HPLC-MS/MS測(cè)定唾液中華法林濃度及其與血藥濃度關(guān)系的探討

王　政，李　哲，李　靖，楊春秀，張　健，沈　素，余俊先，王汝龍（.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院藥學(xué)部，北京 00050；.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院醫(yī)療保健中心，北京 00050）

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HPLC-MS/MS測(cè)定唾液中華法林濃度及其與血藥濃度關(guān)系的探討

王政1，李哲1，李靖2，楊春秀1，張健2，沈素1，余俊先1，王汝龍1（1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院藥學(xué)部，
北京 100050；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院醫(yī)療保健中心，北京 100050）

目的：建立唾液中華法林濃度的HPLC-MS/MS分析方法，并探討其與血藥濃度的關(guān)系。方法：采用HPLC法，色譜柱為SB-C18柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm），流動(dòng)相為乙腈（A）/0.1％甲酸水溶液（B），流速0.4 mL·min-1，梯度洗脫；質(zhì)譜采用ESI正離子模式。待測(cè)樣本為服用華法林患者的唾液及血漿（均于服藥后12 h采集）。結(jié)果：目標(biāo)化合物華法林與內(nèi)標(biāo)BA-TPQ的離子質(zhì)荷比（m/z）分別為309.1→163和278→91.1，二者洗脫分離完全，保留時(shí)間分別為1.828 min和1.566 min。華法林的提取回收率穩(wěn)定，日內(nèi)、日間精密度RSD ＜ 15％。待測(cè)樣本的唾液華法林濃度為5.44 ng·mL-1，5.70 ng·mL-1和8.79 ng·mL-1，與其對(duì)應(yīng)的血漿樣品濃度為626.04 ng·mL-1、735.51 ng·mL-1、1 206.79 ng·mL-1。結(jié)論：本文建立的HPLC-MS/MS檢測(cè)方法，可用于臨床華法林的藥物濃度監(jiān)測(cè)，探索性的結(jié)果表明華法林的唾液濃度與血漿濃度的消除成平行關(guān)系，可考慮作為替代監(jiān)測(cè)指標(biāo)之一。

華法林；HPLC-MS/MS；唾液；血漿；血藥濃度

華法林是目前應(yīng)用最廣泛的香豆素類(lèi)口服抗凝藥，通過(guò)抑制肝臟中依賴(lài)維生素K的凝血因子來(lái)發(fā)揮作用，用于預(yù)防和治療深靜脈血栓、肺栓塞、心臟瓣膜置換術(shù)及心房顫動(dòng)導(dǎo)致的血栓形成，降低心肌梗死復(fù)發(fā)及心肌梗死后血栓栓塞死亡的危險(xiǎn)性［1-2］。華法林的治療窗窄、個(gè)體差異大，影響因素多，遺傳變異和種族差異是劑量個(gè)體化的最主要原因［3-4］。華法林抗凝療效與患者術(shù)后出血或栓塞并發(fā)癥、遠(yuǎn)期生存質(zhì)量及生存率密切相關(guān)［5］，因此服藥患者的抗凝監(jiān)測(cè)十分重要，監(jiān)測(cè)不當(dāng)可導(dǎo)致出血或栓塞等并發(fā)癥， 嚴(yán)重者可危及患者生命［6］。

國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值（INR）法因校正了試劑敏感性的差異，使測(cè)定結(jié)果能相對(duì)較準(zhǔn)確地反映抗凝強(qiáng)度，在臨床上廣泛使用。尋求一種無(wú)創(chuàng)、快捷、簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確的分析方法和簡(jiǎn)便的樣品采集裝置已日漸引起研究者的關(guān)注，唾液為非創(chuàng)傷性采集的體液樣本，采集方便，且可避免因抽血帶來(lái)的身體不適、暈血及感染等［7］。為此我們參考已有的關(guān)于華法林血漿藥物濃度的測(cè)定方法［8］，嘗試建立唾液中華法林濃度測(cè)定方法學(xué)，以期為其臨床藥物監(jiān)測(cè)提供參考。

1　材料與方法

1.1藥品和試劑

華法林（分析純，純度97.2％，批號(hào)45706-250MG-R， Sigma-Aldrich公司）；內(nèi)標(biāo)物：BA-TPQ（純度98％）［8］；乙腈、甲醇、甲酸均為色譜純，乙酸乙酯為分析純，其他試劑均為市售分析純。

1.2儀器和分析參數(shù)

