抗菌肽對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的抗菌機(jī)制研究進(jìn)展Δ

郭文杰，羅 鵬，荊許恩，張鑫婷，許婷婷，陳楚娜，陳 新#（.南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院呼吸內(nèi)科，廣州 50220；2.南方醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣州 5055）

抗菌肽對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的抗菌機(jī)制研究進(jìn)展Δ

郭文杰1，2＊，羅 鵬1，2，荊許恩1，張鑫婷1，2，許婷婷1，2，陳楚娜1，2，陳 新1，2#（1.南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院呼吸內(nèi)科，廣州 510220；2.南方醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣州 510515）

目的：了解抗菌肽對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的抗菌機(jī)制，以期為抗菌肽臨床治療MRSA肺炎提供參考。方法：查閱近年來國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，就各種抗菌肽對MRSA的抗菌機(jī)制的相關(guān)研究進(jìn)行歸納和總結(jié)。結(jié)果與結(jié)論：抗菌肽相對于抗菌藥物擁有較多優(yōu)勢——（1）抗菌肽是生物天然免疫系統(tǒng)的組成部分，容易獲得；抗菌肽氨基酸數(shù)較少、肽鏈較短，減小了合成抗菌肽的難度，為大量人工合成抗菌肽提供了可能性。（2）抗菌肽表面富含正電荷，YD1、Melittin和Bac8c均通過其表面的正電荷與MRSA表面的負(fù)電荷結(jié)合并黏附于細(xì)菌表面，進(jìn)一步破壞細(xì)胞膜從而殺滅細(xì)菌；LL-37能抑制MRSA生物膜的形成并破壞已經(jīng)形成的MRSA生物膜；hBD3-CBD通過在MRSA周圍聚集進(jìn)而發(fā)揮殺菌作用；J-AA、J-RR和J-AR利用其結(jié)構(gòu)特殊性，通過內(nèi)/外膜透化機(jī)制，破壞MRSA細(xì)胞膜，從而殺傷細(xì)菌。上述機(jī)制皆不涉及受體與配體之間的結(jié)合，避免了MRSA對抗菌肽產(chǎn)生耐藥性。（3）大部分抗菌肽在極低的MIC下即已對MRSA展示出了強(qiáng)大的殺菌作用?？咕牡氖褂靡泊嬖谝欢ǖ木窒扌浴?）抗菌肽的肽鏈較短，增加了提取難度，人工合成抗菌肽則提高了藥物成本。（2）抗菌肽的短肽鏈和簡單結(jié)構(gòu)，使其穩(wěn)定性較差。（3）抗菌肽是一種異種蛋白，可能誘發(fā)患者產(chǎn)生一系列的免疫反應(yīng)和毒性作用。

抗菌肽；耐甲氧西林金黃色葡萄球菌；肺炎

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.23.37

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）是臨床常見的一種多重耐藥菌，主要造成院內(nèi)感染和社區(qū)感染。MRSA能定植于人體內(nèi)的不同組織表面導(dǎo)致多種疾病，38.3%的感染患者可從痰液分離培養(yǎng)得到MRSA，MRSA肺炎是院內(nèi)危重患者的常見感染類型，其中腫瘤患者的MRSA肺炎感染率達(dá)11.4%[1-2]。由于MRSA的多重耐藥性，使得MRSA肺炎的臨床治療困難，患者遷延不愈且病死率較高?？咕氖且活愑缮锩庖呦到y(tǒng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的活性多肽，是天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分，已有研究將抗菌肽外用于感染部位并取得了較好的效果[3]。鑒于此，筆者查閱近年來國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，就各種抗菌肽對MRSA抗菌機(jī)制的相關(guān)研究進(jìn)行歸納和總結(jié)，以期為抗菌肽臨床治療MRSA肺炎提供參考。

