán)恒溫恒濕條件的倉庫中（溫度20 ℃、相對濕度60%），保證了貯藏環(huán)境的一致性。

硫酸亞鐵、酒石酸鉀鈉、95%乙醇、香莢蘭素、濃硫酸、三氯化鋁、水合茚三酮、氯化亞錫、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、堿式乙酸鉛、葡萄糖（均為分析純），濃鹽酸（優(yōu)級純） 成都市科龍化工試劑廠；咖啡因（生化試劑） 上海試劑二廠；蒽酮（分析純）上?？曝S實(shí)業(yè)有限公司；乙腈、甲酸、甲醇（均為一級色譜純） 天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司；茶氨酸、槲皮素（均為標(biāo)準(zhǔn)品，純度＞99.0%） 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UPLC-MS/MS儀 美國Waters公司；KQ5200DE超聲波振動儀 江蘇昆山市超聲儀器有限公司；IEC CL31 multispeed高速離心機(jī) 美國Thermo公司；UV-2450紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津公司；SCIENTZ-30 ND冷凍干燥設(shè)備 寧波新芝生物科技股份有限公司；FA2004A電子天平 上海精天電子儀器有限公司；722型可見分光光度計(jì) 上海菁華科技儀器有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州澳華儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 生化成分測定

水分含量：按GB/T 8304—2013《茶水分的測定》進(jìn)行測定[10]；水浸出物含量：按GB/T 8305—2013《茶水浸出物的測定》進(jìn)行測定[11]；茶多酚含量：采用酒石酸亞鐵比色法[12]測定；兒茶素含量：采用香莢蘭素比色法[13]測定；黃酮含量：采用三氯化鋁（AlCl3）比色法[13]測定；可溶性總糖含量：采用蒽酮-硫酸比色法[13]測定；咖啡堿含量：按GB/T 8312—2013《茶咖啡堿的測定》中的紫外分光光度法進(jìn)行測定[14]；游離氨基酸總量：按GB/T 8314—2013《茶游離氨基酸總量的測定》進(jìn)行測定[15]。

1.3.2 普洱生茶提取物制備

浸提時間：2014年8月。提取物制備工藝：浸提（第1次：1∶15料液比（g/mL），75～80 ℃，45 min；第2次：1∶10料液比（g/mL），75～80 ℃，30 min）→提取液合并過濾→真空冷凍干燥。

制備率按下式計(jì)算：

式中：Z為制備率/%；M1為干燥后的提取物質(zhì)量/g；M為茶葉原料質(zhì)量/g；C為水浸出物含量/%。

1.3.3 UPLC-MS/MS測定

1.3.3.1 樣品前處理

稱取0.10～0.20 g樣品（普洱生茶水提物），加入20 mL水，再加入5 mL甲醇，超聲振動提取10 min，高速離心5 min，過0.22 μm有機(jī)相濾膜，上UPLC-MS/MS進(jìn)行測定。

1.3.3.2 UPLC-MS/MS條件

色譜柱：ACQUITY UPLC HSS，T3（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）；柱溫35 ℃；樣品溫度5 ℃；進(jìn)樣量5 μL；流動相A：0.1%甲酸溶液，流動相B：0.1%甲酸-乙腈溶液；流速0.25 mL/min。梯度洗脫見表1。

表1 流動相梯度洗脫程序Table1 Mobile phase gradient elution procedure

MS條件：電噴霧離子源正負(fù)模式；毛細(xì)管電壓3.0 kV；離子源溫度120 ℃；錐孔反吹氣流量50 L/h；脫溶劑氣溫度380 ℃；脫溶劑氣流量800 L/h；碰撞氣流量0.18 mL/min；質(zhì)量掃描范圍m/z 50～1 000；錐孔電壓10～50 kV。

