• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    利用果膠降解菌塔賓曲霉GYC 501改善梗絲品質(zhì)及其發(fā)酵條件的優(yōu)化

    2017-02-17 10:38:09龍章德陳皓睿鄒克興孫建生李季剛申佩弘
    江西農(nóng)業(yè)學(xué)報 2017年2期
    關(guān)鍵詞:煙梗果膠發(fā)酵液

    龍章德,陳皓睿,劉 鴻*,鄒克興,孫建生,李季剛,薛 云,申佩弘*

    (1.廣西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司,廣西 南寧 530001;2.廣西大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,廣西 南寧530005)

    利用果膠降解菌塔賓曲霉GYC 501改善梗絲品質(zhì)及其發(fā)酵條件的優(yōu)化

    龍章德1,陳皓睿2,劉 鴻1*,鄒克興1,孫建生1,李季剛1,薛 云1,申佩弘2*

    (1.廣西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司,廣西 南寧 530001;2.廣西大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,廣西 南寧530005)

    煙草梗絲中含有大量果膠、纖維素等細胞壁物質(zhì),造成吸味不好,對其在煙制品中的應(yīng)用造成了阻礙。本研究旨在利用GYC 501的發(fā)酵酶液處理煙草梗絲,以降解其中以果膠為主的多糖,改善吸味。本研究首先建立了一種測定煙草梗絲中果膠含量相對簡易的方法,并從發(fā)酵時間、緩沖液濃度、緩沖液pH值、發(fā)酵溫度、酶的使用量入手,先進行單因素優(yōu)化實驗再進行正交實驗,以優(yōu)化發(fā)酵條件。結(jié)果顯示:使用塔賓曲霉(Aspergillustubingensis) GYC 501在煙草梗絲培養(yǎng)基中發(fā)酵48 h后所得到的發(fā)酵液對煙草梗絲進行發(fā)酵處理,得到最優(yōu)發(fā)酵條件:酶使用量為1536 U,發(fā)酵時間為12 h,溫度為42 ℃,緩沖液pH為4.8,緩沖液濃度為0.3 mol/L,梗絲含水量為50%。在此最優(yōu)發(fā)酵條件下,梗絲果膠降解率最佳,為34.97%。

    煙草梗絲;塔賓曲霉;果膠酶;條件優(yōu)化;正交試驗

    煙草梗絲在加入酶后其品質(zhì)有一定程度的提升,不光是吸味的改善[1],還能提升煙梗在成煙中的填充率[2]。酶的優(yōu)點是有效降低化學(xué)反應(yīng)勢能差,同時效率較化學(xué)法高很多,而且污染少、利用率高。利用酶解技術(shù)提高煙梗質(zhì)量的報道并不多,肖瑞云等利用多種多糖水解酶研究了不同組合的復(fù)合酶對煙梗吸味的影響,發(fā)現(xiàn)主要的影響是煙氣協(xié)調(diào)性指標的改善較為明顯[3]。張見等的研究更深入,經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)各因素對煙梗還原糖含量影響顯著性排序是:水分>纖維素酶Ⅰ>果膠酶Ⅱ>溫度>果膠酶Ⅰ,優(yōu)化條件后半乳糖醛酸含量約為原來的10倍,果膠降解顯著[4-5]。徐達等的研究同樣具有相似的效果,梗絲水解后水溶性總糖含量提高了23.31%,果膠含量降低了17.26%[6]。也有報道將生香酵母接種于滅菌后的煙梗提取液上,在30 ℃下發(fā)酵2 d,結(jié)果表明發(fā)酵后的煙梗提取液中的可溶性糖,特別是葡萄糖含量明顯降低,同時有機酸含量增加,酸值提高,葡萄糖含量的降低對煙產(chǎn)品來說是不利的,雖然香氣有所提高但并不能說改善了煙梗質(zhì)量[7]。

    利用酶解與發(fā)酵技術(shù)是現(xiàn)今提高煙草梗絲質(zhì)量的熱點,本研究擬利用從茶葉中獲得的塔賓曲霉(Aspergillustubingensis) GYC 501,通過發(fā)酵條件優(yōu)化,降低梗絲中果膠含量,改善梗絲品質(zhì)。同時研究建立一套草酸銨浸提法測定煙梗果膠含量的方法。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    煙草梗絲:來源于煙廠生產(chǎn)原料,空白膨脹梗絲(初始含水量12%)。

    GYC 501發(fā)酵培養(yǎng)基:1.5 g煙草梗絲,加入50 mL蒸餾水,115 ℃濕熱滅菌30 min,取出冷卻后即可用于發(fā)酵。

    含鹽酸的無水乙醇:將11 mL濃鹽酸與1 L無水乙醇混合。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 檢測煙草中果膠的方法 本方法中的果膠含量測定部分來自國標法(GB/T 10742─2008)。