1 MRSA的耐藥機(jī)制

MRSA的耐藥性主要依賴于一層胞外多糖基質(zhì)構(gòu)成的生物膜，由于生物膜的阻隔作用使膜內(nèi)部分細(xì)菌免受抗菌藥物的殺傷作用，并可在適當(dāng)時(shí)候釋放至膜外造成患者感染復(fù)發(fā)和遷延不愈。臨床使用的大部分抗菌藥物只能殺滅活動中的MRSA，生物膜中細(xì)菌的代謝較弱，多數(shù)處于休眠狀態(tài)。生物膜的保護(hù)作用使MRSA能有充足的時(shí)間開啟耐藥基因，產(chǎn)生大量抗菌藥物水解酶，進(jìn)一步降解進(jìn)入生物膜內(nèi)的抗菌藥物，使MRSA獲得耐藥性[4-5]。MRSA的耐藥機(jī)制還涉及對抗菌物質(zhì)相應(yīng)受體的封閉作用，通過改變自身細(xì)胞膜受體，阻礙抗菌物質(zhì)通過受體結(jié)合黏附于細(xì)胞膜，從而逃避殺傷。

2 抗菌肽

抗菌肽具有來源廣泛、抗菌譜廣、抗菌活性強(qiáng)和不產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)[6]?？咕牡目咕鷻C(jī)制主要在于其能抑制細(xì)菌生物膜的形成，并破壞已形成的生物膜，通過激發(fā)機(jī)體的天然免疫功能殺死游離細(xì)菌，從而發(fā)揮有效的殺菌作用，其殺菌機(jī)制不涉及受體機(jī)制的特點(diǎn)，避免了MRSA對其產(chǎn)生耐藥性[7]。

2.1 YD1（Glycin-rich antimicrobial peptide）

YD1是一種從解淀粉芽孢桿菌中分離出來的多肽類抗菌物質(zhì)，多存在于發(fā)酵食物中（如泡菜）?？咕腨D1表面黏附著大量正電荷，而細(xì)菌細(xì)胞膜表面存在負(fù)電荷團(tuán)，故細(xì)菌能被YD1黏附、殺傷。YD1的正電荷與MRSA的負(fù)電荷結(jié)合，在細(xì)菌表面形成包裹，黏附于細(xì)菌表面的YD1通過穿胞作用進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞膜內(nèi)，進(jìn)一步激活細(xì)菌DNA，誘導(dǎo)細(xì)菌凋亡。YD1的穿胞作用不涉及受體結(jié)合，避開了MRSA產(chǎn)生耐藥性的途徑。

Rahman MS等[8]的研究旨在比較抗菌肽YD1、桿菌肽和萬古霉素對MRSA的殺菌作用，檢測了3種抗菌物質(zhì)的最低抑菌濃度（MIC），進(jìn)一步評價(jià)其對MRSA肺炎的治療作用。結(jié)果顯示，桿菌肽對MRSA的MIC為64 μg/mL，萬古霉素的MIC＞128μg/mL，抗菌肽YD1的MIC為32μg/mL，可見抗菌肽YD1較桿菌肽和萬古霉素顯示出明顯的優(yōu)勢（P＜0.05）?？咕腨D1對MRSA具有明顯的抑制作用，其殺菌機(jī)制主要為誘導(dǎo)細(xì)菌滅亡，且不會使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，在治療MRSA肺炎的藥物研究中具有較好的前景。

2.2 LL-37（Leucine Leucine-37）

抗菌肽家族主要包括防御素和Cathelicidin，LL-37是Cathelicidin家族唯一的抗菌物質(zhì)。LL-37存在于人體內(nèi)多種上皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞、體液和創(chuàng)傷分泌物中，能夠發(fā)揮抗微生物活性、參與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)和促進(jìn)創(chuàng)傷修復(fù)等作用，是具有多種功能的活性小分子肽[9]。

LL-37針對MRSA肺炎的殺菌機(jī)制包括直接殺死游離MRSA，抑制MRSA生物膜的形成和破壞已經(jīng)形成的MRSA生物膜。MRSA在肺組織表面的初始附著量決定了其能否在肺內(nèi)形成成熟的細(xì)胞膜，而LL-37能夠直接減少人體肺組織表面的MRSA初始附著量，并影響生物膜的形成[10]。此外，LL-37還能夠抑制MRSA在肺組織表面的局部聚集，通過阻礙MRSA在肺組織表面的附著和聚集成團(tuán)，從而有效阻礙MRSA形成有效穩(wěn)定的生物膜。LL-37參與構(gòu)成人體免疫系統(tǒng)，能募集各種免疫細(xì)胞（如中性粒細(xì)胞），調(diào)節(jié)人體炎癥反應(yīng)，協(xié)調(diào)非特異性和特異性兩大免疫系統(tǒng)，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用殺滅MRSA。由于這一殺菌機(jī)制主要通過調(diào)節(jié)和誘導(dǎo)人體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生，因而能避免MRSA對抗菌肽LL-37產(chǎn)生耐藥性[11]。

