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    皺皮香豬3 個基因組拷貝數(shù)變異的多態(tài)性分布

    2019-06-18 01:19:50冉雪琴黃世會王嘉福
    中國畜牧雜志 2019年6期
    關(guān)鍵詞:白豬拷貝數(shù)變異

    王 州,冉雪琴*,牛 熙,李 升,黃世會,王嘉福,2*

    (1.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院,山地植物資源保護(hù)與保護(hù)種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點實驗室,貴州貴陽 550025;2. 銅仁學(xué)院,貴州銅仁 554300)

    香豬體軀短圓,脂肪沉積能力強,屬于脂肪型豬品種[1]。香豬主產(chǎn)區(qū)位于貴州省從江縣月亮山區(qū)。皺皮香豬是從正常香豬群體分離而來,存在于不同豬場,在香豬群體中呈散發(fā)性存在,皺皮香豬作為親本產(chǎn)生的后代中大約三分之一有皺皮性狀,其主要特征是皺皮香豬軀干部皮膚表皮層和真皮層明顯增厚,皮膚彈性差,背部以后皮下脂肪層變薄,后軀體側(cè)特別是臀部皮膚褶皺明顯。皮膚是動物機(jī)體最大的器官,從外到內(nèi)分為表皮層、真皮層和皮下組織,具有保護(hù)機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、物質(zhì)吸收、感受外界刺激、分泌、排泄、調(diào)節(jié)體溫、參與新陳代謝和免疫反應(yīng)等生理功能[2]。對中國沙皮犬的皮膚表型和周期性發(fā)熱綜合癥進(jìn)行的研究證明,透明質(zhì)酸合成酶2(Hyaluronan Synthase 2,HAS2)基因上游約350 kb 處一段16.1 kb 的不穩(wěn)定重復(fù)是導(dǎo)致沙皮犬周期性發(fā)熱、透明質(zhì)酸沉積、皮膚大量褶皺的主要原因[3]?;蛑械闹貜?fù)變異屬于基因組拷貝數(shù)變異范疇??截悢?shù)變異(Copy Number Variation,CNV)是與表型變異和疾病易感性相關(guān)的遺傳變異的重要來源[4]。CNV 包括1 kb 到若干Mb 范圍內(nèi)的重復(fù)、插入、缺失和復(fù)雜多位點的微觀和亞微觀結(jié)構(gòu)變異[5]。與單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphisms,SNP) 相 比,CNV 對基因組結(jié)構(gòu)和序列區(qū)域的影響更大,通過改變基因的結(jié)構(gòu)和劑量、影響基因調(diào)控元件和暴露隱性等位基因等方式影響基因的表達(dá)量,并引起表型差異和表型適應(yīng)性變化[6]。過去幾年中,在人、豬、雞、牛和羊等多種生物中進(jìn)行了大量的全基因組CNV 研究[7-13],多數(shù)CNV 出現(xiàn)在富含基因的區(qū)域,主要與一些復(fù)雜性狀、疾病易感性及物種進(jìn)化相關(guān)。如Agouti 信號蛋白(Agouti Signaling Protein,ASIP)基因編碼區(qū)重復(fù)可能與綿羊的色素沉著有關(guān)[14]。涉及3 個成纖維細(xì)胞生長因子FGF3、FGF4 和FGF19 基因的133 kb 重復(fù)和ORAOV1 的復(fù)制使犬毛發(fā)脊和皮樣竇的易感性增加[15]。SOX5 內(nèi)含子1 的拷貝數(shù)增加導(dǎo)致雞的豌豆冠[16]。在相同遺傳背景的人群中,CCL3L1(MIP-1alphaP)基因拷貝數(shù)下降與人免疫缺陷病毒(HIV)/ 獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)易感性增強相關(guān)[17],還與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)有顯著關(guān)聯(lián)[18]。KIT 基因拷貝數(shù)增加導(dǎo)致歐洲豬白毛色和白斑表型[19-20],但榮昌豬的白毛色可能與KIT 基因的CNV 沒有直接聯(lián)系[21]。這些研究提示,基因中的CNV 可能影響動物的生長發(fā)育、疾病易感性,以及飼料利用率、生育力和產(chǎn)奶量等多種表型,但可能具有品種特異性。

