氮摻雜納米二氧化鈦對(duì)3種常見(jiàn)病菌抑菌效果的研究*

閆 磊 盧 怡 陸林杰 王瀟宇 張震芳 蘇 方 白春繼

納米二氧化鈦(TiO2)是一種無(wú)機(jī)光催化抑菌材料，自1972年日本科學(xué)家Fujishima和Honda發(fā)現(xiàn)了TiO2在紫外光照射下可以催化降解水的現(xiàn)象以來(lái)[1]，研究表明，光催化納米TiO2可通過(guò)抑制菌斑獲得性膜的形成、破壞細(xì)菌細(xì)胞壁、細(xì)胞膜以及DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)等機(jī)制抗菌[2]。

眾所周知，口腔環(huán)境中存在大量的微生物，而口腔診療過(guò)程中易飛濺血液、唾液，如果感染控制不完善，極易引發(fā)院內(nèi)感染[3]。近年來(lái)，隨著納米TiO2技術(shù)逐漸向口腔領(lǐng)域的滲透，其廣譜抗菌、凈化空氣等特性的發(fā)現(xiàn)為減少醫(yī)院獲得性感染，提高口腔感染控制效果奠定了重要基礎(chǔ)。Aita等[4]報(bào)道了紫外線照射TiO2植體可有效減少口內(nèi)細(xì)菌附著以及菌斑形成，我國(guó)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)[5]，光催化TiO2：C涂層可有效改善種植體材料的抗菌性，對(duì)變形鏈球菌、血鏈球菌、牙齦卟啉單胞菌抗菌性強(qiáng)，可改善種植體周?chē)椎陌l(fā)生率。此外，光催化納米TiO2對(duì)診室醫(yī)療設(shè)備及環(huán)境空氣中金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白色念珠菌的殺滅率均高達(dá)99%以上，對(duì)乙肝表面抗原也有破壞作用，并可使內(nèi)毒素降解，表現(xiàn)出了良好的消毒效果[6]。

但納米TiO2只有在紫外光照射下才能激發(fā)產(chǎn)生作用，大大限制了在可見(jiàn)光環(huán)境下的應(yīng)用。本課題組的合作單位北京科技大學(xué)在前期研究中使用氮摻雜技術(shù)成功制備了氮摻雜納米二氧化鈦(納米N-TiO2)噴劑，使得該材料在可見(jiàn)光照射下即可被激發(fā)，突破了這一應(yīng)用局限[7,8]。

其中金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、白色念珠菌分別是革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌和真菌的代表菌種，也是醫(yī)療環(huán)境中物體表面的常見(jiàn)病菌，所以將其作為抑菌試驗(yàn)的殺滅對(duì)象具有代表性[9]。本研究是在實(shí)驗(yàn)室條件下探究納米N-TiO2對(duì)以上3種病菌的抑菌效果，為進(jìn)一步深入研究本材料對(duì)其他病菌的抑菌效果和將該材料的實(shí)際抑菌應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)所用的抑菌材料氮摻雜納米二氧化鈦(納米N-TiO2)噴劑是成品材料，為測(cè)定其真實(shí)抑菌性能故要求實(shí)驗(yàn)中不應(yīng)改變它的性質(zhì)，同時(shí)目前尚無(wú)氮摻雜納米二氧化鈦在24h以內(nèi)的抑菌效果報(bào)告，故本實(shí)驗(yàn)根據(jù)《消毒技術(shù)規(guī)范(2012年版)》設(shè)計(jì)，采用“載體浸泡定量殺菌試驗(yàn)”和“抑菌環(huán)試驗(yàn)”兩種方法，前者在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)0.5、1、2、3、4h共5個(gè)時(shí)間段進(jìn)行檢測(cè)，后者按該規(guī)范進(jìn)行觀察[10]。

