精草潤(rùn)目液治療大鼠干眼模型的實(shí)驗(yàn)觀察

王詩(shī)敏，李點(diǎn)

干眼是由于淚液的量或質(zhì)或流體動(dòng)力學(xué)異常引起的淚膜不穩(wěn)定和（或）眼表?yè)p害，從而導(dǎo)致眼不適癥狀及視功能障礙的一類(lèi)疾病。臨床出現(xiàn)的各種名稱(chēng)（如干眼癥、干眼病及干眼綜合征等）均統(tǒng)一稱(chēng)為干眼[1]。近年干眼的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，已嚴(yán)重影響患者的生活和工作。本研究的前期臨床觀察證實(shí)，精草潤(rùn)目液治療干眼有良好療效，為進(jìn)一步探究其作用機(jī)制，觀察該滴眼液對(duì)干眼模型角膜上皮和淚液分泌量的影響進(jìn)行了本實(shí)驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑及藥品

選用SPF級(jí)健康SD大鼠60只，體質(zhì)量150～300 g，雌雄各半，由斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司提供（合格證編號(hào)：43004700016330），在湖南中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，并雙眼滴0.25%氯霉素滴眼液0.05 ml/(眼·次)，5次/d。實(shí)驗(yàn)前所有動(dòng)物經(jīng)裂隙燈（上海施惠醫(yī)療器械有限公司，SLM-2型）行外眼檢查，均無(wú)異常，可納入研究。

表1 角膜上皮損傷評(píng)分表

試劑：0.4%的鹽酸奧布卡因滴眼液：日本參天制藥株式會(huì)社。0.5%鹽酸利多卡因注射液：國(guó)藥集團(tuán)容生制藥有限公司。0.25%氯霉素滴眼液：四川美大康華康藥業(yè)有限公司。1%苯扎溴銨溶液：上海運(yùn)佳黃埔制藥有限公司。0.5%羧甲基纖維素鈉滴眼液：Allergan，InC。0.2%卡波姆滴眼液：Dr.Gerhard Mann，Chen.-pharm.Fabrik GmbH。0.9%NaCl注射液：湖南科倫制藥有限公司。0.5mg/ml阿托品注射液：苪城天通動(dòng)保藥業(yè)有限公司。2%熒光素鈉溶液，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)制劑室配置。Schirmer測(cè)定濾紙：天津晶新技術(shù)開(kāi)發(fā)公司。

精草潤(rùn)目液的制備：黃精浸泡后回流提取并濾過(guò)，減壓濃縮。濃縮液加活性炭，煮沸，放冷，冷藏靜置后抽濾，濾液在攪拌下加入乙醇使含醇量達(dá)到80%，濾過(guò)，取沉淀物，烘箱中干燥至恒重，即得黃精多糖。魚(yú)腥草蒸餾提取，收集芳香水。取魚(yú)腥草芳香水1000 ml及黃精多糖（高、中、低劑量組分別取黃靜多糖2 g、1.5 g、1 g，最終的藥物濃度分別為0.2%、0.15%、0.1%）。混合再加入氯化鈉攪勻，調(diào)pH值至7.0，高速離心，滅菌備用。溶劑的制備：將氯化鈉攪勻，加蒸餾水后調(diào)pH值至7.0，高速離心，滅菌備用。

裂隙燈顯微鏡、5 ml無(wú)菌注射器、5號(hào)針頭、鑷子、持針器、眼科剪、秒表、縫合針、1號(hào)黑絲線。

1.2 造模及分組

1.2.1 大鼠角膜上皮損傷干眼模型：用摘除淚腺后、滴加苯扎溴銨溶液的方法制備大鼠角膜上皮損傷干眼模型[3-4]。30只大鼠，雙眼周去毛、消毒，0.4%的奧布卡因表面麻醉，0.5%利多卡因1 ml球后麻醉，在大鼠耳前皮膚上剪一小口，剝離并摘除雙側(cè)淚腺，雙眼滴1%苯扎溴銨溶液，第2天觀察角膜情況。