    為探究香豬皺皮個體產(chǎn)生皮膚褶皺的原因,本文利用香豬皺皮個體全基因組測序數(shù)據(jù),與豬參考基因組序列、大白豬、長白豬全基因組重測序數(shù)據(jù)相比較,得到5 538 個CNVs,從中選取3 個候選CNVs,研究皺皮香豬個體與正常香豬之間的群體變異規(guī)律。

    1 材料與方法

    1.1 CNV 信息 基于重測序數(shù)據(jù)預(yù)測基因組拷貝數(shù)變異,去重得到非冗余的CNVs,從中選取3 個CNVs 進(jìn)行群體比較研究。CNVs 基本信息見表1。

    1.2 材料 30 頭正常香豬和30 頭皺皮香豬(圖1)的耳組織采于貴州大山地生態(tài)養(yǎng)殖有限責(zé)任公司豬場,30頭大白豬血樣采于貴州畢節(jié)。

    圖1 皺皮香豬(上)和正常香豬(下)皮膚褶皺比較

    1.3 主要試劑 血液/組織基因組提取試劑盒、膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒和熒光染料SYBR 均購自北京天根生化科技有限公司;大腸桿菌DH5α(實驗室保存);pGEM-T Easy Vector 購自普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司。酶標(biāo)儀購自美國Bio Tech 公司;定量PCR儀(CFX96)為美國Bio-Rad 公司設(shè)備。

    1.4 DNA 提取 參照基因組提取試劑盒說明書提取樣品基因組DNA,質(zhì)檢合格存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

    1.5 引物設(shè)計 根據(jù)豬參考基因組序列(Scrofa 11.1),使用Primer Premier 5.0 設(shè)計檢測CNVs 的特異性引物,以單拷貝的GCG(Glucagon)為內(nèi)參,以DNAstar 分析引物的二級結(jié)構(gòu),mFold 在線預(yù)測(http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/DNA-Folding-Form)目的片段的發(fā)卡結(jié)構(gòu),NCBI 網(wǎng)站的Blastn(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)程序分析引物的特異性。引物由英濰捷基貿(mào)易有限公司合成(表2)。

    表2 引物序列

    1.6 基因片段擴(kuò)增與測序 以基因組DNA 為模板,使用20 μL PCR 反應(yīng)體系:基因組DNA 1 μL,10 pmol/L 的上、下 游 引 物 各0.5 μL,2×PCR Mix 10 μL, 三 餾 水8 μL。PCR 反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min;95℃變性30 s,58℃退火30 s,72℃延伸40 s,35 個循環(huán);72℃延伸10 min。取60 μL PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測,回收目的片段,連接pGEM-T Easy Vector 載體,轉(zhuǎn)化DH5α 菌,克隆得到陽性菌株,由貴州明涵生物科技有限公司測定核苷酸序列,提取重組質(zhì)粒DNA。

    表1 CNVs 基本信息

    1.7 qPCR 檢測拷貝數(shù)變異 將重組質(zhì)粒DNA 按10 倍濃度梯度稀釋(10-2~10-7),作為qPCR 擴(kuò)增的模板,建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。qPCR 反應(yīng)體系10 μL:2 × SYBR Green Supper mix 5 μL,模板1 μL,濃度為10 pmol/L 的上、下游引物各0.3 μL,三蒸水3.4 μL。PCR 反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性10 min;95℃變性10 s,60℃退火30 s,共40 個循環(huán) 。熔解曲線55℃至95℃,遞增速度為0.5℃/5s。采用相對定量的方法測定樣本基因組中CNVs 的拷貝數(shù),每個反應(yīng)設(shè)3 次技術(shù)重復(fù),以GCG 基因作為內(nèi)參基因,利用2-ΔCt進(jìn)行定量分析,依據(jù)文獻(xiàn)[22]方法確定樣品的拷貝數(shù)類型。

    1.8 CNV 基因注釋及功能分析 使用Ensembl 的VEP(http://asia.ensembl.org/Tools/VEP)工具注釋CNV 中的基因,使用Kobas3.0(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/anno_iden.php)作KEGG 和GO 富集分析,使用Panther(http://www.pantherdb.org/)分析基因的功能,使用Animal QTL Database(https://www.animalgenome.org/cgi-bin/QTLdb/SS/search)分析CNVs中的QTL 類型。