1.材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

1.1.1 抑菌劑 納米N-TiO2噴劑(主要有效成分為氮摻雜的銳鈦礦型納米TiO2，平均粒徑＜65nm，噴劑pH=7-8；不溶于水，不溶于稀堿、稀酸，溶于熱濃硫酸、鹽酸、硝酸，相對(duì)密度3.8-3.9g/cm2，熱穩(wěn)定性好，室溫條件下可穩(wěn)定存儲(chǔ)超過(guò)120d以上，由北京科技大學(xué)提供)，有效成分是1 wt%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的納米N-TiO2懸濁液。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)菌株和培養(yǎng)基

(1)金黃色葡萄球菌(CGMCC 1.2465)，培養(yǎng)基為營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基；

(2)大腸埃希氏菌(CGMCC 1.3373)，培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基；

(3)白色念珠菌(CCTCC AY 93025)，培養(yǎng)基為沙氏培養(yǎng)基。

1.1.3 其他試劑

(1)稀釋液：1%胰蛋白胨生理鹽水溶液(TPS)；

(2)洗脫液：含0.1%吐溫-80的磷酸鹽緩沖液(PBS)。

1.2 實(shí)驗(yàn)器材

(1)超凈臺(tái)：海爾生物安全柜，型號(hào)HR40-ⅡA2型，青島海爾醫(yī)用低溫科技有限公司；

(2)恒溫培養(yǎng)箱：振蕩培養(yǎng)箱SPX-150B-D型，箱內(nèi)自帶40w功率日光燈，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；

(3)移液器：Genex Beta(20-200μL、100-1000μL)，芬蘭百得實(shí)驗(yàn)室儀器蘇州有限公司；

(4)漩渦混合器：VORTEX-5型，上海書(shū)培實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；

(5)游標(biāo)卡尺：滬制01130048，上海恒量量具有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 載體浸泡定量殺菌試驗(yàn)

(1)試驗(yàn)用菌懸液的制備：取以上菌種24h的新鮮培養(yǎng)斜面，在無(wú)菌條件下取單個(gè)菌落投入相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，分別在37℃環(huán)境下振蕩培養(yǎng)至一定時(shí)間(金黃色葡萄球菌和大腸桿菌為6 h，白色念珠菌為12 h)，吸取1 mL菌懸液裝入無(wú)菌玻璃試管中，稀釋至約為3×108cfu/mL的濃度。

(2)菌片的制備：制備10mm×10mm無(wú)菌干燥的脫脂白平紋布片作為載體，吸取10μL稀釋菌懸液滴染于載體，并置于37℃無(wú)菌環(huán)境下緩慢干燥制成菌片備用。

(3)殺菌試驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)組將菌片輕輕放入裝有5mL納米N-TiO2噴劑的無(wú)菌平皿中，并使兩者充分接觸，然后將平皿置于室溫25℃、日光燈照射(日光燈功率40w，平皿距離日光燈約30cm)環(huán)境下，作用至預(yù)定時(shí)間；對(duì)照組操作同上，以TPS代替納米N-TiO2噴劑。

(4)培養(yǎng)計(jì)數(shù)：作用至相應(yīng)時(shí)間后，在無(wú)菌環(huán)境下將菌片取出，投入裝有5 mL洗脫液的試管中，用漩渦混合器振蕩混合30 s，將菌從載體上洗下獲得菌懸液，然后按照《活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)技術(shù)》進(jìn)行培養(yǎng)計(jì)數(shù)。

(5)結(jié)果計(jì)算：以上試驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算殺滅對(duì)數(shù)值：

殺滅對(duì)數(shù)值(KL)=對(duì)照組菌落對(duì)數(shù)值(Na0)-實(shí)驗(yàn)組菌落對(duì)數(shù)值(Nas)，其中，a為作用時(shí)間(h)，0表示對(duì)照組，s表示實(shí)驗(yàn)組。

(6)評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)：殺滅對(duì)數(shù)值KL≥3者，判定為有抑菌效果；3次結(jié)果均有抑菌效果者為消毒合格。

1.3.2 抑菌環(huán)試驗(yàn)