以樣品中每組目標(biāo)物的峰面積與該組選擇標(biāo)準(zhǔn)參照物峰面積的比較相對定量，其中正離子電離模式選擇茶氨酸，負(fù)離子電離模式選擇槲皮素作為標(biāo)準(zhǔn)參照物進(jìn)行定量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)做3 次平行，取平均值。采用Origin 9.0作圖，IBM SPSS Statistics 19.0對生化成分和UPLC-MS/MS檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析、PCA和CA。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同貯藏時間普洱生茶水分、水浸出物和提取物制備率

表2 不同貯藏時間普洱生茶提取物制備率Table2 The yields of aqueous extracts from raw Pu-erh tea with different storage times

由表2可知，普洱生茶的含水量在9.3%～10.1%之間；其中貯藏5 a的最高，貯藏7 a的最低，分別為10.01%、9.37%。普洱生茶的水浸出物含量在42.0%～49.0%之間；其中貯藏6 a的最高，貯藏10 a的最低，分別為48.62%、42.23%。方差分析表明，普洱生茶的含水量和水浸出物各自在大部分貯藏時間之間不存在顯著差異，尤其是貯藏1 a與貯藏10 a的無顯著差異；說明普洱生茶在貯藏過程中貯藏條件好，保存得當(dāng)，避免了因貯藏條件造成的樣品生化成分的差異。普洱生茶提取物制備率在67.0%～82.0%之間；其中提取物制備率最高的是貯藏10 a的普洱生茶，最低的是貯藏6 a的，分別為81.61%、67.72%。所有樣品的水浸出物含量均在40.0%以上，提取物制備率均在67.0%以上，表明普洱生茶內(nèi)含物質(zhì)豐富，提取物制備方法較優(yōu)。

真空冷凍干燥技術(shù)能夠使水分由固態(tài)冰晶直接升華為水蒸氣被蒸發(fā)，從而達(dá)到干燥的目的。因此本研究采用真空冷凍干燥的方式對普洱生茶提取物進(jìn)行干燥，其在干燥過程中始終保持較低的溫度，能夠最大程度地保存其生化成分[16]；將普洱生茶提取物作為后續(xù)的檢測樣品，便于最大可能重現(xiàn)茶餅中的原始生化成分。

2.2 不同貯藏時間普洱生茶提取物的主要生化成分

文獻(xiàn)[7]報道不同貯藏時間普洱生茶的品質(zhì)、風(fēng)味及其主要生化成分不同，為了研究不同貯藏時間的普洱生茶主要生化成分的變化情況和規(guī)律，本實(shí)驗(yàn)采用分光光度法測定普洱生茶中對品質(zhì)和風(fēng)味影響較大的6 類生化成分，并比較分析其隨著貯藏時間呈現(xiàn)的變化規(guī)律。

2.2.1 茶多酚及兒茶素含量

圖1 不同貯藏時間普洱生茶提取物的茶多酚（A）和兒茶素（B）含量Fig. 1 The contents of polyphenol and catechin in aqueous extracts of raw Pu-erh tea with different storage times

由圖1A可知，隨著貯藏時間的延長，普洱生茶茶水提物的茶多酚含量呈下降趨勢；表現(xiàn)為貯藏1 a時最高，貯藏10 a時最低，降幅8.64%；貯藏時間達(dá)7 a時，茶多酚含量呈顯著下降。由圖1B可知，隨著貯藏時間的延長，普洱生茶水提物的兒茶素含量呈下降趨勢；表現(xiàn)為貯藏1 a時最高，貯藏10 a時最低，降幅為12.64%；貯藏時間達(dá)5 a時，兒茶素含量顯著下降。普洱生茶受貯藏環(huán)境的影響，易發(fā)生氧化、降解等現(xiàn)象，導(dǎo)致多酚類物質(zhì)的減少；茶多酚是茶湯滋味苦澀濃強(qiáng)的主要貢獻(xiàn)物質(zhì)且其氧化聚合形成茶色素（茶黃素、茶紅素和茶褐素）影響茶湯色澤；因此隨著多酚類物質(zhì)的減少和轉(zhuǎn)化，普洱生茶滋味變醇和，湯色變紅濃明亮，品質(zhì)和風(fēng)味更佳[9]。本研究結(jié)果也表現(xiàn)為普洱生茶水提物茶多酚和兒茶素含量隨著貯藏時間的延長而下降，與其他報道[9,17]相符。

