解磷微生物研究進展

林 英，司春燦，韓文華，韓 柱

(景德鎮(zhèn)學院 生物與化學工程系,江西 景德鎮(zhèn) 333000)

解磷微生物研究進展

林 英，司春燦，韓文華，韓 柱

(景德鎮(zhèn)學院 生物與化學工程系,江西 景德鎮(zhèn) 333000)

綜述了解磷微生物的生態(tài)分布和種類、溶磷機制、在農(nóng)業(yè)上的應用及存在的問題和解決途徑，以期為解磷菌的進一步研究和應用提供參考。

解磷微生物；微生物肥料；解磷機制；研究進展

磷元素是繼氮元素之后對植物生長發(fā)育第二重要的元素[1]。然而統(tǒng)計資料表明，全球有40% 的耕地存在磷缺乏的現(xiàn)象[2]，其重要原因是由于固定化作用，土壤中的磷主要是以難溶性的化合物存在，絕大部分不能被植物直接吸收利用，僅有0.1% 的磷能被植物直接吸收利用[3]。磷肥的施用，雖然在一定程度上能緩解磷的不足，但磷肥中75%～90%的磷都會很快被吸附到土壤顆粒表面或與土壤中的金屬離子(Fe、Al、Ca等)結合生成難溶性的磷酸鹽[4]。因此即使大量施用化學磷肥，也不能完全解決土壤磷素缺乏這一問題。

自1903年研究發(fā)現(xiàn)土壤中存在某些解磷微生物能將水不溶性磷轉化成水可溶性磷，提高作物對土壤中的磷的利用率之后[5]，越來越多的科學工作者就解磷微生物開展了深入的研究。本文就解磷微生物的生態(tài)分布和種類、解磷微生物的溶磷機制、解磷微生物在農(nóng)業(yè)上的應用及存在的問題等作一綜述，以期為解磷菌的進一步研究和應用提供參考。

1 解磷微生物的生態(tài)分布和種類

研究發(fā)現(xiàn)，自然界如各種土壤、植物體表、堆肥甚至是水生環(huán)境中都有大量的解磷微生物存在[6-7]，其中土壤又是最主要的解磷微生物來源。解磷菌在土壤中的數(shù)量及生態(tài)分布，又受土壤物理性質、有機質含量、土壤溫度等因素的影響。研究結果表明，根土表面解磷微生物數(shù)量>根際土解磷微生物數(shù)量>本體土解磷微生物數(shù)量[8]。

具有解磷能力的微生物種類繁多，包括細菌、真菌、放線菌以及藍藻，其中具有解磷能力的細菌數(shù)量占土壤中總微生物數(shù)量的1%到50%，具有解磷能力的放線菌數(shù)量占土壤中總微生物數(shù)量的10%～50%，而具有解磷能力的真菌數(shù)量僅占土壤中總微生物數(shù)量的0.1%～0.5%[9]。盡管土壤中解磷細菌的數(shù)量遠遠超過了解磷真菌的數(shù)量(為真菌數(shù)量的2～150倍)，但是一般來說，解磷真菌比解磷細菌具有更強、更持久、更穩(wěn)定的解磷能力[10]。大多數(shù)解磷細菌經(jīng)過幾次傳代培養(yǎng)后，解磷能力會逐步散失，而解磷真菌一般不易喪失解磷功能[11]。

據(jù)報道，常見的解磷細菌有芽孢桿菌(Bacillus)、假單胞菌(Pseudomonas)、固氮菌(Azotobacter)、洋蔥伯克霍爾德菌(Burkholderia)、根瘤菌(Rhizobium)、慢生根瘤菌(Bradyrhizobium)[12]。常見的解磷真菌有曲霉屬(Aspergillus)和青霉(Penicillium)[13]。常見的解磷放線菌有鏈霉菌(Streptomyces)、小單孢菌(Micromonospora)[14]。藍細菌雖然最為常見的功能是固氮功能，但最近研究發(fā)現(xiàn)有的藍細菌也具有解磷功能，如繁育擬惠氏藍細菌(Westiellopsisprolifica)和魚腥藻(Anabaena)等[15-17]。