    在無菌環(huán)境下將GYC 501孢子接入GYC 501發(fā)酵培養(yǎng)基中,37 ℃搖床培養(yǎng)48 h,取出后先用一層紗布過濾,再用濾紙(快速型)過濾,得到GYC 501發(fā)酵酶液。之前的研究表明:GYC 501發(fā)酵液每1 mL酶液的酶活為192 U(將50 ℃反應(yīng)30 min,每毫升酶液每小時水解蘋果果膠生成1 mg半乳糖醛酸的能力定義為一個酶活力單位)。將上一步得到的酶液加入到檸檬酸-檸檬酸鈉溶液中(體積比例7∶3),混合均勻后,均勻噴施于15 g煙梗上,加入后梗絲含水量為一定數(shù)值,恒溫培養(yǎng)箱中放置,分不同時間取出。 將處理過的(或未處理的空白對照)煙梗加入到800 mL 1%草酸銨溶液中,100 ℃水浴鍋中抽提3 h,隔0.5 h混勻一次。取出,使用16層紗布過濾液體部分,將殘渣留于瓶底,得抽提液。再次用200 mL 1%草酸銨溶液在相同條件下抽提0.5 h,將兩次抽提液混合,定容至1 L,混合均勻。 取50 mL上一步所得液體,立即加入180 mL含鹽酸的無水乙醇,混勻后過夜沉淀,濾紙過濾,烘干后稱重,計算粗果膠含量。

    1.2.2 GYC 501發(fā)酵液降解梗絲的條件優(yōu)化 本實驗初始梗絲處理條件為:酶加入量1536 U(7.98 mL GYC 501發(fā)酵酶液),加入發(fā)酵液后,用pH 5.4的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液將梗絲含水量調(diào)節(jié)為50%,緩沖液終濃度為0.1 mol/L,恒溫培養(yǎng)的溫度為37 ℃,處理時間分別為1、2、4、6、12、24、36、48、72 h,以確定處理時間。

    此階段使用上一部分實驗建立的方法模型對GYC 501發(fā)酵液以及煙草梗絲的緩沖液pH、緩沖液濃度、處理梗絲的含水量、發(fā)酵溫度以及酶用量這5個條件,進行優(yōu)化處理。

    1.2.2.1 緩沖液pH 分別配制檸檬酸、檸檬酸鈉緩沖液,按比例混合,pH 3.6按14.9∶5.1,pH 4.2按12.3∶7.7,pH 4.8按9.2∶10.8,pH 5.4按6.4∶13.6,pH 6.0按3.8∶16.2比例混合。發(fā)酵方法同1.2.1。

    1.2.2.2 緩沖液濃度 按6.4∶13.6混合檸檬酸、檸檬酸鈉,終濃度設(shè)置為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L,緩沖液濃度為0時使用蒸餾水代替。發(fā)酵方法同1.2.1。

    1.2.2.3 梗絲含水量 將GYC 501發(fā)酵液濃縮1倍,將緩沖液配制成pH 5.4,并與一定量的酶液混合,終濃度為0.1 mol/L,使最終加入的酶量為1536 U,最終含水量分別調(diào)至30%、35%、40%、45%、50%。其它條件與1.2.1中的相同。

    1.2.2.4 溫度 使用1.2.2.3的條件將1.2.1中的發(fā)酵溫度調(diào)整為32、37、42、47 ℃。

    1.2.2.5 酶用量 使用1.2.2.3的條件將酶用量調(diào)整為768、1536 、2189 、4378 U。

    1.2.3 梗絲降解條件的正交優(yōu)化 在果膠降解工藝的單因素優(yōu)化之后,為確定多因素對梗絲果膠降解率的顯著影響,挑選溫度、緩沖液pH值、緩沖液濃度、處理時梗絲含水量這4個因素進行三水平正交試驗,條件設(shè)置如表1。

    表1 正交試驗設(shè)計

    溫度選擇在32、37、42 ℃是因為較低的溫度不利于酶發(fā)揮作用,而高于42 ℃會降低煙草梗絲的質(zhì)量;緩沖液pH條件根據(jù)上述單因素試驗制定;緩沖液濃度條件也是根據(jù)上述試驗制定;處理時梗絲含水量不超過50%,是根據(jù)煙草梗絲處理過程含水量的限制決定的。酶用量為1536 U,處理時間為12 h。

    1.2.4 正交最優(yōu)解的驗證 從1.2.3正交試驗結(jié)果中得出可能的最優(yōu)組合:溫度為42 ℃,緩沖液pH為4.8,緩沖液濃度為0.3 mol/L,處理時梗絲含水量為50%。遂使用此條件驗證正交最優(yōu)解。酶用量為1536 U,處理時間為12 h。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 梗絲降解實驗

    塔賓曲霉GYC 501的發(fā)酵液處理梗絲的效果良好(圖1),1 h的降解效率就已經(jīng)達到18.65%,12 h能達到27.2%,而隨著時間的增加,36 h之后降解效率不再增加,說明發(fā)酵液中的酶活性在12 h后開始迅速降低。酶活性降低的主要因素有:其一,果膠被分解產(chǎn)生半乳糖醛酸,其為酸性物質(zhì),當其生成量達到一定值時,緩沖液已經(jīng)無法承受巨大的pH變化,溶劑系統(tǒng)pH不再適合酶發(fā)揮作用,或者變性;其二,隨著時間變化,高溫環(huán)境下的酶緩慢失活。遂下述實驗采用12 h作為發(fā)酵終點。