2.2.2 黃酮含量

圖2 不同貯藏時間普洱生茶提取物的黃酮含量Fig. 2 Flavonoid contents of aqueous extracts of raw Pu-erh tea with different storage times

由圖2可知，隨著貯藏時間的延長，普洱生茶水提物的黃酮含量呈上升趨勢；表現(xiàn)為貯藏10 a時最高，貯藏1 a時最低，增幅為46.72%；其中貯藏5 a時，黃酮含量呈顯著增加。黃酮類物質(zhì)由黃酮苷和黃酮醇類組成，呈柔和的澀味且閾值低；貯藏過程中茶葉受酶或熱作用水解糖苷釋放溶于水的黃酮醇；同時因其母核常含甲氧基、羥基等助色基團(tuán)，使黃酮類物質(zhì)多呈黃色；因此，黃酮類物質(zhì)隨著貯藏時間的延長而增加，使普洱生茶茶湯色澤更紅黃明亮且滋味更醇和[18]。

2.2.3 可溶性總糖含量

圖3 不同貯藏時間普洱生茶提取物的可溶性總糖含量Fig. 3 Soluble sugar contents of aqueous extracts of raw Pu-erh tea with different storage times

由圖3可知，普洱生茶水提物隨著貯藏時間的延長無明顯規(guī)律；普洱生茶水提物貯藏5 a時最低，貯藏3 a時最高，分別為8.46%和10.64%?？扇苄钥偺侵饕獮閱翁呛碗p糖[19]，是構(gòu)成茶湯滋味和香氣的重要來源，在茶湯中呈甜味，對苦澀味有協(xié)調(diào)和掩蓋作用[20]。貯藏過程中，普洱生茶的可溶性糖含量無明顯變化規(guī)律，其原因可能是隨著貯藏時間的延長，一方面大分子碳水化合物被分解，導(dǎo)致可溶性糖含量增加；另一方面微生物大量繁殖，微生物作用增強(qiáng)，導(dǎo)致可溶性糖的消耗。

2.2.4 咖啡堿含量

圖4 不同貯藏時間普洱生茶提取物的咖啡堿含量Fig. 4 Caffeine contents of aqueous extracts of raw Pu-erh tea with different storage times

由圖4可知，咖啡堿含量隨著貯藏時間的延長無明顯變化規(guī)律；普洱生茶水提物貯藏8 a時最高，貯藏2 a時最低，分別為8.99%和7.81%?？Х葔A是茶葉中重要的滋味成分，在茶湯中呈現(xiàn)苦味，能與茶黃素締合形成具有鮮爽味的復(fù)合物[18]；咖啡堿對普洱茶品質(zhì)有一定的影響，Liang Yuerong等[21]研究表明，咖啡堿、茶多酚、香葉醇、芳樟醇氧化物等能評價普洱茶品質(zhì)?？Х葔A在普洱生茶貯藏過程中無明顯的變化規(guī)律，一方面可能是因?yàn)榧谆D(zhuǎn)移或被微生物分解利用的結(jié)果；另一方面貯藏過程中微生物大量繁殖，可能促進(jìn)了咖啡堿的合成[22]，因此其含量出現(xiàn)波動，無明顯規(guī)律。