這些種類繁多的溶磷微生物，有的能分解和轉化無機磷化合物，有的能礦化有機磷化合物，還有的既可以分解有機磷化合物，也可以分解無機磷化合物[18-19]。

2 解磷微生物的解磷機理

2.1 解磷菌溶解無機磷的機理

2.1.1 產(chǎn)生有機酸 有機酸理論認為，解磷菌能通過細胞色素膜外表面的直接氧化途徑或通過氧化呼吸產(chǎn)生有機酸。這些有機酸既能將磷酸鈣、磷酸鋁、磷酸鐵等難溶態(tài)磷酸鹽在酸性條件下溶解，又能螯合鐵、鋁、鈣等金屬離子，從而將與之結合的磷酸根釋放出來，增加土壤中可溶性磷的含量，促進作物對磷的吸收[20]。有機酸理論被認為是目前解磷菌解磷機理中最為普遍，也是最被廣泛接受的一個機理[21]。

不同的溶磷微生物產(chǎn)生的有機酸不一樣。解磷細菌產(chǎn)生的常見的有機酸有：葡萄糖酸、乳酸、蘋果酸等[22]，其中葡萄糖酸被認為是解磷細菌產(chǎn)生的最為常見的有機酸[23]。解磷真菌產(chǎn)生的有機酸相對于解磷細菌來說種類更多，常見的有：丁二酸、檸檬酸、α-酮基-D-葡萄糖酸、葡萄糖、草酸等，這也是真菌比細菌具有更強解磷能力的原因之一[1]。溶磷放線菌產(chǎn)生的常見的具有溶磷效果的有機酸有：檸檬酸、蘋果酸、琥珀酸、乳酸等[24,25]。而Yandigeri等[26]則發(fā)現(xiàn)藍細菌(Westiellopsisprolifica)和魚腥藻(Anabaena)具有溶磷作用是由于其產(chǎn)生了鄰苯二甲酸。同一微生物在不同的培養(yǎng)基條件下，產(chǎn)生的有機酸也不一樣，如Reyes 等[27]發(fā)現(xiàn)，皺褶青霉(Penicilliumrugulosum)在以葡萄糖為碳源的情況下，只有檸檬酸產(chǎn)生，而以蔗糖為碳源的條件下，則能產(chǎn)生檸檬酸和葡萄糖酸。

2.1.2 產(chǎn)生無機酸和H2S 一些化能自養(yǎng)微生物能產(chǎn)生H2SO4、HNO3等無機酸或H2S，將PO43-轉化成H2PO4-或HPO42-，促進植物對磷的吸收[22,28]。Azam等[29]發(fā)現(xiàn)亞硝酸菌屬(Nitrosomonas) 和硫桿菌(Thiobacillus)能產(chǎn)生硝酸和硫酸溶解磷化合物。Swaby等[30]發(fā)現(xiàn)解磷微生物能產(chǎn)生H2S，產(chǎn)生的H2S與磷酸鐵反應后產(chǎn)生硫酸亞鐵，同時釋放出磷。但無機酸的溶磷能力要明顯低于有機酸[31]。

2.1.3 微生物的固持作用 庫理論(sink theory)認為，解磷微生物通過同化作用，可將一些難溶性的磷化合物間接溶解掉，從而大量吸收土壤或培養(yǎng)基中的磷，并將其保存于其細胞和組織中[32,22]。

2.1.4 胞外多糖的介導作用 微生物分泌的胞外多糖，因其分子結構中含有大量具有絡合重金屬離子的陰離子官能團，可以對土壤中Ca 、Mg、Fe、Al 等元素進行螯合，從而使土壤中可固定磷酸根的陽離子減少，增加土壤磷酸根離子的活性[33]。如Yi等[34]發(fā)現(xiàn)能產(chǎn)生胞外多糖的解磷細菌比不能產(chǎn)生胞外多糖的細菌具有更強的解磷能力，并且研究還發(fā)現(xiàn)將3株解磷細菌的胞外多糖單獨添加到培養(yǎng)基中都沒有使難溶性的磷酸鈣釋放出磷，而添加了胞外多糖和有機酸的培養(yǎng)基中磷的含量明顯高于僅單獨添加有機酸的培養(yǎng)基中磷的含量。該研究認為解磷細菌分泌的胞外多糖是促進磷有效化的重要因子，它協(xié)同有機酸促進了難溶性磷的溶解。