    1.9 統(tǒng)計分析 數(shù)據(jù)按CNV 類型進(jìn)行統(tǒng)計,計算各組CNV 類型的分布頻率,包括拷貝數(shù)正常、拷貝數(shù)缺失、拷貝數(shù)增加3 種類型,通過SPSS 20.0 設(shè)置交叉表采用卡方檢驗分析CNVs 類型間的差異顯著性。

    2 結(jié) 果

    2.1 基因片段克隆與測序 以樣品基因組DNA 為模板,采用特異性引物擴(kuò)增目的片段,經(jīng)克隆測序,3 個CNVs 擴(kuò)增片段與豬參考基因組(Scrofa11.1)序列的相似性均為99%,GCG 基因為100%。說明獲得的擴(kuò)增片段確實為豬基因組目的序列。

    2.2 豬群基因組CNV 檢測

    2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 以10 倍梯度稀釋的重組質(zhì)粒為模板,經(jīng)qPCR 擴(kuò)增繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。CNV1、CNV2 和CNV3 和GCG 基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線呈線性,相關(guān)系數(shù)R2均在大于0.990,擴(kuò)增效率在100%±10%(表3)。3 個CNVs 基因及內(nèi)參GCG 基因定量引物的熔解曲線峰型單一,無雜峰;擴(kuò)增曲線均呈S 形,拐點清楚,曲線整體平行性良好,曲線指數(shù)期的斜率與擴(kuò)增效率呈正比,基線平直(圖2~5)。表明擴(kuò)增產(chǎn)物為單一的特異性產(chǎn)物,無引物二聚體等非特異性擴(kuò)增產(chǎn)生,可以用2-ΔCt方法對基因進(jìn)行相對定量。

    表3 標(biāo)準(zhǔn)曲線和擴(kuò)增效率

    圖2 CNV1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

    圖3 CNV2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

    圖4 CNV3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

    圖5 GCG 基因標(biāo)準(zhǔn)曲線

    2.2.2 3 個CNVs 的群體拷貝數(shù)變異規(guī)律 以基因組DNA為模板,采用熒光定量PCR 對90 頭豬進(jìn)行拷貝數(shù)檢測表明, 3 個CNVs 真實存在,組間CNVs 分布頻率不同,NR 值于0.01~7.4 范圍[22]。3 個群體中,拷貝數(shù)缺失型變異主要以純合缺失為主,拷貝數(shù)增加型變異主要以雙拷貝增加和多拷貝增加為主,單拷貝的缺失或增加在群體中出現(xiàn)頻率較低。

    CNV1 在3 個群體中的優(yōu)勢變異類型頻率為(表4),大白豬以拷貝數(shù)缺失為主(72.41%),皺皮香豬群體以拷貝數(shù)缺失為主(83%),正常香豬群體則以拷貝數(shù)正常占優(yōu)勢(63.33%)。對于CNV2(表5),大白豬、正常香豬群體和皺皮香豬群體均以拷貝數(shù)缺失為主,變異頻率達(dá)93%、97%和37%。3 個群體中,大白豬的CNV3 以拷貝數(shù)缺失型變異占主要優(yōu)勢(90%),皺皮香豬群體以拷貝數(shù)增加型變異為主(66.67%),正常香豬拷貝數(shù)增加與拷貝數(shù)正常型較多,變異頻率均為36.67%(表6)。

    2.3 CNVs 基因注釋及功能分析使用VEP 注釋3 個CNVs 中的基因(表7),CNV1 內(nèi)有14個基因,分別是SFT2D1、PRR18、RPS6KA2、FGFR1OP、CCR6、UNC93A、MPC1、GPR31、RNASET2、TTLL2、TCP10L2 和3 個Novel基因(ENSSSCG00000034196、ENSSSCG00000036759、ENSSSCG00000040654);CNV2 包含13個基因:KATNB1、ADGRG3、ADGRG1、DRC7、CCL17、RF00017、CX3CL1、COQ9、POLR2C、ADGRG5、CCDC102A、DOK4 和CIAPIN1;CNV3 有4個基因,其中LOC100513601 的3′ 端不在該CNV3 內(nèi),SLA-5、RF00001 和ENSSSCG00000001231 處于CNV3 之中。