(1)試驗(yàn)用菌懸液的制備：操作同1.3.1，將菌懸液稀釋至約3×106cfu/mL的濃度。

(2)抑菌試驗(yàn)樣片的制備：實(shí)驗(yàn)組取直徑為5mm無(wú)菌干燥的濾紙片，每片滴加20μL納米N-TiO2噴劑，在37℃無(wú)菌環(huán)境下干燥后備用；對(duì)照組取同樣的濾紙片，每片滴加無(wú)菌蒸餾水。

(3)染菌平板的制備：在無(wú)菌環(huán)境下用無(wú)菌棉拭子蘸取1.3.1制備的菌懸液，在相應(yīng)的固體培養(yǎng)基平板上均勻涂抹3次，每涂抹1次后將平板應(yīng)轉(zhuǎn)動(dòng)60°繼續(xù)涂抹，最后將棉拭子繞平板邊緣涂抹一周，最后蓋好平皿，置室溫干燥5min。

(4)抑菌試驗(yàn)樣片的放置：每個(gè)平板貼放4個(gè)實(shí)驗(yàn)組樣片和1個(gè)對(duì)照組樣片，其中實(shí)驗(yàn)組樣片放在平板四周，對(duì)照組樣片放在平板中心。注意樣片的藥液面必須與瓊脂面完全密合，各樣片中心點(diǎn)之間相距25mm以上，與平板的周緣相距15mm以上。貼放完畢后，將培養(yǎng)皿倒置(藥液面接受光照)，置于室溫25℃、日光燈照射(日光燈功率40w，平皿距離日光燈約30cm)環(huán)境下培養(yǎng)18h。

(5)結(jié)果測(cè)量：試驗(yàn)重復(fù)3次。用游標(biāo)卡尺(精度0.02mm)測(cè)量抑菌環(huán)的直徑(包括貼片)并記錄。測(cè)量抑菌環(huán)時(shí)，應(yīng)選均勻而完全無(wú)菌生長(zhǎng)的抑菌環(huán)進(jìn)行，測(cè)量其直徑應(yīng)以抑菌環(huán)外沿為界。

(6)評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)：實(shí)驗(yàn)組樣片抑菌環(huán)直徑＞7mm者，判定為有抑菌效果；抑菌環(huán)直徑小于或等于7mm者，判為無(wú)抑菌作用；3次重復(fù)試驗(yàn)均有抑菌作用結(jié)果者，判定為消毒合格；同時(shí)，對(duì)照組應(yīng)無(wú)抑菌環(huán)產(chǎn)生，否則試驗(yàn)無(wú)效。

2.結(jié)果

2.1 載體浸泡定量殺菌試驗(yàn) 納米N-TiO2噴劑對(duì)3種病菌作用0.5，1，2，3，4h，再經(jīng)培養(yǎng)計(jì)數(shù)后計(jì)算得出的殺滅對(duì)數(shù)值分別見(jiàn)表1至表3。結(jié)果顯示納米N-TiO2噴劑對(duì)金黃色葡萄球菌作用1h以及對(duì)大腸埃希氏菌、白色念珠菌作用0.5h達(dá)到殺滅對(duì)數(shù)值＞3。

表1 納米N-TiO2噴劑對(duì)金黃色葡萄球菌的殺滅對(duì)數(shù)值

表2 納米N-TiO2噴劑對(duì)大腸埃希氏菌的殺滅對(duì)數(shù)值

表3 納米N-TiO2噴劑對(duì)白色念珠菌的殺滅對(duì)數(shù)值

2.1 抑菌環(huán)試驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)組樣片對(duì)3種病菌產(chǎn)生的抑菌環(huán)直徑見(jiàn)表4至表6，同時(shí)對(duì)照組樣片均未產(chǎn)生抑菌環(huán)。結(jié)果顯示，納米N-TiO2噴劑對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、銅綠假單胞菌、鮑氏不動(dòng)桿菌作用18h后產(chǎn)生直徑＞7mm的清晰抑菌環(huán)，而對(duì)白色念珠菌則未產(chǎn)生抑菌環(huán)(圖1-圖3)。