    2.2 梗絲降解的條件優(yōu)化

    2.2.1 緩沖液pH pH為6的緩沖液處理效果最好(圖2),但總體來說緩沖液pH對降解效率影響相對較小。根據(jù)之前的研究[8],GYC 501的生長pH為偏酸性,所以下述實驗緩沖液pH維持在5.4。

    圖2 GYC 501發(fā)酵液在不同pH下對梗絲的降解效果

    2.2.2 緩沖液濃度 如圖3所示,緩沖液濃度為0 mol/L即無緩沖液時的降解效率為18.39%,效果最差;0.2 mol/L效果最好,為34.46%。由于過高的緩沖液濃度對煙草吸味影響極大,而缺少緩沖液則會影響酶正常發(fā)揮作用,遂以下實驗的緩沖液濃度維持0.1 mol/L不變。

    2.2.3 梗絲含水量 含水量的數(shù)據(jù)(圖4)顯示,含水量對梗絲降解率影響巨大,含水量越大,果膠降解效率越好,但含水量過大不利于儲存等后續(xù)處理,所以選擇50%的含水量用于實驗。

    2.2.4 溫度 在圖5中的溫度范圍內(nèi),溫度對酶解的影響并不大,但是過高的溫度造成酶的失活,降低降解效率;以37 ℃為最佳。下述實驗采用37 ℃為發(fā)酵溫度。

    圖3 GYC 501發(fā)酵液在不同緩沖液濃度下對梗絲的降解效果

    圖4 GYC 501發(fā)酵液在不同梗絲含水量下對梗絲的降解效果

    圖5 GYC 501發(fā)酵液在不同溫度下對梗絲的降解效果

    2.2.5 酶用量 本實驗表明(圖6),并非酶用量越大發(fā)酵效果越好,在設(shè)定條件下,酶加入量2189 U處理效果(果膠降解率32.38%)與4378 U的處理效果(果膠降解率32.64%)幾乎沒有差別。

    圖6 GYC 501不同酶用量對梗絲的降解效果

    2.3 梗絲降解條件的正交優(yōu)化

    正交試驗顯示:基于設(shè)計的4種因素的取值范圍,它們對煙草梗絲降解效率影響的大小順序為:處理時梗絲含水量>緩沖液pH>溫度>緩沖液濃度。從實驗結(jié)果中得出可能的最優(yōu)組合:溫度為42 ℃,緩沖液pH為4.8,緩沖液濃度為0.3 mol/L,處理時梗絲含水量為50%。

    正交試驗中,在組合實驗號為3(表2)的條件下達到的最佳梗絲果膠降解效果(果膠降解率為33.52%)與2.2.5優(yōu)化后的降解效果(果膠降解率為32.38%)相近,但是該條件下使用的酶用量僅為1536 U(2.2.5優(yōu)化后采用的酶用量為2189 U),可見經(jīng)過合理的正交優(yōu)化設(shè)計,在提高梗絲果膠物降解效果的情況下,避免了過高的酶用量,而酶加入量的提高將直接使梗絲抽吸效果大打折扣。但是實際處理條件要根據(jù)煙梗抽吸結(jié)果做出一定妥協(xié)。

    表2 正交試驗結(jié)果L9(34)

    2.4 正交最優(yōu)解的驗證

    正交最優(yōu)解的驗證實驗得到的梗絲果膠物降解率為34.97%,所以根據(jù)正交試驗推測的最優(yōu)組合為:溫度42 ℃,緩沖液pH 4.8,緩沖液濃度0.3 mol/L,處理時梗絲含水量50%。

    3 討論

    梗絲由于多糖類物質(zhì)含量高,引起吸味不佳,能應(yīng)用到煙草加工中的量非常有限,造成了浪費。本研究利用本實驗室前期從煙梗中篩選到的能高效降解果膠的真菌GYC501對梗絲進行針對性的發(fā)酵,目的就是減少多糖含量,增加香氣的前體物質(zhì)還原性糖含量。利用微生物發(fā)酵酶液來低成本降解煙梗多糖物質(zhì)的相關(guān)研究較少。郝輝等成功利用微紫青霉(Penicilliumjanthinellumsw 09)降解煙梗41.35%的果膠,但其產(chǎn)酶培養(yǎng)基成本高昂[9],而本實驗利用的發(fā)酵培養(yǎng)液中只含有煙梗、水兩種成分,能顯著降低酶法降解的成本。

    目前測定煙草中果膠含量的方法經(jīng)常采用非常繁瑣的色譜法,甚至動用掃描顯微鏡, 只有少數(shù)采用草酸銨浸提法[10-11]。本項目采用草酸銨抽提、酸性乙醇沉淀的化學(xué)方法收集果膠以對降解效果進行評價,有望解決測定成本過高、耗時長的問題。通過發(fā)酵條件及檢測條件的優(yōu)化,提高了GYC501對梗絲的發(fā)酵效率,從而有效提高煙梗及梗絲的品質(zhì),增加其在卷煙配方中的適用性。