    與正常香豬和大白豬相比,CNV1 在皺皮香豬中以拷貝數(shù)缺失為主,KEGG 富集分析提示CNV1 中的基因參與調(diào)節(jié)多條信號通路(表8),包括多個疾病相關(guān)的通路(如I 型糖尿病、病毒性心肌炎和自身免疫性甲狀腺疾?。⒃型閷?dǎo)的卵母細(xì)胞成熟、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂、胰島素抵抗、抗原加工和遞呈等。皺皮香豬的CNV2 和CNV3 以拷貝數(shù)增加占優(yōu)勢,KEGG 富集分析得出(表9),二者參與趨化因子信號通路以及多條與CNV1 相同的疾病相關(guān)通路、RNA 聚合酶、抗原加工和遞呈等。GO 富集分析表明,3 個CNVs 主要參與生物調(diào)節(jié)、發(fā)育、免疫、代謝和刺激反應(yīng)等生物學(xué)過程,且具有多種分子功能,主要涉及抗原結(jié)合、受體結(jié)合、酶活性(水解酶活性、連接酶活性和蛋白激酶活性)、G 蛋白偶聯(lián)受體活性、細(xì)胞因子受體活性以及細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)成分等。

    表4 組間CNV1 拷貝數(shù)變異分析

    表5 組間CNV2 拷貝數(shù)變異分析

    表6 組間CNV3 拷貝數(shù)變異分析

    將3 個CNVs 與豬QTL Database 進(jìn)行重疊分析,CNV1 區(qū)內(nèi)未發(fā)現(xiàn)任何QTL 重疊;CNV2 和CNV3 2個區(qū)與125 個QTL 重疊,包括免疫能力、肉質(zhì)和肉色、生長和繁殖、肩部皮下脂肪厚度和肌內(nèi)脂肪含量等性狀。

    3 討 論

    3.1 貴州地方豬品種的皮膚比歐洲豬品種厚 皮膚是哺乳動物最大的器官,在保護(hù)機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和抵御外界病原物入侵等方面起著重要的屏障作用。研究表明,皮膚厚度會直接影響皮膚的感覺、防御、分泌、排泄等功能[23]。本實驗結(jié)果表明,貴州地方豬品種的皮膚比歐洲豬品種厚。大白豬背部皮下脂肪平均厚度為14 mm,其表皮和真皮層平均厚度為2.54 mm[24];本實驗中經(jīng)實際測定,2 頭正常香豬背部皮下脂肪平均厚60 mm,表皮和真皮層平均厚5 mm;2 頭皺皮香豬背部皮下脂肪平均厚24 mm,表皮和真皮層平均厚8 mm。

    3.2 CNV1 中的基因拷貝數(shù)缺失可能影響豬的脂肪代謝皺皮香豬具有皮下脂肪薄的優(yōu)良特性,其脂肪代謝可能與CNV1 中的基因拷貝數(shù)缺失有關(guān)。群體檢測結(jié)果表明,CNV1 在皺皮香豬群體和大白豬群體主要以拷貝數(shù)缺失(Deletion)型變異為主,變異頻率分別為83.00% 和72.41%,而正常香豬群體的拷貝數(shù)缺失型變異頻率為23.33%。卡方檢驗表明,皺皮香豬和大白豬的CNV1缺失型頻率極顯著高于正常香豬,皺皮香豬和大白豬之間差異不顯著。線粒體丙酮酸載體1(Mitochondrial Pyruvate Carrier 1,MPC1,ENSSSCG00000032916)基因存在于CNV1 中,是控制丙酮酸通過線粒體內(nèi)膜轉(zhuǎn)運的關(guān)鍵因子,對碳水化合物、脂肪和氨基酸分解代謝以及合成代謝途徑起重要作用。MPC1 基因被敲除或活性受抑時,線粒體丙酮酸代謝受阻,ATP 合成量下降,促進(jìn)脂肪分解代謝[25]。Zou 等[26]研究證明,抑制MPC1 的活性可以促進(jìn)脂肪酸氧化。MPC1±小鼠表現(xiàn)出脂解代謝加強、脂肪合成代謝下降[27]。MPC1 基因發(fā)生拷貝數(shù)缺失可能抑制其活性,繼而促進(jìn)脂解代謝和降低脂肪合成代謝。對CNV1 進(jìn)行KEGG 富集分析表明,核糖體蛋白S6 激酶2(Ribosomal protein S6 Kinase A2,RPS6KA2/RSK3)富集到胰島素抵抗信號通路,在該通路中RSK3 由胰島素前體激活,然后磷酸化蛋白磷酸酶1,蛋白磷酸酶1 去磷酸化糖原合成酶,促進(jìn)糖原合成。RSK3 基因的拷貝數(shù)缺失可能導(dǎo)致RSK3 酶活性下降,繼而影響糖原的合成與存儲,機(jī)體的能量需求轉(zhuǎn)而由脂肪酸氧化提供。CNV1 中MPC1 和RSK3 基因發(fā)生拷貝數(shù)缺失,可能是影響皺皮香豬皮下脂肪變薄的原因之一。