表4 納米N-TiO2噴劑對(duì)金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的抑菌環(huán)直徑(mm)

表5 納米N-TiO2噴劑對(duì)大腸埃希氏菌產(chǎn)生的抑菌環(huán)直徑(mm)

表6 納米N-TiO2噴劑對(duì)白色念珠菌產(chǎn)生的抑菌環(huán)直徑(mm)

圖1 納米N-TiO2噴劑對(duì)金黃色葡萄球菌產(chǎn)生抑菌環(huán)圖注：抑菌環(huán)直徑＞7mm

圖2 納米N-TiO2噴劑對(duì)大腸埃希氏菌產(chǎn)生抑菌環(huán)圖注：抑菌環(huán)直徑＞7mm

圖3 納米N-TiO2噴劑對(duì)白色念珠菌未產(chǎn)生抑菌環(huán)

3.討論

抗菌劑一般分有機(jī)抗菌劑、無(wú)機(jī)抗菌劑和天然抗菌劑。有機(jī)抗菌劑抗菌機(jī)理主要是與細(xì)菌和霉菌的細(xì)胞膜表面的陰離子相結(jié)合或與巰基反應(yīng)，破壞蛋白質(zhì)和細(xì)胞膜的合成系統(tǒng)，從而抑制細(xì)菌和霉菌的繁殖[11]。有機(jī)抗菌劑具有殺菌迅速，殺菌力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，但同時(shí)具有殘留物有一定毒性、穩(wěn)定性差易分解、效果持續(xù)時(shí)間短等缺點(diǎn)。無(wú)機(jī)抗菌劑包括重金屬類和光催化類。無(wú)機(jī)抗菌劑的優(yōu)點(diǎn)是具有安全性、耐熱性、耐久性、持續(xù)性，不足之處是部分材料價(jià)格昂貴，不具有有機(jī)抗菌劑的速效性[12]。天然抗菌劑大多數(shù)是從動(dòng)植物中提煉精制而成的，使用安全，無(wú)毒副作用，但加工困難、耐熱性差。

納米TiO2作為近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種新型無(wú)機(jī)光催化型抗菌劑，因具有來(lái)源豐富、價(jià)格低廉、清潔無(wú)污染、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定[13]受到各國(guó)科學(xué)家的廣泛關(guān)注。納米TiO2主要成分為氮摻雜N-TiO2粉，粒徑在10-15nm,相對(duì)密度3.8-3.9g/cm3熱穩(wěn)定性佳，易去除，廣泛應(yīng)用于污水處理、空氣凈化、醫(yī)藥和化妝品等領(lǐng)域。由于TiO2的禁帶寬度(3.2eV)較大，相當(dāng)于波長(zhǎng)為387nm光的能量[14]，正好處于紫外區(qū)，故以納米TiO2作為光催化劑產(chǎn)生光催化氧化反應(yīng)需要紫外線作為光源。紫外光在太陽(yáng)光能中只占3%-5%，而占太陽(yáng)能45%的可見(jiàn)光不能被利用，極大限制了納米TiO2材料的應(yīng)用環(huán)境范圍，因此將納米TiO2的光響應(yīng)拓寬至可見(jiàn)光區(qū)具有重要的研究意義。