    4 結(jié)論

    本研究使用GYC 501在煙草梗絲培養(yǎng)基中發(fā)酵48 h后所得到的發(fā)酵液對煙草梗絲進行發(fā)酵處理,經(jīng)優(yōu)化后得到了最佳的發(fā)酵條件:在酶使用量為1536 U的情況下,溫度為37 ℃,緩沖液pH為4.8,緩沖液濃度為0.3 mol/L,梗絲含水量為50%。在此條件下,梗絲果膠降解率最佳,為34.97%;最終發(fā)酵效果良好,梗絲降解率從27.2%優(yōu)化到34.97%,正交優(yōu)化后酶的使用量較單因素優(yōu)化后減少了50%。菌株GYC 501對于改善梗絲質(zhì)量有較好的應(yīng)用前景,下一步將檢測評吸效果及煙氣成分,了解利用GYC501發(fā)酵后對梗絲成分及吸味的具體影響。

    [1] 林翔,陶紅,沈光林,等.利用復(fù)合酶改善煙梗品質(zhì)的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011,39(4):2064-2066.

    [2] 李軍,彭金輝,劉堅,等.溶劑處理對煙梗梗絲內(nèi)在質(zhì)量的影響[J].昆明理工大學(xué)學(xué)報:理工版,2010,35(5):94-99.

    [3] 肖瑞云,林凱.不同復(fù)合酶對煙?;瘜W(xué)成分和感官評吸的影響[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報,2010,22(10):70-72.

    [4] 張見.煙梗的酶降解應(yīng)用研究與評價[D].無錫:江南大學(xué),2012.

    [5] 張見,劉元法,李東亮,等.非溶液體系下酶解條件對煙草梗絲中細胞壁物質(zhì)的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,40(7):3973-3975,3979.

    [6] 徐達,田耀偉,蘇加坤,等.不同復(fù)合酶在改善梗絲品質(zhì)中的研究[J].中國釀造,2014,33(11):113-117.

    [7] 周瑢,孔浩輝,何艷明,等.生香酵母發(fā)酵改善煙梗提取液性質(zhì)研究[J].食品工業(yè)科技,2012,33(23):73-75,80.

    [8] 寧振興,陳皓睿,劉鴻,等.一株能高效降解梗絲果膠和纖維素的曲霉的篩選和鑒定[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)報,2016,35(8):2077-2082.

    [9] 郝輝,陳芝飛,宋金勇,等.微紫青霉(Penicilliumjanthinellumsw09)發(fā)酵產(chǎn)果膠酶降解煙梗果膠的條件優(yōu)化及產(chǎn)物分析[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報,2015,28(6):2756-2762.

    [10] 曹茜,李新生,張軍,等.超聲輔助去除煙草薄片煙梗中果膠的方法研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,38(26):14312-14314.

    [11] 魯蕾,付敏,郭寶星.煙梗果膠浸提工藝的研究[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2004,17(3):374-377.

    (責(zé)任編輯:許晶晶)

    Application of Pectin-degrading FungusAspergillustubingensisGYC 501 in Improvement of Tobacco Cut-stem Quality and Optimization of Its Fermentation Conditions

    LONG Zhang-de1, CHEN Hao-rui2, LIU Hong1*, ZOU Ke-xing1,SUN Jian-sheng1, LI Ji-gang1, XUE Yun1, SHEN Pei-hong2*

    (1. China Tobacco Guangxi Industrial Limited Company, Nanning 530001, China;2. College of Life Science and Technology, Guangxi University, Nanning 530005, China)

    There are a large amount of cell wall substances such as pectin and cellulose in tobacco stem, and these substances cause bad smoking quality, thus tobacco stem application is limited in manufacture. This research treated tobacco cut-stem with the fermentation liquid ofAspergillustubingensisGYC 501 to degrade the polysaccharides (mainly being pectin) in it and to improve its smoking quality. A relative simple method for measuring the pectin content in tobacco cut-stem was built. The fermentation conditions (fermentation time, buffer solution concentration, buffer solution pH-value, fermentation temperature, pectinase application rate, and so on) of tobacco cut-stem were optimized by single-factor experiment and orthogonal test. The fermentation liquid ofA.tubingensisGYC 501, which was obtained by culturing this fungus in the tobacco cut-stem liquid medium for 48 h, was applied to ferment the tobacco cut-stem. The optimal fermentation conditions were obtained as follows: pectinase application rate 1536 U, fermentation time 12 h, fermentation temperature 42 ℃, buffer solution pH 4.8, 0.3 mol/L buffer solution, cut-stem moisture content 50%. Under the above optimum fermentation conditions, the degrading rate of pectin in tobacco cut-stem was the highest, reaching 34.97%.