分組及給藥：將造模成功的30只大鼠隨機(jī)分為5組，每組6只。第1組為空白對(duì)照組，用溶劑治療；第2組為陽(yáng)性藥物對(duì)照組，用0.5%羧甲基纖維素鈉滴眼液治療；第3、4、5組分別采用高、中、低劑量精草潤(rùn)目液治療。 滴眼液的使用：4 次/(眼·d)，0.05ml/次，用藥21 d。記錄用藥第7、14、21天角膜上皮損傷情況。

檢測(cè)方法及評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：熒光素鈉角膜染色采用5 ml注射器、5號(hào)針頭將熒光素鈉1滴滴入結(jié)膜囊內(nèi)，5 min后在裂隙燈顯微鏡藍(lán)光下觀察角膜上皮的情況，每周觀察1次。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[5]見(jiàn)表1。

1.2.2 淚液分泌低下大鼠模型：參照Burgalassi淚腺注射阿托品的方法進(jìn)行淚液分泌低下干眼動(dòng)物模型的造模[6]。30只大鼠，雙眼滴0.4%鹽酸奧布卡因滴眼液，在淚腺注射阿托品 0.25 ml/眼（0.5 mg/ml），予每日雙眼下淚腺注射阿托品4次，記錄每日注射阿托品0.5 h后大鼠淚液分泌試驗(yàn)的結(jié)果，持續(xù)注射至第7天。

分組及給藥：除陽(yáng)性藥物對(duì)照組采用0.2%卡波姆滴眼液治療外，余分組及給藥方法同前。記錄治療的第7、14、21天每只眼的淚液分泌量。

淚液分泌試驗(yàn)（SchirmerⅡ）：考慮SD大鼠眼球較小，不適合用適用于人類(lèi)大小的濾紙條測(cè)試，故采取將其剪成兩半的方式進(jìn)行檢測(cè)，以5 mm×35 mm濾紙一條，剪成兩個(gè)各2.5 mm×35 mm大小的濾紙，在首端處反折，輕巧地置于下瞼中后部1/3交界處，5 min后取出紙條，取出后2 min測(cè)濾紙濕長(zhǎng)，反復(fù)測(cè)3次，取平均值。每周觀察1次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以xˉ±s表示。大鼠造模前后淚液分泌量比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)；各組大鼠不同時(shí)期淚液分泌量和角膜上皮損傷評(píng)分值的比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠角膜上皮損傷干眼模型

治療前各組間的角膜上皮損傷評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），治療 7 d 及 14 d，低、中、高劑量組與陽(yáng)性藥物對(duì)照組相比，角膜上皮損傷評(píng)分差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；治療21 d，僅有精草潤(rùn)目液高劑量組的角膜損傷評(píng)分與陽(yáng)性藥物組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；其中精草潤(rùn)目液高劑量組的角膜損傷評(píng)分明顯低于中、低劑量組（P中=0.012，P低=0.001），中劑量組與低劑量組之間相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.151）（表 2）。

2.2 大鼠淚液分泌低下干眼模型

造模前，大鼠的淚液分泌量為（9.02±1.29）mm，造模后減少為（3.07±1.23） mm（t=4.326，P＜0.001），提示造模成功；造模前及造模后各組間淚液分泌量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說(shuō)明各組的淚液分泌量具有可比性；在治療7、14及21 d，低劑量組淚液分泌量始終低于陽(yáng)性藥物對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而在治療 21 d，精草潤(rùn)目液中、高劑量組的淚液分泌量明顯高于陽(yáng)性藥物對(duì)照組 （P＜0.05），并且高劑量組的淚液分泌量要高于中劑量組（P=0.018）（表 3）。

3 討論

干眼的發(fā)病，或由素體肺陰不足，燥熱犯目；或情志不舒，郁火內(nèi)生，津傷血壅；或久病、年老體衰、過(guò)用目力，陰津損耗；或風(fēng)熱眼或天行赤眼治療不徹底，余熱未清等，致津液虧虛，目失濡潤(rùn)而生燥。精草潤(rùn)目液選用黃精和魚(yú)腥草兩味藥組方。黃精有補(bǔ)氣滋陰的功效，黃精多糖是黃精生物活性物質(zhì)的一個(gè)非常重要的成分，具有一定的抗氧化、提高免疫力、抗菌抗炎及調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)分泌等作用[7]，用黃精多糖制成的滴眼液有抗炎、抗病毒、抗?jié)B出、抗增生的作用[8]。魚(yú)腥草的成分復(fù)雜，其中揮發(fā)油成分主要為癸酰乙醛（魚(yú)腥草素）及月桂醛，而癸酰乙醛對(duì)多種細(xì)菌有明顯的抑制作用，魚(yú)腥草還具有增強(qiáng)免疫功能、增加白細(xì)胞吞噬能力和促進(jìn)組織再生等作用，對(duì)增加機(jī)體免疫能力、抑制干眼引起的眼表上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)有一定療效[9]，既往有應(yīng)用魚(yú)腥草制劑治療干眼的報(bào)道[10]。

