4種玉米自交系幼胚遺傳再生體系的建立

楚海嬌++李闖+++關(guān)淑艷

摘要：選取4種玉米自交系H99、A188、7922和1322的幼胚作為外植體，接種于10種不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)愈傷組織并建立遺傳再生體系，同時(shí)探討了不同基因型、培養(yǎng)基種類(lèi)、幼胚大小、蔗糖濃度、激素濃度和配比對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率的影響。結(jié)果表明：基因型對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率高低影響顯著，4種基因型玉米幼胚在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中均產(chǎn)生了愈傷組織，但繼代培養(yǎng)后只有H99能誘導(dǎo)出胚性愈傷組織，誘導(dǎo)率為46.2%；對(duì)于不同基因型培養(yǎng)基誘導(dǎo)效果依次為N6>MB>MS；選擇幼胚長(zhǎng)度為1.5～2.0 mm、添加蔗糖濃度為30 g/L、2，4-D濃度為2.0 mg/L及AgNO3濃度為 10 mg/L 時(shí)玉米愈傷組織誘導(dǎo)率最高且質(zhì)量較好。

關(guān)鍵詞：玉米；再生體系；自交系；愈傷組織誘導(dǎo)率

中圖分類(lèi)號(hào)： S513.03文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2016）10-0066-03

收稿日期：2015-11-10

基金項(xiàng)目：吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院青年基金項(xiàng)目（編號(hào)：吉農(nóng)院合字[2013]第210號(hào)）。

作者簡(jiǎn)介：楚海嬌（1984—），女，吉林遼源人，碩士，助教，主要研究方向?yàn)橛衩走z傳轉(zhuǎn)化。E-mail：chuhaijiao1227@163.com。

通信作者：關(guān)淑艷，博士，副教授，主要從事生物技術(shù)在作物遺傳育種中的應(yīng)用研究。E-mail：fengrongl@163.com。我國(guó)是世界玉米大國(guó)，玉米作為重要的糧、飼作物對(duì)我國(guó)經(jīng)濟(jì)發(fā)展和市場(chǎng)穩(wěn)定具有舉足輕重的作用[1]。可以通過(guò)基因工程手段改良玉米的品種和農(nóng)藝性狀，而建立高效的體細(xì)胞再生體系是遺傳轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵。玉米優(yōu)良基因型遺傳再生體系的建立一直是人們研究的熱點(diǎn)[2]。玉米首次誘導(dǎo)出愈傷組織是Larue在1949年用甜玉米的胚作為外植體，但未獲得再生植株。直到1975年，Green等用A188的未成熟胚作外植體，誘導(dǎo)出二倍體愈傷組織，并獲得再生植株，從而得到了第1株無(wú)性系植株[3]。目前，已能從多種外植體中誘導(dǎo)出愈傷組織，并再生植株。而以玉米幼胚為外植體進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)愈傷組織的效率高、再生能力強(qiáng)，可大大提高育種效率。玉米組織培養(yǎng)的影響因素較為復(fù)雜，一些優(yōu)良自交系的組織培養(yǎng)還存在一定困難。本試驗(yàn)設(shè)計(jì)了10種不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)4種優(yōu)良玉米自交系的愈傷組織進(jìn)行誘導(dǎo)，并再生植株，目的是探尋出這4種玉米自交系遺傳再生體系建立的條件，為建立高效的玉米轉(zhuǎn)基因受體系統(tǒng)奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

優(yōu)良玉米自交系H99、A188、7922和1322的幼胚。

1.2培養(yǎng)基

1.2.1誘導(dǎo)培養(yǎng)基本試驗(yàn)設(shè)計(jì)了10種基本培養(yǎng)基進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)研究（表1）。

1.2.2繼代培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)基添加2，4-D的濃度為 1 mg/L。

1.2.3分化培養(yǎng)基分化培養(yǎng)基添加IBA 0.8 mg/L和 6-BA 1.5 mg/L。

1.2.4生根培養(yǎng)基生根培養(yǎng)基添加NAA 1.5 mg/L和活性炭1.5 g/L。

1.3方法

1.3.1玉米幼胚的剝離在超凈工作臺(tái)上對(duì)授粉13 d左右的幼胚進(jìn)行消毒，沖洗。挑取不同大小的幼胚接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每皿接種30個(gè)幼胚，25 ℃避光條件下培養(yǎng)15 d左右（其中經(jīng)過(guò)2次去芽處理），產(chǎn)生Ⅰ型初始愈傷組織。篩選出淡黃色、顆粒狀、表面干燥的愈傷組織進(jìn)行繼代培養(yǎng)、分化培養(yǎng)、生根培養(yǎng)及移栽。