    Tobacco cut-stem;Aspergillustubingensis; Pectinase; Fermentation conditions optimization; Orthogonal test

    2016-11-23

    廣西科技廳科技攻關(guān)項目(桂科攻15118006)。

    龍章德(1970─),男,高級農(nóng)藝師,博士,從事煙葉原料研究。*通訊作者:劉鴻、申佩弘。

    Q815

    A

    1001-8581(2017)02-0095-04

    猜你喜歡
    煙梗果膠發(fā)酵液
    從五種天然色素提取廢渣中分離果膠的初步研究
    煙梗尺寸對浸梗效果的影響
    卵磷脂/果膠鋅凝膠球在3種緩沖液中的釋放行為
    中成藥(2018年6期)2018-07-11 03:01:12
    連翹內(nèi)生真菌的分離鑒定及其發(fā)酵液抑菌活性和HPLC測定
    桑黃纖孔菌發(fā)酵液化學(xué)成分的研究
    中成藥(2018年1期)2018-02-02 07:20:03
    提取劑對大豆果膠類多糖的提取率及性質(zhì)影響
    廢棄煙梗提取液為基質(zhì)的產(chǎn)油脂酵母菌的篩選與鑒定
    煙草科技(2015年8期)2015-12-20 08:27:04
    北五味子果實中果膠的超聲提取工藝研究
    煙梗中木素的結(jié)構(gòu)分析
    中國造紙(2014年1期)2014-03-01 02:10:09
    HPLC與LC-MS/MS測定蛹蟲草發(fā)酵液中蟲草素的方法比較
    搡老乐熟女国产| 亚洲成人av在线免费| 欧美日本视频| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 久久久欧美国产精品| av在线亚洲专区| 亚洲国产日韩一区二区| 久久精品国产亚洲av涩爱| 亚洲欧美日韩东京热| 波野结衣二区三区在线| 国产老妇女一区| 国产熟女欧美一区二区| 亚洲av国产av综合av卡| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 国产 精品1| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 成人亚洲精品av一区二区| tube8黄色片| 午夜免费观看性视频| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频 | 亚洲精品日韩av片在线观看| 亚洲综合色惰| 精品一区在线观看国产| 国产黄片视频在线免费观看| 欧美成人一区二区免费高清观看| 国产 精品1| 国产v大片淫在线免费观看| 在线观看人妻少妇| 91精品一卡2卡3卡4卡| .国产精品久久| 午夜日本视频在线| 搡女人真爽免费视频火全软件| 午夜免费鲁丝| 国产亚洲一区二区精品| 久久久欧美国产精品| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 久久人人爽av亚洲精品天堂 | 波多野结衣巨乳人妻| 国产高潮美女av| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 日本欧美国产在线视频| 观看免费一级毛片| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 夫妻性生交免费视频一级片| 亚洲国产精品999| 最近的中文字幕免费完整| 国产91av在线免费观看| 日韩欧美一区视频在线观看 | 亚洲高清免费不卡视频| 高清欧美精品videossex| 麻豆成人午夜福利视频| 嘟嘟电影网在线观看| 国产成人a区在线观看| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| av福利片在线观看| 国产亚洲5aaaaa淫片| 精品久久久久久电影网| 91久久精品国产一区二区三区| 久久韩国三级中文字幕| 精品人妻熟女av久视频| 亚洲av不卡在线观看| 在线免费十八禁| 一级av片app| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 欧美日本视频| 天堂中文最新版在线下载 | 国产成人福利小说| 亚洲最大成人手机在线| 国产精品国产三级国产专区5o| 直男gayav资源| 欧美高清成人免费视频www| 日韩av在线免费看完整版不卡| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 久久精品国产亚洲网站| 黄色一级大片看看| 99久久中文字幕三级久久日本| 婷婷色综合www| 免费黄频网站在线观看国产| 国产精品99久久久久久久久| 制服丝袜香蕉在线| 成人黄色视频免费在线看| 精品国产三级普通话版| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 久久精品久久精品一区二区三区| 欧美成人一区二区免费高清观看| 一级黄片播放器| av黄色大香蕉| 国产伦在线观看视频一区| 插逼视频在线观看| 国产亚洲5aaaaa淫片| 国产精品一及| 我的女老师完整版在线观看| 在线观看国产h片| 久久久久九九精品影院| 青春草国产在线视频| 日日啪夜夜爽| 国产精品人妻久久久久久| 熟女电影av网| 亚洲成人中文字幕在线播放| 久久久久久国产a免费观看| 一级毛片我不卡| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 日本-黄色视频高清免费观看| 大码成人一级视频| 国产精品久久久久久精品古装| 国产一区二区三区综合在线观看 | 欧美另类一区| 