迄今國(guó)內(nèi)外研究者對(duì)此做了大量工作，如表面光敏化[15]、半導(dǎo)體復(fù)合[16]、貴金屬沉積[17]、金屬元素?fù)诫s[18]、非金屬元素?fù)诫s[19]等。北京科技大學(xué)曹文斌課題組[20]自2003年開(kāi)始相關(guān)研究，采用同步晶化與氮摻雜工藝制備了氮摻雜納米二氧化鈦粉體，實(shí)現(xiàn)了納米粉體的規(guī)?；苽?，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步制備了以無(wú)機(jī)助劑為分散系的納米N-TiO2噴劑。本產(chǎn)品可以高效利用室內(nèi)波長(zhǎng)在520nm以下的自然光線，在室內(nèi)自然光照射環(huán)境下將光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能，使納米N-TiO2表面發(fā)生電子躍遷，躍遷產(chǎn)生的電子和空穴在納米材料表面與所吸附的氧氣和水反應(yīng)，產(chǎn)生大量羥基自由基(·OH)和超氧自由基(O2-)，這兩種基團(tuán)具有很強(qiáng)的化學(xué)反應(yīng)活性，足以將構(gòu)成蛋白質(zhì)等有機(jī)物的C-H、C-O、C-N等化學(xué)鍵分解，最終生成無(wú)毒無(wú)味無(wú)污染的二氧化碳(CO2)、水(H2O)及一些簡(jiǎn)單的無(wú)機(jī)物，故而能夠連續(xù)破壞與之接觸的細(xì)菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，使細(xì)菌喪失了受損的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的修復(fù)功能，引起細(xì)胞內(nèi)容物的流失，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡，達(dá)到殺滅或抑制細(xì)菌的目的[21]。納米N-TiO2在起到殺菌作用的同時(shí)自身作為催化劑并不發(fā)生任何變化，反應(yīng)的分解產(chǎn)物也不會(huì)產(chǎn)生二次污染，具有長(zhǎng)效持久、綠色無(wú)污染的突出優(yōu)點(diǎn)。

本研究的目的是為了檢測(cè)成品材料納米N-TiO2噴劑對(duì)3種代表病菌的抑菌效果，只有在盡量不改變噴劑的各項(xiàng)理化性質(zhì)的前提下才能反映噴劑的真實(shí)抑菌性能。故選用“載體浸泡定量試驗(yàn)”和“抑菌環(huán)試驗(yàn)”這兩種方法，由于前者的試驗(yàn)結(jié)果具有定量比較性，后者則具有直觀比較性。

“載體浸泡定量試驗(yàn)”的結(jié)果顯示，在該試驗(yàn)條件下納米N-TiO2噴劑對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、白色念珠菌分別作用1h、0.5h、0.5h即能達(dá)到消毒效果，對(duì)三種病菌的抑菌效果依次為金黃色葡萄球菌＜大腸埃希氏菌＜白色念珠菌?！耙志h(huán)試驗(yàn)”的結(jié)果顯示，在該試驗(yàn)條件下納米N-TiO2噴劑對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌具有明顯的抑菌效果，對(duì)白色念珠菌不具有抑菌效果。由此可見(jiàn)，納米N-TiO2噴劑對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌的試驗(yàn)結(jié)果是一致的，但對(duì)于白色念珠菌來(lái)說(shuō)結(jié)果卻不太一致。