1.3.2愈傷組織誘導(dǎo)率的計(jì)算公式如下：

愈傷組織誘導(dǎo)率=愈傷組織塊數(shù)/接種幼胚數(shù)×100%；

胚性愈傷組織誘導(dǎo)率=胚性愈傷組織塊數(shù)/接種幼胚數(shù)×100%。

2結(jié)果與分析

4種基因型玉米幼胚在最適培養(yǎng)基中均能產(chǎn)生初始愈傷組織。繼代培養(yǎng)后，自交系H99形成了松脆、淡黃色顆粒狀的Ⅱ型愈傷組織；自交系A(chǔ)188和7922的愈傷組織多為乳白色、硬殼狀，不易繼代；1322產(chǎn)生的愈傷組織結(jié)構(gòu)松軟、黏稠狀，繼代后易褐變，后兩者為非胚性愈傷組織。

2.1基因型對(duì)誘導(dǎo)率的影響

基因型不同，愈傷誘導(dǎo)率存在差異[4]。繼代2～3次后，統(tǒng)計(jì)胚性愈傷組織誘導(dǎo)率。其中H99的誘導(dǎo)率最高，達(dá)462%，最低為A188，只有10.0%。隨著繼代次數(shù)的增加，只有H99能保持良好的生長(zhǎng)狀態(tài)，形成結(jié)構(gòu)松散的Ⅱ型愈傷組織；A188和7922逐漸褐化死亡；1322在繼代后多出現(xiàn)松軟黏稠狀的愈傷組織，誘導(dǎo)率下降（表2）。說(shuō)明繼代中愈傷組織的生長(zhǎng)對(duì)基因型的依賴(lài)性很強(qiáng)。

2.2培養(yǎng)基對(duì)誘導(dǎo)率的影響

分別采用3種基本培養(yǎng)基對(duì)玉米幼胚進(jìn)行誘導(dǎo)，從表3中可以看出，采用不同的培養(yǎng)基，誘導(dǎo)情況差異顯著。使用N6培養(yǎng)基，4種基因型的誘導(dǎo)率均較高。但H99和1322在N6培養(yǎng)基中出愈率最高，分別為46.2%和26.7%；對(duì)于A188而言，最適培養(yǎng)基為MB；對(duì)于7922來(lái)說(shuō)，N6和MB培養(yǎng)基均可誘導(dǎo)出愈傷組織，但胚性均不高；4種基因型在MS培養(yǎng)基中均誘導(dǎo)不出胚性愈傷組織。

2.3幼胚長(zhǎng)度對(duì)誘導(dǎo)率的影響

有研究證明，基因型相同時(shí)幼胚大小對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率有影響[5]。本試驗(yàn)挑取基因型H99和A188不同長(zhǎng)度幼胚進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)發(fā)現(xiàn)：幼胚長(zhǎng)度為2.0 mm時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率最高，且生長(zhǎng)良好；當(dāng)幼胚長(zhǎng)度小于1.5 mm時(shí)，愈傷生長(zhǎng)緩慢，誘導(dǎo)率呈下降趨勢(shì)；當(dāng)幼胚長(zhǎng)度大于 2.0 mm 時(shí)，幼胚根芽分化現(xiàn)象比較嚴(yán)重，用鑷子將根芽夾去，可以提高幼胚出愈率（表4）。因此認(rèn)為，幼胚長(zhǎng)度為1.5～2.0 mm時(shí)較適宜接種。

2.4蔗糖濃度對(duì)誘導(dǎo)率的影響

在植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基中，需要碳源為植物組織提供能量，實(shí)驗(yàn)室多采用蔗糖作為碳源物質(zhì)。因?yàn)檎崽悄芨玫卣{(diào)節(jié)培養(yǎng)基內(nèi)的滲透壓，同時(shí)在一定程度上能減少微生物的污染。

本試驗(yàn)選用4種蔗糖濃度梯度對(duì)基因型H99和A188進(jìn)行誘導(dǎo)。由表5可見(jiàn)，蔗糖濃度為30 g/L時(shí)玉米愈傷組織和胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率都較高。蔗糖濃度增大，愈傷組織逐漸變成白色而死亡；蔗糖濃度越小，愈傷組織由于滲透壓過(guò)低會(huì)出現(xiàn)水漬化狀態(tài)，胚性愈傷率降低。

2.5不同激素濃度及配比對(duì)誘導(dǎo)率的影響

激素的選擇影響愈傷組織的生成[6]。本試驗(yàn)研究了生長(zhǎng)素2，4-D、細(xì)胞分裂素6-BA和AgNO3的不同濃度、不同配比對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響。