中文字幕制服av| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 性插视频无遮挡在线免费观看| 又爽又黄a免费视频| 日本免费在线观看一区| 搡老乐熟女国产| 国产精品久久久久久久久免| 波野结衣二区三区在线| 一级毛片电影观看| 三级国产精品片| 天天一区二区日本电影三级| 免费av毛片视频| 好男人在线观看高清免费视频| 国产伦精品一区二区三区四那| 亚洲真实伦在线观看| 午夜免费鲁丝| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 亚洲欧美精品自产自拍| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 最近中文字幕2019免费版| 国产一区亚洲一区在线观看| 久久久久性生活片| 老司机影院毛片| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 一本一本综合久久| 欧美人与善性xxx| 亚洲av成人精品一二三区| 亚洲最大成人手机在线| 精品少妇黑人巨大在线播放| 精品一区二区免费观看| 秋霞在线观看毛片| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 在线观看三级黄色| 99热全是精品| 全区人妻精品视频| 国产综合精华液| 亚洲av在线观看美女高潮| 免费av不卡在线播放| 成人黄色视频免费在线看| 天堂中文最新版在线下载 | 亚洲av在线观看美女高潮| 国产欧美日韩精品一区二区| h日本视频在线播放| 国产亚洲5aaaaa淫片| 国产成人精品婷婷| 国产亚洲精品久久久com| 别揉我奶头 嗯啊视频| 久久久久国产网址| 神马国产精品三级电影在线观看| 最近最新中文字幕免费大全7| 一个人观看的视频www高清免费观看| 麻豆乱淫一区二区| 成人欧美大片| 精品熟女少妇av免费看| 99久久精品热视频| av在线播放精品| 日本黄色片子视频| 亚洲国产精品999| 日韩人妻高清精品专区| 亚洲内射少妇av| 成年人午夜在线观看视频| 九九爱精品视频在线观看| 亚洲第一区二区三区不卡| 综合色av麻豆| 亚洲天堂国产精品一区在线| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 毛片一级片免费看久久久久| 可以在线观看毛片的网站| 久久国产乱子免费精品| 国产成人aa在线观看| 不卡视频在线观看欧美| 午夜激情久久久久久久| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 大话2 男鬼变身卡| 六月丁香七月| 国产精品99久久久久久久久| 在线观看三级黄色| 韩国av在线不卡| 免费看光身美女| 亚洲av免费在线观看| 成年免费大片在线观看| 亚洲经典国产精华液单| 听说在线观看完整版免费高清| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 啦啦啦在线观看免费高清www| 少妇人妻精品综合一区二区| 九草在线视频观看| 午夜激情久久久久久久| 亚洲精品一区蜜桃| 国产精品无大码| 国产亚洲av嫩草精品影院| 熟女av电影| 丰满人妻一区二区三区视频av| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 欧美激情国产日韩精品一区| 777米奇影视久久| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 久久久a久久爽久久v久久| 国内精品美女久久久久久| 狂野欧美激情性bbbbbb| 91久久精品国产一区二区三区| 国产在视频线精品| 啦啦啦啦在线视频资源| 国产伦在线观看视频一区| 亚洲自拍偷在线| 嫩草影院新地址| 久热久热在线精品观看| 九草在线视频观看| 男女下面进入的视频免费午夜| 久久99热这里只频精品6学生| 又爽又黄无遮挡网站| 久久精品国产亚洲av涩爱| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 一个人观看的视频www高清免费观看| 亚洲精品一区蜜桃| 国产精品久久久久久久电影| 亚洲自偷自拍三级| 少妇 在线观看| 国产成人一区二区在线| 2021天堂中文幕一二区在线观| 天美传媒精品一区二区| 久久久久久久国产电影| 中文资源天堂在线| 日本与韩国留学比较| 日本爱情动作片www.在线观看| 晚上一个人看的免费电影| 九九在线视频观看精品| 国产男人的电影天堂91| 久久精品国产a三级三级三级| 国产精品国产三级专区第一集| 一区二区三区免费毛片| 极品少妇高潮喷水抽搐| 国产亚洲5aaaaa淫片| 日韩欧美精品免费久久| 国产毛片在线视频| 国产成年人精品一区二区| 少妇熟女欧美另类| 欧美xxⅹ黑人| 男男h啪啪无遮挡| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 久久精品人妻少妇| 久久久久久久久大av| 国产精品一及| 禁无遮挡网站| 欧美日本视频| 免费看a级黄色片| 夫妻性生交免费视频一级片| 爱豆传媒免费全集在线观看| 欧美xxxx性猛交bbbb| 亚洲人成网站高清观看| 欧美人与善性xxx| 黄片wwwwww| 色播亚洲综合网| 99久久人妻综合| av.