2.2.5 游離氨基酸含量

由圖5可知，隨著貯藏時間的延長，普洱生茶水提物的游離氨基酸含量呈下降趨勢；表現(xiàn)為貯藏1 a時最高，含量為5.46%，貯藏10 a時最低，含量為2.26%，降幅為58.61%；不同貯藏時間的樣品，游離氨基酸含量存在顯著差異，游離氨基酸含量在貯藏2 a時，即表現(xiàn)顯著下降。茶氨酸是游離氨基酸中含量最高的，約占游離氨基酸的70%，呈鮮味和甜味，同時能抑制茶湯的苦澀味；由于谷氨酸、脯氨酸等的協(xié)同增效作用，使茶氨酸對普洱生茶的鮮味貢獻(xiàn)度更大[23]。貯藏過程中氨基酸含量下降，氨基酸組成也發(fā)生改變，導(dǎo)致普洱生茶在香氣和滋味上均發(fā)生改變。普洱生茶中游離氨基酸含量隨著貯藏時間的延長呈下降趨勢[9]，與可溶性蛋白的分解、氨基酸自身的氧化降解以及與其他物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)生成不溶性物質(zhì)等有關(guān)[24]。

圖5 不同貯藏時間普洱生茶提取物的游離氨基酸含量Fig. 5 Amino acid contents of aqueous extracts of raw Pu-erh tea with different storage times

不同貯藏時間普洱生茶水提物的部分生化成分存在顯著或極顯著的差異，隨著貯藏時間的延長，茶多酚、兒茶素和氨基酸呈下降趨勢；黃酮呈上升趨勢；咖啡堿和總糖無明顯變化規(guī)律。茶葉中這6 類生化成分組成復(fù)雜，如兒茶素類物質(zhì)由表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素（epigallocatechin，EGC）、沒食子兒茶素（gallocatechin，GC）、兒茶素和表兒茶素（epicatechin，EC）等組成；游離氨基酸由茶氨酸（Thea）、精氨酸（Arg）、苯丙氨酸（Phe）、丙氨酸（Ala）、纈氨酸（Val）、亮氨酸（Leu）和異亮氨酸（Ile）等組成，且上述測定中有5 類生化成分均為復(fù)合物總量，因此無法根據(jù)結(jié)果推測和篩選出普洱生茶水提物年份差異的特征性物質(zhì)。由此提出在明確6 類生化成分變化規(guī)律的基礎(chǔ)上，采用UPLC-MS/MS進(jìn)一步測定不同貯藏時間普洱生茶水提物的生化成分，以期評價和篩選出其特征性成分。

2.3 不同貯藏時間普洱生茶水提物UPLC-MS/MS檢測分析

本實(shí)驗(yàn)以不同貯藏時間的普洱生茶水提物為原料，采用UPLC-MS/MS測定普洱生茶水提物的生化成分，并通過文獻(xiàn)報道和數(shù)據(jù)分析（PCA和CA）綜合評價和篩選出不同貯藏時間普洱生茶水提物的特征性成分。

2.3.1 UPLC-MS/MS檢測結(jié)果

表3 不同貯藏時間普洱生茶提取物UPLC-MS/MS檢測成分相對含量Table3 The relative contents of components of raw Pu-erh tea extract with different storage times analyzed by UPLC-MS/MMSS %

續(xù)表3 %

不同貯藏時間普洱生茶水提物經(jīng)UPLC-MS/MS分析得到107 種物質(zhì)見表3。被檢測到的物質(zhì)共分為8 大類：有機(jī)酸類化合物（5 種）、非黃酮類酚酸化合物（16 種）、沒食子酰基葡萄糖類化合物（10 種）、羥基桂皮奎寧酯類化合物（11 種）、黃烷醇類化合物（19 種，其中兒茶素類9 種、兒茶素苷類3 種、花青素類2 種、茶黃素類5 種）、黃酮苷類化合物（20 種，其中山柰酚類6 種、槲皮素苷類10 種、楊梅酮苷類4 種）、氨基酸類化合物（23 種）、生物堿（3 種）。

由表3可知，被檢出物質(zhì)中相對含量較高的物質(zhì)：機(jī)酸類（檸檬酸）、非黃酮類酚酸類（沒食子酸（gallic acid，GA））、羥基桂皮奎寧酯類（沒食子?；鼘幩?、香豆酰奎寧酸和咖啡?？鼘幩幔?、兒茶素類（GC、EGC、兒茶素和EC）、氨基酸類（Phe和Thea）、生物堿類（咖啡堿）。