2.1.5 通過NH4+的同化作用或呼吸作用釋放出質子 NH4+的同化過程或微生物自身呼吸作用的過程可以釋放出質子氫[35-36]。Illmer等[36]通過‘Ecologene’裝置，將解磷真菌青霉(Penicilliumaurantiogriseum)和解磷細菌假單胞菌(Pseudomonas)與難溶性的磷酸鹽在沒有直接接觸，僅依靠解磷菌的代謝產(chǎn)物在遠距離、大范圍擴散的情況下進行實驗，發(fā)現(xiàn)這2株解磷菌都沒有產(chǎn)生有機酸，但溶液中pH明顯下降，且對羥基磷灰石和磷酸氫鈣具有很好的溶解作用。由此推測這2株解磷菌的解磷機制不是依靠產(chǎn)生有機酸，溶液中質子氫的來源也不是依靠細胞膜上的質子泵，而是來源于NH4+的同化作用或呼吸作用，質子氫的產(chǎn)生提高了難溶性磷酸鹽的溶度積，促進了磷酸鹽的溶解。

2.2 解磷菌溶解有機磷的機理

一般而言，解磷微生物主要是通過分泌水解酶促使有機磷的溶解。這些水解酶常見的有磷酸酶、植酸酶、C-P裂解酶等。其中磷酸酶在解磷真菌、細菌中都非常常見，它主要是通過脫磷酸作用，將磷酸酯中的磷酸基團去除，并生成磷酸根離子[37]。磷酸酶又包括酸性磷酸酶和堿性磷酸酶，這兩種磷酸酶的產(chǎn)生主要取決于外界環(huán)境。酸性磷酸酶在酸性土壤中較多，而在中性或堿性土壤中則堿性磷酸酶較為常見[38]。植酸酶可對土壤中最主要的有機磷來源植酸進行水解。C-P裂解酶主要是對有機磷酸鹽中的C-P鍵進行裂解，從而將有機磷變成可溶性的磷[39]。

2.3 解磷微生物的分子生物學機制

目前關于解磷微生物溶磷分子生物學機制的研究，在無機磷方面主要集中在與微生物產(chǎn)酸相關基因的克隆和表達，而在有機磷方面則主要集中在微生物與分泌水解酶相關基因的克隆和表達。

2.3.1 解磷微生物產(chǎn)酸有關基因的克隆和表達 葡萄糖直接氧化產(chǎn)生葡萄糖酸被認為是解磷細菌能溶解有機磷的一個主要機制，而葡萄糖酸的合成是由葡萄糖脫氫酶(GDH)和協(xié)同因子吡咯喹啉奎寧(PQQ)共同作用完成的。Goldstein等[40]于1987年首次從草生歐文氏菌 (Erwiniaherbicola) 中篩選分離并克隆了吡咯奎啉醌合成基因 (pqqE)，該基因能編碼 GDH 途徑中葡萄糖脫氫還原酶的輔酶，在細菌利用葡萄糖并產(chǎn)酸的過程中起關鍵作用。Kim等[41]從水生拉恩氏菌(Rahnellaaquatilis) 中也克隆到了吡咯奎啉醌合成基因(pqqE)。Babu-Khan等[42]則從洋蔥假單胞菌(Pseudomonascepacia)中分離克隆到了與葡萄糖酸合成相關的另一類基因gabY。比對結果發(fā)現(xiàn)該基因與pqqE并無相似性，而是與細胞膜上的組氨酸通透酶系統(tǒng)中的膜結合蛋白具有高度相似性。該基因被認為在調控和表達氧化途徑過程中發(fā)揮了重要作用，因此gabY基因在水生拉恩氏菌(Rahnellaaquatilis)體內(nèi)可作為溶磷基因。