1.2.1主要儀器 HPLC-MS/MS系統(tǒng)，包括1200液相色譜（二元泵、脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱等）和6460三重四級(jí)桿質(zhì)譜（美國(guó)Agilent公司）；BS 124S分析天平（德國(guó)Sartorius公司）；MS-3渦旋器（德國(guó)IKA公司）；Sigma 3-18K低溫離心機(jī)（德國(guó)Sartorius公司）。

1.2.2HPLC-MS/MS參數(shù)設(shè)置 色譜柱為SB-C18柱（2.1 mm × 50 mm，1.8 μm，美國(guó)Agilent公司）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1％甲酸水溶液（B）；梯度洗脫：0 ～ 1 min 50％ A，1 ～ 2 min 90％ A，2 ～ 3 min 50％ A；流速：0.4 mL·min-1；柱溫：40 ℃。離子源為電噴霧離子源ESI，正離子模式；毛細(xì)管電壓5 kV；干燥氣流速8 L·min-1；干燥氣溫度350 ℃；霧化氣壓力30 psi；碎裂電壓50 V，詳見(jiàn)表1。選擇的檢測(cè)離子質(zhì)荷比（m/z）：華法林：309.1→163；BA-TPQ：278→91.1。

表1　華法林和內(nèi)標(biāo)的HPLC-MS/MS參數(shù)Tab 1　HPLC-MS/MS parameters of warfarin and IS

1.3方法學(xué)考察

1.3.1工作液、標(biāo)準(zhǔn)曲線及質(zhì)控樣品的配制 工作液：精密稱(chēng)取華法林10 mg和內(nèi)標(biāo)BA-TPQ 5 mg，以甲醇為溶劑配制成1 mg·mL-1的儲(chǔ)備液及1 μg·mL-1的內(nèi)標(biāo)液。以甲醇為溶媒，將儲(chǔ)備液分別稀釋成50 ng·mL-1、100 ng·mL-1、250 ng·mL-1、500 ng·mL-1、2.5 μg·mL-1、5 μg·mL-1、10 μg·mL-1、30 μg·mL-1的工作液。取工作液5 μL，分別用空白唾液和空白血漿稀釋配制標(biāo)準(zhǔn)曲線，唾液L1-L8為1、2、5、10、50、100、200、600 ng·mL-1，低、中、高三個(gè)質(zhì)控樣品的濃度為2、40、500 ng·mL-1，血漿的L1-L8為10、20、50、100、200、500、1000、3000 ng·mL-1。

1.3.2樣品的預(yù)處理 取含藥唾液500 μL，加入5 μL內(nèi)標(biāo)液以及500 μL乙酸乙酯，渦旋60 s使樣品充分混勻，低溫離心機(jī)在4℃的條件下高速離心20 min （18 000 g），上層有機(jī)相用氮?dú)獯蹈?，?00 μL流動(dòng)相復(fù)溶，取2 μL進(jìn)樣HPLC-MS/MS分析。取含藥血漿50 μL，加入5 μL內(nèi)標(biāo)液以及500 μL乙酸乙酯，其余步驟同上，氮?dú)獯蹈珊笠?00 μL流動(dòng)相復(fù)溶，取2 μL定量分析。

1.3.3回收率、準(zhǔn)確度、精密度和基質(zhì)效應(yīng) 取濃度為2、40、500 ng·mL-1的質(zhì)控樣品，每個(gè)濃度平行處理3份，預(yù)處理方法同“1.3.2”項(xiàng)下操作，考察提取回收率。每個(gè)濃度平行處理5份，考察日內(nèi)和日間精密度。用流動(dòng)相配制低、中、高3個(gè)濃度樣品，加入內(nèi)標(biāo)，測(cè)得響應(yīng)值A(chǔ)；在空白唾液提取后加入相同質(zhì)控和內(nèi)標(biāo)，測(cè)響應(yīng)值B，基質(zhì)效應(yīng)ME％ = 響應(yīng)值B/響應(yīng)值A(chǔ)×100％。

1.3.4穩(wěn)定性考察 三個(gè)濃度的質(zhì)控樣品按“1.3.2”項(xiàng)下方法預(yù)處理，考察進(jìn)樣器中放置24 h的穩(wěn)定性，以及樣品經(jīng)3次凍融循環(huán)于室溫放置24 h和低溫（- 20 ℃）儲(chǔ)存2周的穩(wěn)定性。

1.4受試者樣品檢測(cè)

臨床試驗(yàn)經(jīng)北京友誼醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。納入3例冠心病患者，2男1女，年齡75 ～ 81歲，華法林服藥方法均為3 mg，qd。服藥后12 h采取唾液2.0 mL，同時(shí)取靜脈血2.0 mL置于EDTA離心管中，3000 r·min-1，離心10 min，分離血漿備用。唾液和血漿樣品按“1.3.2”項(xiàng)下方法預(yù)處理，分別測(cè)定唾液和血漿中華法林的濃度。