隨著貯藏時間的延長相對含量呈增加趨勢的化合物：非黃酮類酚酸類（順、反式單咖啡酰酒石酸酯、GA和丁香酸）、羥基桂皮奎寧酯類（X-氧基-香豆酰奎寧酸）、兒茶素苷類（表阿夫兒茶精-3-氧基-沒食子酸酯）、山柰酚類（山柰酚-3-氧基-鼠李糖半乳糖苷、山柰酚-3-氧基-蕓香糖苷、山柰酚-3-氧基-半乳糖苷和山柰酚-3-氧基-葡萄糖苷）、槲皮素苷類（槲皮素-3-氧基-葡萄糖基鼠李糖半乳糖苷、槲皮素-3-氧基-葡萄糖基鼠李糖葡萄糖苷、槲皮素-3-氧基-鼠李糖半乳糖苷、槲皮素-3-氧基-蕓香糖苷、槲皮素-3-氧基-鼠李糖苷和異鼠李素-3-氧基-葡萄糖苷）、生物堿類（茶葉堿）。

隨著貯藏時間的延長相對含量呈降低趨勢的化合物：兒茶素苷類（沒食子兒茶素-3,3’-雙氧基-沒食子酸酯和表沒食子兒茶素-3,3’-雙氧基-沒食子酸酯）、氨基酸類（組氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和S-甲基蛋氨酸）、生物堿類（可可堿）。

僅在部分貯藏時間檢測到的化合物：非黃酮類酚酸類（單阿魏酰酒石酸酯、阿魏酸和芥子酸）、沒食子酰基葡萄糖類（三沒食子?；咸烟牵⒉椟S素類（茶黃素、茶黃素-3-沒食子酸酯、茶黃素-3,3’-雙沒食子酸酯和茶黃素-3’-沒食子酸酯）、槲皮素苷類（槲皮素-3-氧基-葡萄糖苷酸）。

2.3.2 PCA篩選特征成分

表4 主成分的特征值和方差貢獻(xiàn)率Table4 Eigenvalue and variance contribution rates of principal components

不同貯藏時間普洱生茶水提物經(jīng)UPLC-MS/MS檢測得出的化合物較多（107 種），故采用PCA便于篩選出與貯藏時間相關(guān)的特征性成分。PCA是一種多元數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法，能在保持原有數(shù)據(jù)主要信息條件下，以更少的變量代替原有變量，起到降低分析難度和降維的作用[25]。以10 個年份UPLC-MS/MS檢測得到的107 種成分構(gòu)成的10×107矩陣進(jìn)行PCA，如表4所示。前4 個主成分的累積貢獻(xiàn)率達(dá)86.52%，表明前4 個主成分可以基本反映全部成分變量的信息[26]。前4 個主成分的特征值依次為40.12、33.16、11.84、7.46。其中PC1可解釋全部成分變量信息的37.49%；PC2可解釋30.99%；PC3可解釋11.06%；PC4可解釋6.97%。通過降維，將原來的107 個成分變量轉(zhuǎn)化為4 個新的變量指標(biāo)，降低了分析的復(fù)雜性，且基本保持了原有成分變量的信息。根據(jù)4 個主成分的特征向量，可以得到原各成分變量分別對4 主成分的貢獻(xiàn)率。

PC1中，各成分變量對其貢獻(xiàn)率較高的依次為X8、X9、X56、X44、X43、X4、X107、X47、X48、X45以及X46；PC2中，對其貢獻(xiàn)率較高的依次為X99、X100、X62、X63、X78、X96、X53、X52、X51、X41、X64、X65、X105、X92、X79、X80、X70、X71、X66以及X67；PC3中，對其貢獻(xiàn)率較高的依次為X106、X25、X26、X27、X28、X29、X83、X87、X37、X35、X36、X38、X14、X102、X103、X86、X18以及X6；PC4中，對其貢獻(xiàn)率較高的依次為X86、X13、X5、X19、X81、X18、X103、X102、X77、X36、X89、X2、X38、X12、X59、X61、X93以及X54。