生長(zhǎng)素是愈傷組織生長(zhǎng)的必需激素，2，4-D能誘發(fā)細(xì)胞分裂活性，引起細(xì)胞脫分化和無(wú)序增殖，產(chǎn)生愈傷組織，2，4-D濃度會(huì)影響愈傷組織的生長(zhǎng)狀態(tài)。由表6可以看出，H99和1322在N65中誘導(dǎo)率最高，且生長(zhǎng)狀態(tài)最好，認(rèn)為2，4-D濃度為2 mg/L時(shí)較適宜；品種7922的最適2，4-D濃度為 1 mg/L；而A188的最適2，4-D濃度為3 mg/L。黃璐等研究認(rèn)為，2，4-D濃度過(guò)大對(duì)愈傷組織有傷害作用，在組培過(guò)程中會(huì)增加無(wú)性系變異[7]。而2，4-D濃度過(guò)低會(huì)導(dǎo)致愈傷組織生長(zhǎng)緩慢或者死亡。

誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加AgNO3可以提高胚性愈傷誘導(dǎo)率和植株再生率。1988年，Songstad研究發(fā)現(xiàn)向N6或MS培養(yǎng)基中添加AgNO3，可提高Ⅱ型愈傷組織的誘導(dǎo)率及植株再生率[8]。由表6可以看出，H99、7922和1322在N65培養(yǎng)基中的胚性誘導(dǎo)率均較高，說(shuō)明誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加AgNO3能夠提高胚性誘導(dǎo)率；而在N66培養(yǎng)基中，H99和1322誘導(dǎo)率明顯降低，說(shuō)明添加10 mg/L AgNO3+0.5 mg/L 6-BA的配比對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)沒(méi)有促進(jìn)作用。

2.6愈傷組織的繼代培養(yǎng)

繼代培養(yǎng)過(guò)程中，非胚性愈傷組織并不能長(zhǎng)期繼代生長(zhǎng)。研究發(fā)現(xiàn)，基因型A188和7922在繼代過(guò)程中色澤逐漸變暗，停止生長(zhǎng)；基因型1322繼代培養(yǎng)一段時(shí)間后呈愈傷黏稠狀組織并逐漸褐化死亡，這可能受到基因型限制或者所用培養(yǎng)基及激素濃度配比使用不當(dāng)造成。而H99在繼代中大部分生長(zhǎng)良好。通過(guò)繼續(xù)培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，添加1.0 mg/L的2，4-D有利于愈傷組織保持其胚性。

3結(jié)論與討論

本試驗(yàn)以?xún)?yōu)良玉米自交系H99、A188、7922和1322在授粉10～15 d的幼胚作為受體材料，在最適誘導(dǎo)條件下誘導(dǎo)胚性愈傷組織，并再生成完整植株。同時(shí)對(duì)以幼胚為外植體誘導(dǎo)愈傷組織的幾個(gè)重要影響因素進(jìn)行研究，得出以下結(jié)論：初步誘導(dǎo)時(shí)，4種基因型玉米幼胚在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中均產(chǎn)生了愈傷組織；繼代培養(yǎng)后，只有H99產(chǎn)生了淡黃色、顆粒狀并且生長(zhǎng)迅速的Ⅱ型胚性愈傷組織，另外3種玉米基因型沒(méi)有誘導(dǎo)出胚性愈傷組織。

雖然玉米愈傷組織誘導(dǎo)具有普遍性，但是誘導(dǎo)率受多種因素影響，如基因型、培養(yǎng)基成分、激素濃度、幼胚大小以及人為因素等[9-10]。誘導(dǎo)過(guò)程中基因型對(duì)愈傷組織的質(zhì)量和出愈率有較大影響[11]，本試驗(yàn)的4種玉米自交系中，H99的誘導(dǎo)率最高，為46.2%，其次是1322和7922，A188最低，為10%。因此，在進(jìn)行玉米幼胚遺傳再生體系建立時(shí)，選擇易于培養(yǎng)的材料是至關(guān)重要的[12]。

對(duì)于不同基因型愈傷組織的誘導(dǎo)，要選擇適宜培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，本試驗(yàn)采用3種基本培養(yǎng)基的誘導(dǎo)效果依次為N6>MB>MS。對(duì)于一些玉米基因型，雖然愈傷初始誘導(dǎo)率較高，但在長(zhǎng)期繼代培養(yǎng)過(guò)程中胚性很難保持，使得植株再生率降低，原因可能與繼代培養(yǎng)基不適宜或者人為操作不當(dāng)有關(guān)，對(duì)此還需要進(jìn)一步研究。同時(shí)也充分說(shuō)明植株再生率與出愈率之間沒(méi)有相關(guān)性，這與孫紅煒等在影響玉米愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生的有關(guān)因素中的研究[13]相符。

本研究未涉及光照、溫度等培養(yǎng)條件對(duì)玉米幼胚誘導(dǎo)的影響[14]，并且對(duì)于繼代、分化和生根培養(yǎng)基未進(jìn)行優(yōu)化研究。因此本研究結(jié)果是否具有廣泛適用性，還需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

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