2.3.2 解磷微生物水解酶相關基因的克隆和表達 磷酸酶雖然在解磷微生物中比較常見，但其酶的活性受復雜的調控機制所控制，通常只有在特殊的環(huán)境下才能觀察到。因此即使是在研究的比較全面的大腸桿菌和沙門氏菌中，也只有一部分基因被克隆、測序。目前已經(jīng)從不同的細菌中克隆出了14種非專一性的磷酸酶基因，通過序列分析和其他性狀比較，將這些非專一性的磷酸酶基因劃分為了A、B、C 3個不同的基因家族[43]。這些不同的家族基因有的已經(jīng)被成功地克隆和表達，如Fraga等[43]將摩氏摩根菌(Morganellamorganii) 的家族B基因napA轉移到洋蔥伯克霍爾德(BurkholderiacepaciaIS-16)菌中，發(fā)現(xiàn)重組菌株的胞外磷酸酶活性明顯增加。De Lorenzo等[44]將摩氏摩根菌(Morganellamorganii) 的家族A基因phoC轉移到固氮菌屬(Azospirillum)中也明顯提高了磷酸酶活性。

植酸酶基因在枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、大腸桿菌等各種細菌以及真菌解磷菌中都被成功克隆，并且研究結果還表明將這些解磷菌的植酸酶基因導入植物體內(nèi)能促進植物生長。如Richardson等[45]將黑曲霉(Aspergillusniger)中的植酸酶基因phyA成功導入施加植酸的擬南芥后，明顯提高了擬南芥植物體內(nèi)磷的含量并促進了擬南芥的生長。Idriss等[46]則發(fā)現(xiàn)將含有phyA基因的芽孢桿菌的發(fā)酵液以及phyA基因被破壞的突變體的發(fā)酵液分別接種到玉米后，與對照組相比，突變體的發(fā)酵液不能促進玉米的生長。除磷酸酶、植酸酶外，酸性己糖酶以及C-P裂解酶的一系列基因也被成功克隆[47]。

3 解磷微生物在農(nóng)業(yè)上的應用

盡管在1903年科學研究者就發(fā)現(xiàn)植物根際中存在解磷菌，但將解磷微生物開發(fā)成微生物肥料用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)要追溯到20世紀60年代。1958年俄羅斯首次將具有解磷能力的巨大芽孢桿菌(Bacillusmegatheriumvar.phosphaticum)制成的微生物肥料投入了大規(guī)模的約1000萬hm2的大田種植中，使得大田作物增產(chǎn)了10%～70%。在隨后的幾十年中，雖然有越來越多的科學工作者一直在關注和致力于解磷微生物的研究，但直到1990年，位于加拿大西部的Philombios公司第一次將青霉菌(Penicilliumbilaii)開發(fā)成了解磷微生物肥料，并在加拿大成功注冊，投入了商業(yè)化生產(chǎn)[48]。

隨著研究的進一步深入，科學工作者發(fā)現(xiàn)解磷微生物除了具有溶磷作用，能將土壤中難溶性的磷轉化成可溶性的磷，改善土壤結構，提高植物對磷的利用外，不少解磷菌還具有固氮、產(chǎn)植物激素、產(chǎn)鐵載體、分泌抗生素等功能，從而能促進作物的生產(chǎn)、增加作物的產(chǎn)量、提高作物抗病害能力[28]。因此，解磷微生物在農(nóng)業(yè)上引起了更為廣泛的關注和應用，美國、澳大利亞、中國、印度等國家都陸續(xù)將解磷微生物開發(fā)成了解磷微生物肥料，并大范圍地用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，被用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實踐的解磷微生物肥料主要由芽孢桿菌(Bacillus)、假單胞菌(Pseudomonas)、曲霉(Aspergillus)、菌根真菌(Mycorrhiza)等菌種組成[48]。