綜上分析可知，不同貯藏時間普洱生茶水提物中貢獻(xiàn)性大且有較明顯變化規(guī)律的物質(zhì)有26 種，可作為不同貯藏時間普洱生茶水提物的特征性成分。這26 種化合物分別為有機(jī)酸類（檸檬酸）、非黃酮類酚酸（順式單咖啡酰酒石酸酯、反式單咖啡酰酒石酸酯和GA）、沒食子?；咸烟穷悾? 種X-氧基-雙沒食子?；咸烟牵?、兒茶素類（GC、EGC、兒茶素、EC和表阿夫兒茶精）、兒茶素苷類（沒食子兒茶素-3,3’-雙氧基-沒食子酸酯、表沒食子兒茶素-3,3’-雙氧基-沒食子酸酯和表阿夫兒茶精-3-氧基-沒食子酸酯）、氨基酸類（精氨酸、丙氨酸、纈氨酸、茶氨酸、異亮氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸）、生物堿類（可可堿和咖啡堿）。

2.3.3 CA結(jié)果

以10 個年份普洱生茶水提物經(jīng)UPLC-MS/MS檢測得到的107 種化合物相對含量為指標(biāo)，利用歐氏距離的平方為度量準(zhǔn)則，以組間連結(jié)法為組群合并準(zhǔn)則，對10 個年份普洱生茶水提物進(jìn)行系統(tǒng)CA，結(jié)果見圖6。當(dāng)橫坐標(biāo)距離為15時，可將10 個年份聚為3 類。貯藏8 a的為1 類；貯藏1 a和2 a的為1 類；剩余年份聚為1 類?？煽偨Y(jié)出，貯藏1～2 a的普洱生茶品質(zhì)接近；貯藏3 a時，生茶成分和品質(zhì)將發(fā)生一定的改變；貯藏時間為4～7 a的生茶成分和品質(zhì)接近，聚在一起；貯藏時間為9～10 a的生茶成分和品質(zhì)與之前貯藏時間的生茶有一定的差異，其聚在一起。由圖6可知，普洱生茶在貯藏的第3年和第8年生化成分和品質(zhì)都發(fā)生了較大的改變，且貯藏4～7 a和9～10 a都分別聚在一起，表明雖然貯藏時間的延長會導(dǎo)致普洱生茶品質(zhì)發(fā)生改變，但其品質(zhì)在一定貯藏時間范圍內(nèi)保持穩(wěn)定。普洱生茶是由曬青毛茶經(jīng)特殊工藝加工而成，在貯藏的過程中，其香氣CA、滋味等都發(fā)生了變化，隨著貯藏時間的延長，普洱生茶品質(zhì)得到提升[17]。通過CA，能較好地將不同貯藏時間的普洱生茶水提物樣進(jìn)行分類，可考慮擴(kuò)大普洱生茶貯藏時間，獲得貯藏時間更長的普洱生茶年份分類基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為普洱生茶貯藏時間的鑒定提供理論依據(jù)。

圖6 不同貯藏時間普洱生茶的聚類樹狀圖Fig. 6 Dendrogram for cluster analysis of raw Pu-erh tea with different storage times

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)以同公司、同批號、不同貯藏時間的普洱生茶為原料，經(jīng)測定分析得以下結(jié)論：貯藏過程中，普洱生茶的含水量變化不大，表明普洱生茶貯藏得當(dāng)，吸濕不明顯。隨著貯藏時間的延長，茶多酚、兒茶素和游離氨基酸的含量呈下降趨勢；黃酮的含量呈增加趨勢；可溶性總糖和咖啡堿無明顯變化規(guī)律。由于6 類成分包含物質(zhì)多，因此不能評價和篩選出不同貯藏時間普洱生茶水提物的特征性成分。普洱生茶水提物經(jīng)UPLC-MS/MS檢測，共檢出107 種物質(zhì)；通過PCA得出不同貯藏時間普洱生茶水提物的特征性成分26 種，包括檸檬酸、順式單咖啡酰酒石酸酯、反式單咖啡酰酒石酸酯、GA、5 種X-氧基-雙沒食子酰基葡萄糖、GC、EGC、兒茶素、EC、表阿夫兒茶精、沒食子兒茶素-3,3’-雙氧基-沒食子酸酯、表沒食子兒茶素-3,3’-雙氧基-沒食子酸酯、表阿夫兒茶精-3-氧基-沒食子酸酯、Arg、Ala、Val、Thea、Ile、Leu、Phe、可可堿和咖啡堿。