2　結(jié)果

2.1方法學(xué)專(zhuān)屬性

在上述條件下進(jìn)行檢測(cè)，華法林和BA-TPQ的保留時(shí)間分別為1.828 min和1.566 min，空白唾液和血液中內(nèi)源性物質(zhì)無(wú)干擾，具有較好的專(zhuān)屬性。詳見(jiàn)圖1。

2.2線性范圍、回收率和基質(zhì)效應(yīng)

唾液中華法林濃度在1 ～ 600 ng·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性方程為y = 15.713 1 x + 0.001 9（r = 0.999 7）?？瞻籽獫{中華法林濃度在10 ～ 3000 ng·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性方程為y = 0.876 x + 0.017 8 （r = 0.994 2）。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD可評(píng)估回收率及基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果表明華法林在唾液中的回收率穩(wěn)定在83.19％ ～ 102.29％，RSD在±15％以?xún)?nèi)。基質(zhì)效應(yīng)在83.41％ ～ 102.71％，RSD在±15％以?xún)?nèi)，對(duì)MS信號(hào)不產(chǎn)生干擾。

圖1　HPLC-MS/MS色譜圖A - 空白唾液，B - 空白唾液+華法林（200 ng·mL-1），C - 空白唾液+華法林（200 ng·mL-1） +內(nèi)標(biāo)物BA-TPQ（ 1 μg·mL-1），D - 受試者唾液樣品；1 - 華法林，2 - 內(nèi)標(biāo)（BA-TPQ）Fig 1　Chromatograms of HPLC-MS/MS A - blank saliva， B - blank saliva + warfarin （200 ng·mL-1）， C - blank saliva + warfarin （200 ng·mL-1） + BA-TPQ （1 μg·mL-1）， D - saliva sample of patient； 1 - warfarin， 2 - internal standard（ BA-TPQ）

2.3準(zhǔn)確度和精密度考察

對(duì)高中低三種濃度的質(zhì)控樣本在連續(xù)3 d內(nèi)進(jìn)行準(zhǔn)確度和精密度的驗(yàn)證（n = 5，3，3）。RSD可用于評(píng)估精密度，準(zhǔn)確度是實(shí)際濃度平均值與理論濃度的比值，準(zhǔn)確度和精密度需要保持在±15％，詳見(jiàn)表2。

表2　精密度、回收率和基質(zhì)效應(yīng)Tab 2　The precision， recovery and matrix effect

2.4穩(wěn)定性

反復(fù)凍融穩(wěn)定性和短期穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，華法林在反復(fù)凍融的條件下以及在進(jìn)樣器中放置24 h穩(wěn)定，詳見(jiàn)表3。

2.5受試者唾液及血液中華法林濃度測(cè)定

收集3例長(zhǎng)期服用華法林患者（編號(hào)Sample A、 Sample B、Sample C）唾液及血液，按“1.3.2”項(xiàng)下方法處理樣品并檢測(cè)濃度。結(jié)果如下，3例患者唾液中華法林濃度分別為5.44、5.70、8.79 ng·mL-1，與其對(duì)應(yīng)的血液中華法林濃度分別為626.04、735.51、1 206.79 ng·mL-1。將唾液中華法林濃度與其血藥濃度進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果詳見(jiàn)圖2。

表3　穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab 3　The results of stability tests

圖2　受試者唾液和血漿中華法林的濃度分布Fig 2　Distribution of warfarin concentration in patients' saliva and plasma

3　討論

3.1INR監(jiān)測(cè)的特點(diǎn)

華法林臨床應(yīng)用特點(diǎn)是治療窗窄、不良反應(yīng)嚴(yán)重、個(gè)體差異大，因此服藥患者的抗凝監(jiān)測(cè)十分重要。許多服用華法林的患者年齡較大，更有腦梗后偏癱臥床者，定期到醫(yī)院抽血監(jiān)測(cè)INR及血藥濃度對(duì)患者而言較為麻煩。然而，未按指南推薦時(shí)間測(cè)定INR有可能導(dǎo)致抗凝強(qiáng)度不足或發(fā)生出血等不良反應(yīng)［9］。因此，本課題組利用唾液這個(gè)取材簡(jiǎn)便且又無(wú)創(chuàng)的體液，借助HPLC-MS/MS等多種大型儀器建立新的方法學(xué)，以期為治療藥物監(jiān)測(cè)提供新思路。