在线天堂| 欧美少妇被猛烈插入视频| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 如何舔出高潮| 伊人久久精品亚洲午夜| 搡女人真爽免费视频火全软件| 下体分泌物呈黄色| 国产又色又爽无遮挡免| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 日韩欧美精品免费久久| 99久久精品一区二区三区| 亚洲欧美日韩无卡精品| 国产成人免费无遮挡视频| 熟妇人妻不卡中文字幕| 全区人妻精品视频| 激情 狠狠 欧美| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 成人亚洲欧美一区二区av| av又黄又爽大尺度在线免费看| 99热6这里只有精品| 搞女人的毛片| 国产伦精品一区二区三区视频9| 亚洲精品国产av成人精品| 男人添女人高潮全过程视频| 亚洲天堂av无毛| 成人无遮挡网站| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 国产精品一区二区在线观看99| 中国三级夫妇交换| 黄色视频在线播放观看不卡| 国产探花极品一区二区| 日本wwww免费看| 禁无遮挡网站| 国产午夜精品一二区理论片| 欧美日韩视频精品一区| 精品久久久久久久末码| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 视频区图区小说| 日本一二三区视频观看| 国产伦理片在线播放av一区| 少妇人妻久久综合中文| 成年人午夜在线观看视频| 一个人看视频在线观看www免费| 国产精品av视频在线免费观看| 99久国产av精品国产电影| 一个人看的www免费观看视频| 嫩草影院新地址| 中国美白少妇内射xxxbb| 久久久久久久午夜电影| 国产午夜精品一二区理论片| 夫妻午夜视频| 亚洲人成网站在线观看播放| 久久精品综合一区二区三区| 中文字幕久久专区| 国产男女内射视频| 一级爰片在线观看| 国产成人精品婷婷| 可以在线观看毛片的网站| 五月玫瑰六月丁香| 联通29元200g的流量卡| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 中文欧美无线码| 久久久久网色| 1000部很黄的大片| 黄色视频在线播放观看不卡| 成人毛片a级毛片在线播放| 99久国产av精品国产电影| 精品国产露脸久久av麻豆| 性插视频无遮挡在线免费观看| 九草在线视频观看| 男男h啪啪无遮挡| 欧美激情久久久久久爽电影| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 十八禁网站网址无遮挡 | 亚洲av中文字字幕乱码综合| 日韩精品有码人妻一区| 亚洲国产精品成人综合色| 国产淫语在线视频| 国产精品三级大全| 国产精品人妻久久久久久| 日韩伦理黄色片| 人妻少妇偷人精品九色| 色综合色国产| 久久久久久伊人网av| 欧美xxxx性猛交bbbb| 熟女av电影| 女人被狂操c到高潮| 我的女老师完整版在线观看| 高清欧美精品videossex| 精品一区二区三卡| 哪个播放器可以免费观看大片| 69av精品久久久久久| 亚洲欧美日韩另类电影网站 | 一边亲一边摸免费视频| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| av网站免费在线观看视频| 在线观看美女被高潮喷水网站| tube8黄色片| 只有这里有精品99| 日韩欧美精品免费久久| 日韩在线高清观看一区二区三区| 亚洲精品乱久久久久久| 免费看日本二区| 大话2 男鬼变身卡| 亚洲,一卡二卡三卡| 联通29元200g的流量卡| 日本色播在线视频| 在现免费观看毛片| 亚洲欧美日韩东京热| 有码 亚洲区| 国产在线一区二区三区精| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 国产在视频线精品| 亚洲欧美日韩东京热| 久久精品综合一区二区三区| 别揉我奶头 嗯啊视频| av在线观看视频网站免费| 午夜福利视频1000在线观看| 熟女av电影| 精品午夜福利在线看| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 国产男人的电影天堂91| av线在线观看网站| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 久久久色成人| 国产成人精品福利久久| 在线观看国产h片| 夜夜爽夜夜爽视频| 黄片wwwwww| 国产爽快片一区二区三区| 国产精品av视频在线免费观看| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 七月丁香在线播放| 午夜精品一区二区三区免费看| 国产男女内射视频| 亚洲国产精品999| 嫩草影院新地址| 白带黄色成豆腐渣| 日本一二三区视频观看| 日韩人妻高清精品专区| 成人鲁丝片一二三区免费| av国产免费在线观看| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 亚洲国产av新网站| 国产色婷婷99| 91久久精品国产一区二区三区| 国产伦理片在线播放av一区| 国产成人免费无遮挡视频| 国产男女超爽视频在线观看| 国产精品熟女久久久久浪| 寂寞人妻少妇视频99o| 男人爽女人下面视频在线观看| 永久网站在线| 欧美xxxx性猛交bbbb| 2021天堂中文幕一二区在线观| 男人狂女人下面高潮的视频| www.色视频.com| 久久久久久久亚洲中文字幕| 91久久精品国产一区二区三区| 国产伦在线观看视频一区| 女人十人毛片免费观看3o分钟| av天堂中文字幕网| 麻豆成人午夜福利视频| 亚洲精品自拍成人| av女优亚洲男人天堂| .