經(jīng)系統(tǒng)CA發(fā)現(xiàn)，不同貯藏時間的普洱生茶水提物樣能較好地被分類聚類；其中貯藏時間達(dá)到3 a或8 a時普洱生茶品質(zhì)將發(fā)生較為明顯的變化，表明貯藏時間雖會導(dǎo)致普洱生茶品質(zhì)發(fā)生改變，但在一定的貯藏時間范圍內(nèi)，其品質(zhì)相對穩(wěn)定。

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Characteristic Components of Aqueous Extracts of Raw Pu-erh Tea with Different Storage Times

ZENG Liang1,2,3, TIAN Xiaojun1, LUO Liyong1,3, GUAN Xingli2,4, GAO Linrui2,4,*
(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400716, China; 2. TAETEA Group, Kunming 650217, China; 3. Tea Research Institute, Southwest University, Chongqing 400716, China; 4. Yunnan Pu’er Tea Fermentation Engineering Research Center, Kunming 650217, China)

Aqueous extracts of raw Pu-erh tea (7542) samples from the same batch obtained from the same producer with different storage times were prepared by vacuum freeze drying in this study and their characteristic components were detected by spectrophotometry and ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS). The experimental data were analyzed with principal component analysis (PCA) and cluster analysis (CA) to establish the characteristic components of Pu-erh tea aqueous extracts and a dendrogram for cluster analysis of raw Pu-erh tea samples stored for different times. The results showed that the contents of tea polyphenols, catechins and free amino acid of raw Puerh tea aqueous extracts decreased gradually with storage time of Pu-erh tea while flavones increased; the contents of total soluble sugars and caffeine showed an irregular fluctuation. A total of 107 substances were detected from raw Puerh tea aqueous extracts with different storage times by UPLC-MS/MS. Using PCA, the 26 characteristic components of raw Pu-erh tea aqueous extracts were determined to include citric acid, gallic acid, epicatechin, theanine, caffeine, and epigallocatechin gallate. Cluster analysis results indicated that the clustering of raw Pu-erh tea samples changed significantly after storage for 3 years and 8 years and that aqueous extracts of raw Pu-erh tea samples with similar storage times were more likely to be clustered.

raw Pu-erh tea; ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS); characteristic components; multivariate statistical analysis

10.7506/spkx1002-6630-201702032

TS272.5

A

1002-6630（2017）02-0198-08

2016-04-21

大益博士后項(xiàng)目年份茶研究項(xiàng)目（DYBX004）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（XDJK2013B036）；特質(zhì)性農(nóng)產(chǎn)品營養(yǎng)組分識別與驗(yàn)證評估項(xiàng)目（GJFP201601501）

曾亮（1980—），女，副教授，博士，主要從事茶資源開發(fā)利用研究。E-mail：zengliangbaby@126.com

*通信作者：高林瑞（1968—），男，高級工程師，碩士，主要從事茶葉加工、微生物及代謝化學(xué)研究。E-mail：gaolinrui@126.com

曾亮, 田小軍, 羅理勇, 等. 不同貯藏時間普洱生茶水提物的特征性成分分析[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(2): 198-205. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201702032. http://www.spkx.net.cn

ZENG Liang, TIAN Xiaojun, LUO Liyong, et al. Characteristic components of aqueous extracts of raw Pu-erh tea with different storage times[J]. Food Science, 2017, 38(2): 198-205. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201702032. http://www.spkx.net.cn