    表8 CNV1 內(nèi)基因參與的信號通路

    表9 CNV2 和CNV3 內(nèi)基因參與的信號通路

    3.3 CCL17 和CX3CL1 基因拷貝數(shù)增加可能通過劑量效應(yīng)引起豬皮膚產(chǎn)生褶皺 皺皮香豬具有皮膚表皮和真皮層增厚、褶皺明顯和發(fā)紅等特征,其可能與CNV2 和CNV3 中的CCL17 和CX3CL1 基因拷貝數(shù)增加有關(guān)。CNV2 和CNV3 在皺皮香豬群體中拷貝數(shù)增加型變異所占的比率顯著高于正常香豬和大白豬群,正常香豬與大白豬群的構(gòu)成比差異不顯著。趨化因子CX3CL1(C-X3-C Motif Chemokine Ligand 1,CX3CL1/fractalkine)和胸腺和活化調(diào)節(jié)趨化因子(Thymus and Activation Regulated Che-mokine,TARC/CCL17)存在于CNV2 中,其參與調(diào)節(jié)趨化因子信號通路,參與各種皮膚炎癥的發(fā)生[28-29],促進(jìn)炎癥部位白細(xì)胞的募集過程,可能與香豬皺皮性狀的發(fā)生有關(guān)。Fractalkine 和CX3CR1 基因在系統(tǒng)性硬化癥(SSc)患者受影響的皮膚中表達(dá)量上調(diào),促進(jìn)CX3CR1 陽性細(xì)胞向受影響組織的募集,導(dǎo)致皮膚炎癥和血管損傷[30];Fractalkine 和CX3CR1 mRNA 表達(dá)在注射TGF-β 的WT 小鼠中增加,導(dǎo)致小鼠皮膚膠原蛋白過量、引發(fā)皮膚纖維化增生[31]。CCL17 由樹突細(xì)胞(DC)、內(nèi)皮細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞(KC)和成纖維細(xì)胞產(chǎn)生,參與炎癥浸潤,被指定為Th2 型趨化因子,誘導(dǎo)Th-2 型淋巴細(xì)胞向皮膚募集,啟動Th2 細(xì)胞相關(guān)皮膚炎癥的發(fā)展[32]。CX3CL1 和CCL17 基因的表達(dá)量在銀屑病患者的受損部位皮膚中升高[33-34],CCL17 基因在急性過敏性接觸性皮炎(ACD)患者的表達(dá)水平增加90 倍,CCL17 蛋白增加50 倍[35]。這些研究表明,趨化因子的表達(dá)水平與皮膚病的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系,提示皺皮豬CX3CL1 和CCL17 基因發(fā)生拷貝數(shù)增加,其可能通過劑量效應(yīng)引起豬皮膚產(chǎn)生褶皺。

    4 結(jié) 論

    本研究結(jié)果提示,3 個CNVs在豬群中呈現(xiàn)出多態(tài)性變化。CNV1 在皺皮香豬群中以拷貝數(shù)缺失型為主,其中的MPC1 和RSK3 基因拷貝數(shù)缺失可能與皺皮豬脂肪代謝有關(guān);CNV2 和CNV3 在皺皮香豬群中以拷貝數(shù)增加型占優(yōu)勢,其中的趨化因子CCL17 和CX3CL1 基因可能通過劑量效應(yīng)引起豬皮膚產(chǎn)生褶皺。

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