国产精品久久| 免费观看性生交大片5| 极品少妇高潮喷水抽搐| 午夜福利高清视频| 久久6这里有精品| 91久久精品国产一区二区成人| 高清欧美精品videossex| 亚洲在久久综合| 亚洲内射少妇av| 九九爱精品视频在线观看| 2022亚洲国产成人精品| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 亚洲最大成人中文| 综合色av麻豆| 免费少妇av软件| 成人国产麻豆网| 女人被狂操c到高潮| 成人毛片60女人毛片免费| 国产在视频线精品| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 欧美zozozo另类| 亚洲欧美日韩东京热| 亚洲成人中文字幕在线播放| 日韩欧美精品v在线| 男人爽女人下面视频在线观看| 99久久九九国产精品国产免费| 久久久久久久午夜电影| 免费观看性生交大片5| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 街头女战士在线观看网站| 国产精品久久久久久精品电影小说 | av在线观看视频网站免费| 大香蕉97超碰在线| 一个人看的www免费观看视频| 青青草视频在线视频观看| 可以在线观看毛片的网站| 久久久久久久久大av| 久久精品国产亚洲av天美| 少妇人妻一区二区三区视频| 亚洲人与动物交配视频| 亚洲电影在线观看av| videossex国产| av天堂中文字幕网| 嫩草影院入口| 久久久久久久久久久免费av| 欧美zozozo另类| 午夜精品一区二区三区免费看| 波多野结衣巨乳人妻| 久久久久精品久久久久真实原创| 99热全是精品| 免费观看av网站的网址| 国产免费视频播放在线视频| 国产毛片在线视频| 一级二级三级毛片免费看| 另类亚洲欧美激情| 麻豆国产97在线/欧美| 黄色欧美视频在线观看| 日韩三级伦理在线观看| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 国内揄拍国产精品人妻在线| 成人亚洲精品av一区二区| 免费观看a级毛片全部| 国产亚洲一区二区精品| 一区二区三区精品91| 三级国产精品片| 国产亚洲5aaaaa淫片| a级毛色黄片| 国产真实伦视频高清在线观看| 国产精品国产三级国产专区5o| av在线观看视频网站免费| 性色av一级| 中文欧美无线码| 亚洲成人一二三区av| 国产 一区精品| 干丝袜人妻中文字幕| 国产黄频视频在线观看| 美女高潮的动态| 精品人妻视频免费看| 特大巨黑吊av在线直播| 在线观看一区二区三区| 中文字幕亚洲精品专区| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 亚洲国产精品国产精品| 久久久久久伊人网av| 青春草视频在线免费观看| 久久久精品欧美日韩精品| 亚洲最大成人中文| 日韩欧美精品免费久久| 天堂中文最新版在线下载 | 熟妇人妻不卡中文字幕| 亚洲伊人久久精品综合| 新久久久久国产一级毛片| 男人舔奶头视频| 亚洲内射少妇av| 天堂俺去俺来也www色官网| 亚洲精品亚洲一区二区| 日韩亚洲欧美综合| 大话2 男鬼变身卡| 亚洲国产精品成人久久小说| 国产乱人视频| 超碰97精品在线观看| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 99热这里只有是精品50| 久久久国产一区二区| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 国产成人福利小说| 男女无遮挡免费网站观看| 亚洲精品色激情综合| 国产高清三级在线| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 中国国产av一级| 久久久久国产网址| av国产久精品久网站免费入址| 日本-黄色视频高清免费观看| 人妻少妇偷人精品九色| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 亚洲国产成人一精品久久久| 国产成人91sexporn| tube8黄色片| 亚洲国产精品专区欧美| av线在线观看网站| 97超视频在线观看视频| 亚洲三级黄色毛片| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 免费观看性生交大片5| 白带黄色成豆腐渣| 亚洲综合精品二区| av在线蜜桃| 韩国av在线不卡| 3wmmmm亚洲av在线观看| 又爽又黄a免费视频| 亚洲国产欧美在线一区| 人人妻人人看人人澡| 精品少妇久久久久久888优播| 波野结衣二区三区在线| 免费观看的影片在线观看| 午夜福利网站1000一区二区三区| 国产中年淑女户外野战色| 久久99蜜桃精品久久| 亚洲精品国产av蜜桃| 少妇人妻久久综合中文| 精品一区二区三卡| 激情 狠狠 欧美| 免费大片黄手机在线观看| 性色avwww在线观看| 成人毛片a级毛片在线播放| 99热这里只有是精品在线观看| 精华霜和精华液先用哪个| 国产乱人偷精品视频| 日韩三级伦理在线观看| 18+在线观看网站| 高清欧美精品videossex| 精品久久久久久久久亚洲| 午夜视频国产福利| 日韩免费高清中文字幕av| 婷婷色综合大香蕉| 久久久欧美国产精品| 99久久精品国产国产毛片| eeuss影院久久| 国产又色又爽无遮挡免| 国产亚洲精品久久久com| 26uuu在线亚洲综合色| 免费看不卡的av| 国内精品宾馆在线| 视频区图区小说| 尾随美女入室| 一本一本综合久久| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 国产毛片在线视频| 午夜爱爱视频在线播放| 精品久久久久久电影网| 亚洲在久久综合| 狂野欧美激情性bbbbbb| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 久久精品国产亚洲av涩爱| 日韩 亚洲 欧美在线| 亚洲精品乱久久久久久| 国产成人精品福利久久| 国产精品国产三级国产专区5o| 国产亚洲91精品色在线| av天堂中文字幕网| 美女视频免费永久观看网站| 国国产精品蜜臀av免费| 欧美区成人在线视频|