3.2唾液中華法林濃度測(cè)定的可行性

本研究結(jié)果顯示，唾液中華法林在1 ～ 600 ng·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r = 0.999 7，且日間精密度、日內(nèi)精密度及凍融穩(wěn)定性均符合要求，故本實(shí)驗(yàn)方法學(xué)準(zhǔn)確、可靠、穩(wěn)定。我們測(cè)定所收集的三個(gè)樣本，將華法林在患者唾液中的濃度和血漿中的濃度進(jìn)行對(duì)比，二者具有相關(guān)性，與預(yù)測(cè)結(jié)果相符合。即血漿中華法林濃度較高者其唾液中含藥量也較高，這為日后建立成熟的唾液法監(jiān)測(cè)華法林濃度提供了理論基礎(chǔ)。

本次試驗(yàn)在方法學(xué)設(shè)計(jì)上主要有以下幾點(diǎn)優(yōu)勢(shì)：1）采用乙酸乙酯液-液萃取法除蛋白，與蛋白沉淀法相比更為徹底［9］，使基質(zhì)對(duì)測(cè)試的影響更小；2）采用梯度洗脫可保證在前1分鐘內(nèi)洗脫出大量生物樣本中的水溶性雜質(zhì)，又可在盡可能短的時(shí)間內(nèi)（4 min）完成全部洗脫，節(jié)省試驗(yàn)時(shí)間；3）質(zhì)譜條件調(diào)試合理，既有較高分離度，又滿足了唾液中微量華法林的測(cè)定要求，定量下限（LLOQ）可達(dá)到1 ng·mL-1，并可保證其準(zhǔn)確度，為此次試驗(yàn)提供了良好的靈敏性。

3.3唾液中華法林濃度測(cè)定的局限性

唾液中藥物檢測(cè)受到采集技術(shù)與方法、藥物特性、給藥途徑、個(gè)體差異（年齡、機(jī)體生理疾病、情緒狀態(tài)）等因素的影響較大［10-12］，因此仍需逐步建立唾液采集標(biāo)準(zhǔn)方法和檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。在未來(lái)的治療藥物監(jiān)測(cè)中，唾液所具有的采集方便、操作簡(jiǎn)單的突出優(yōu)勢(shì)必將使其受到更多的重視，檢測(cè)技術(shù)日臻得到完善，最終更好地為臨床服務(wù)。

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Quantitative determination of warfarin in human saliva and plasma by HPLC-MS/MS and the analysis of their correlation

WANG Zheng1， LI Zhe1， LI Jing2， YANG Chun-xiu1， ZHANG Jian2， SHEN Su1， YU Jun-xian1， WANG Ru-long1
（1. Department of Pharmacy， Beijing Friendship Hospital， Capital Medical University， Beijing 100050， China； 2. Medical and Health Center， Beijing Friendship Hospital， Capital Medical University， Beijing 100050， China）

Objective： To determine the concentration of warfarin in human saliva and plasma by HPLC-MS/MS， and the correlation between saliva and plasma warfarin concentration was discussed. Methods： The separation was performed on a SB-C18column with an gradient mobile phase consisting of acetonitrile （A） / 0.1％ formic acid aqueous solution （B） at the fow rate of 0.4 mL·min-1. Detection was carried out on a mass spectrometer by positive electrospray ionization （ESI） in multiple reaction monitoring （MRM） mode. All samples were collected 12 h after warfarin therapy. Results： Warfarin and the internal standard （IS） were detected at m/z 309.1→163 and 278→91.1， respectively. Two compounds were eluted completely and their retention time were 1.828 min and 1.566 min， respectively. The intra-day and inter-day precision relative standard deviations （RSD） were less than 15％. The warfarin concentrations in saliva samples were 5.44 ng·mL-1， 5.70 ng·mL-1and 8.79 ng·mL-1， respectively. Meanwhile， the warfarin concentration in plasma were 626.04 ng·mL-1， 735.51 ng·mL-1and 1 206.79 ng·mL-1. Conclusion： The HPLC-MS/MS method can be applied to the concentration monitoring about warfarin. There is a correlation between warfarin concentration in saliva and plasma， and the warfarin concentration in saliva can be potentially considered as monitoring surrogate marker.

Warfarin； HPLC-MS/MS； Saliva； Plasma； Blood drug concentration

R917

A

1672 - 8157（2016）03 - 0144 - 04

余俊先，男，副主任藥師，主要從事臨床藥學(xué)工作。E-mail：junxianyu@ccmu.edu.cn

王政，女，在讀碩士研究生，研究方向：臨床藥學(xué)。E-mail：zhengwangccmu@hotmail.com

（2015-11-15

2016-02-01）