表2 各組角膜上皮損傷干眼模型大鼠的角膜上皮損傷評(píng)分比較（xˉ±s，n=12）

表3 各組淚液分泌低下干眼模型大鼠的淚液分泌量（Schirmer II試驗(yàn)）比較（xˉ±s,mm，n=12）

臨床上治療干眼主要應(yīng)用人工淚液治療。羧甲基纖維素鈉滴眼液是具有代表性的一種人工淚液，它具有較強(qiáng)的黏稠性，是一種較理想的角膜表面潤(rùn)滑劑，能對(duì)角膜、結(jié)膜提供良好的濕潤(rùn)作用，而完整和有效的淚液成分和淚膜分布能加速角膜上皮的愈合，減輕角膜痛覺(jué)，利于減輕刺激癥狀。唯地息是由德國(guó)生產(chǎn)的含有0.2%卡波姆的親水凝膠,由固相基質(zhì)和水相分散層組成,類(lèi)似淚膜的二層結(jié)構(gòu)即黏液層和水層,可在眼球表面形成液體儲(chǔ)庫(kù),每眨眼1次凝膠中的水分即可部分釋放以補(bǔ)充淚液,因此唯地息可適用于淚液分泌減少的替代治療。相比而言，羧甲基纖維素鈉滴眼液對(duì)角膜的保護(hù)作用更好，而且不含防腐劑，避免了防腐劑對(duì)眼表的再次損傷，故用于第一種模型；卡波姆滴眼液補(bǔ)充淚液的作用更強(qiáng)，且為凝膠制劑，作用更持久，是淚液的良好替代品，更適合于第二種動(dòng)物模型。

干眼的治療目標(biāo)是重建高質(zhì)量穩(wěn)定的淚膜，緩解癥狀，促使角膜上皮愈合，減少淚膜異常相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生?；诖耍覀兎謩e觀察了精草潤(rùn)目液對(duì)角膜上皮損傷大鼠和淚液分泌低下大鼠的影響。在角膜上皮損傷模型，用藥干預(yù)21 d后，高劑量組角膜損傷評(píng)分明顯低于陽(yáng)性藥物治療組。在淚液分泌低下模型，高、中劑量組的淚液分泌量有隨治療時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加的趨勢(shì)，用藥21 d時(shí)，這兩組的淚液分泌量明顯高于陽(yáng)性藥物對(duì)照組，而低劑量組干預(yù)后的淚液分泌量始終低于陽(yáng)性藥物對(duì)照組。上述結(jié)果提示，足夠濃度的精草潤(rùn)目液在治療一定時(shí)間后，對(duì)于修復(fù)角膜損傷、促進(jìn)淚液分泌均有明顯作用，藥物的療效與藥物的濃度及治療時(shí)間相關(guān)?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為炎癥是各種不同類(lèi)型干眼的共有發(fā)病機(jī)制[11-14]，即慢性炎癥通過(guò)刺激眼表細(xì)胞激活局部的免疫反應(yīng)，引起淚膜穩(wěn)定性下降，增加淚液滲透壓，繼而導(dǎo)致干眼的發(fā)生。我們因此推測(cè)，精草潤(rùn)目液的作用機(jī)制可能與對(duì)炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用有關(guān)。

綜上所述，精草潤(rùn)目液能明顯減輕干眼大鼠模型的角膜上皮損傷，并增加淚液分泌，在適當(dāng)?shù)臐舛燃爸委煏r(shí)間下，其療效優(yōu)于陽(yáng)性藥物（羧甲基纖維素鈉滴眼液及卡波姆滴眼液）。精草潤(rùn)目液的藥效機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。