白色念珠菌屬于真菌，真菌具有雙相性，可以在不同條件下以酵母相或菌絲相為主存在。有研究表明，真菌的表型轉(zhuǎn)換是其重要的致病因素，菌絲的形成使真菌更易入侵和逃避宿主的免疫防御[22]，而真菌菌絲的形成與諸多因素有關(guān)，如培養(yǎng)基成分、溫度、CO2誘導(dǎo)劑、真菌孢子濃度[23,24]等。為了初步驗(yàn)證涂板的真菌菌液濃度對(duì)抑菌環(huán)大小的影響，以大腸埃希氏菌為參照，在“抑菌環(huán)試驗(yàn)”中將涂板的大腸埃希氏菌、白色念珠菌濃度稀釋在原試驗(yàn)的基礎(chǔ)上再稀釋10倍，結(jié)果仍舊同前一致，對(duì)大腸埃希氏菌平板產(chǎn)生了大于7mm的抑菌環(huán)(圖4)，對(duì)白色念珠菌平板依舊不產(chǎn)生抑菌環(huán)(圖5)。根據(jù)以上試驗(yàn)結(jié)果，猜測(cè)由于納米N-TiO2的光催化抑菌效果相對(duì)有機(jī)抑菌材料來(lái)講比較緩慢，在“抑菌環(huán)試驗(yàn)”中光催化反應(yīng)初期產(chǎn)生的羥基自由基(·OH)和超氧自由基(O2-)，無(wú)法完全殺滅所接觸到的所有白色念珠菌，同時(shí)又可能促使一定比例的真菌體在這種刺激下從抗性較弱的酵母相轉(zhuǎn)化為抗性很強(qiáng)的菌絲相，由于和培養(yǎng)瓊脂緊密接觸的菌體可以獲得充足的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，以致光催化殺滅作用無(wú)法繼續(xù)殺滅試驗(yàn)樣片周?chē)欢ǚ秶鷥?nèi)的剩余菌絲相白色念珠菌，待白色念珠菌培養(yǎng)到一定時(shí)間后即能在肉眼狀態(tài)下可見(jiàn)瓊脂板上沒(méi)有產(chǎn)生抑菌環(huán)。金黃色葡萄球菌的細(xì)胞壁含90%的肽聚糖和10%的磷壁酸，大腸埃希氏菌則具有由肽聚糖組成的細(xì)胞壁，帶有鞭毛具備一定的運(yùn)動(dòng)能力，但通過(guò)上述試驗(yàn)證明這兩種細(xì)菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)顯然在羥基自由基(·OH)和超氧自由基(O2-)的強(qiáng)氧化能力下即可被破壞致細(xì)菌死亡。在“抑菌環(huán)試驗(yàn)”中觀察到納米N-TiO2對(duì)白色念珠菌未產(chǎn)生抑菌環(huán)，并不能說(shuō)明納米N-TiO2對(duì)白色念珠菌無(wú)消毒效果，“載體浸泡定量試驗(yàn)”中由于病菌完全浸泡在納米N-TiO2噴劑內(nèi)，無(wú)充足營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，其結(jié)果顯示納米N-TiO2對(duì)白色念珠菌的殺滅能力反而比對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸埃希氏菌還要強(qiáng)。

圖4 納米N-TiO2噴劑對(duì)大腸埃希氏菌產(chǎn)生抑菌環(huán)圖注：抑菌環(huán)直徑＞7mm

圖5 納米N-TiO2噴劑對(duì)白色念珠菌未產(chǎn)生抑菌環(huán)

通過(guò)本研究，確定了納米N-TiO2噴劑對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、白色念珠菌均具有良好的抑菌效果，在不同的實(shí)驗(yàn)環(huán)境中對(duì)不同病菌效果的抑菌效果也是有差異的。北京科技大學(xué)曹文斌課題組[25]研發(fā)納米N-TiO2可拓寬TiO2光響應(yīng)范圍，提高光催化率及抑菌效率[26]。本課題組前期進(jìn)行了納米N-TiO2的體外細(xì)胞毒性研究，初步證實(shí)納米N-TiO2具有人體應(yīng)用的生物安全基礎(chǔ)[27]，又通過(guò)研究證實(shí)了納米N-TiO2噴劑對(duì)口腔科光固化燈光導(dǎo)棒具有很強(qiáng)的消毒作用[28]。本次實(shí)驗(yàn)采用功率為40W的日光燈模擬室內(nèi)自然光作為光源，在本條件下進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為納米N-TiO2的在室內(nèi)可見(jiàn)光環(huán)境下的廣泛應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。需要注意的是，要將本材料在臨床中進(jìn)一步推廣應(yīng)用，還涉及到對(duì)其他醫(yī)院環(huán)境污染病菌的抑菌效果、材料的生物安全性以及在實(shí)際環(huán)境中多種病菌污染、其他有機(jī)物干擾、氣溫濕度影響等情況下的消毒效果等問(wèn)題，需要在以后繼續(xù)開(kāi)展研究逐步解決。

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