目前從全球范圍來看，解磷微生物肥料的生產(chǎn)量僅次于固氮微生物肥料，占整個微生物肥料的15%。這些解磷微生物肥料的使用，能將土壤中50%～60%難溶性的磷分解成可溶性的磷[49]，大大減少了化學肥料的使用。并且這些解磷微生物肥料的開發(fā)已經(jīng)由單一菌株向復合菌株、由單功能向多功能方向發(fā)展，市場上出售的微生物磷肥也多為將固氮菌、解磷菌、解鉀菌等菌株菌群組合而成的復合微生物磷肥。

4 存在的問題及解決途徑

雖然將解磷微生物用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實踐已經(jīng)有了較長的時間，但是其應用效果并不是十分理想，甚至有的解磷菌在室內(nèi)平板條件下或小規(guī)模的盆栽實驗條件下表現(xiàn)了很明顯的解磷或促生長效果，但在實踐大規(guī)模的大田應用中幾乎沒有表現(xiàn)出或表現(xiàn)出的效果很微弱。其可能的原因有：(1)解磷微生物肥料接種于大田后，受諸多因素的影響如缺乏與當?shù)匚⑸飶娪辛Φ母偁幠芰Α⑷狈^好的腐生能力，受土壤溫度、土壤濕度、土壤pH、土壤孔隙度等影響，不能在植物根部很好地定殖和擴繁，這是影響解磷微生物不能發(fā)揮解磷效果的重要因素之一。(2)由于不能持續(xù)地獲得營養(yǎng)，工業(yè)化生產(chǎn)出的解磷微生物肥料也和其他微生物肥料一樣存在不能長時間貯存、有效期短、活菌數(shù)量在短時間內(nèi)大幅度減少等問題。這也限制了解磷微生物肥料在農(nóng)業(yè)上有效作用的發(fā)揮。(3)外界氣候條件的隨時變化，也會導致土壤的地球化學物質的循環(huán)、植物與微生物的相互作用、微生物的群落結構、解磷微生物的解磷活性等發(fā)生改變，這些都會影響解磷微生物肥料在農(nóng)業(yè)上的應用。

針對以上問題，可以采取以下相關措施：(1)在施用解磷微生物之前，對被施用土壤中微生物的種類、數(shù)量以及土壤的理化性質等進行調研，根據(jù)調研結果，施用最適合當?shù)赝寥赖慕饬孜⑸锞鷦?2)根據(jù)不同的微生物菌劑，有針對性地開發(fā)出合適的載體，如采用堆肥、無土基質甚至是納米材料作為解磷微生物的載體從而延長其有效期。(3)利用分子工程技術，構建高效、穩(wěn)定、抗逆性強的解磷工程菌株。

總的來看，要解決解磷微生物肥料在農(nóng)業(yè)上的應用問題，要求在以后的工作中，將農(nóng)業(yè)生產(chǎn)技術、微生物發(fā)酵技術、納米生物材料技術、基因工程技術等很好地融合在一起，將科研與生產(chǎn)有機結合，規(guī)范化地生產(chǎn)出高效、穩(wěn)定、有效期長、抗逆性強的解磷微生物肥料，使得解磷微生物能更好地為農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展服務。

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(責任編輯：許晶晶)

Research Progress in Phosphate-solubilizing Microorganisms

LIN Ying, SI Chun-can, HAN Wen-hua, HAN Zhu

(Department of Biological and Chemical Engineering, Jingdezhen University, Jingdezhen 333000, China)

The author summarized the ecological distribution, species, and phosphate-solubilizing mechanism of phosphate-solubilizing microorganisms, introduced the application of phosphate-solubilizing microorganisms in agriculture, and discussed the existent problems in their application and the corresponding solution ways, in order to provide a reference for the further research and application of phosphate-solubilizing microorganisms.

Phosphate-solubilizing microorganism; Microbial fertilizer; Mechanism of phosphate solubilization; Research progress

2016-09-21

江西省教育廳科學技術研究項目(GJJ151277、GJJ151279)。

林英(1985─)，女，講師，博士，主要從事農(nóng)業(yè)微生物資源的研究與開發(fā)工作。

S182

A

1001-8581(2017)02-0099-05