Dürr UH等[12]的研究通過結(jié)晶紫染色法分析了抗菌肽LL-37對MRSA初始附著量的影響。該研究在無菌96孔板中接種MRSA菌液100μL，實(shí)驗(yàn)組在每孔各加入不同濃度的LL-37溶液100μL，兩組皆在37℃下培養(yǎng)24 h，并通過酶標(biāo)儀在結(jié)晶紫染色后測定其570 nm吸收度值。結(jié)果顯示，在LL-37溶液濃度為0.625μmol/L時(shí)，LL-37對MRSA臨床株生物膜形成的抑制率為27%，與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；LL-37溶液濃度增加至3.130μmol/L時(shí)，LL-37對MRSA臨床株生物膜形成的抑制率達(dá)63%。對兩組培養(yǎng)基形成的生物膜在激光共聚焦顯微鏡下掃描的結(jié)果顯示，兩組培養(yǎng)基形成的生物膜差異顯著：對照組培養(yǎng)基形成的生物膜熒光信號強(qiáng)、結(jié)構(gòu)完整、細(xì)菌排列致密，成型生物膜平均厚度為15～25μm，生物膜發(fā)育較為成熟；實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基形成的生物膜熒光信號弱、細(xì)菌排列疏松，成熟菌斑總量明顯減少，成型生物膜厚度偏?。?～7μm）；兩組成型生物膜厚度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

抗菌肽LL-37可抑制和破壞MRSA生物膜，還參與構(gòu)成人體非特異性免疫系統(tǒng)，減少超敏反應(yīng)的發(fā)生率。這些優(yōu)勢使抗菌肽LL-37在治療MRSA肺炎上具有巨大的潛力。

2.3 hBD3-CBD（Human beta defensin 3-Carbohydrate Binding Domain）

hBD3為抗菌肽防御素家族的重要成員，參與構(gòu)成人體非特異性免疫系統(tǒng)，并在生理?xiàng)l件下具有一般抗菌肽不具有的穩(wěn)定性。hBD3廣泛表達(dá)于人體的免疫細(xì)胞、上皮細(xì)胞和創(chuàng)傷部位[4]。

hBD3的抗菌機(jī)制主要與其糖類結(jié)合域（CBD）相關(guān)，通過與MRSA表面糖鏈的結(jié)合在MRSA附近聚集，并黏附于MRSA表面，再通過hBD3表面的正電荷與MRSA表面負(fù)電荷結(jié)合并經(jīng)過一系列反應(yīng)，誘導(dǎo)MRSA細(xì)胞膜破裂，從而殺滅細(xì)菌[13]。

為進(jìn)一步提升hBD3的抗菌效力，CBD的寡核苷酸鏈和hBD3基因片段被研究者重組，從而增強(qiáng)抗菌肽hBD3黏附細(xì)菌的能力，得到合成產(chǎn)物hBD3-CBD。通過重組質(zhì)粒將CBD和hBD3基因融合，并在真核細(xì)胞（pVAX1）中表達(dá)，通過細(xì)胞保護(hù)實(shí)驗(yàn)對其抑菌能力進(jìn)行評估[13]。該研究分別給3組培養(yǎng)基接種MRSA，其中2組分別加入hBD3和hBD3-CBD，另一組作為對照組，通過計(jì)算3組培養(yǎng)基在感染3、6、12 h不同時(shí)間點(diǎn)的菌落生成數(shù)和上清液中炎癥因子指標(biāo)白細(xì)胞介素6（IL-6）的濃度來評價(jià)抗菌肽的抑菌能力和抗炎癥能力。對各組上清液進(jìn)行IL-6濃度檢測的結(jié)果顯示，感染6、12 h時(shí)，對照組的轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中IL-6的濃度較感染前明顯增加，且顯著高于另外2組。同時(shí)，菌落計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，在感染6、12 h時(shí)，hBD3組和hBD3-CBD組的抑菌作用明顯高于對照組；感染12 h時(shí)，hBD3組和hBD3-CBD組的菌落生成數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），hBD3-CBD顯示出對MRSA更強(qiáng)的抗菌作用?？梢姡ㄟ^增加CBD的數(shù)量提高抗菌肽對細(xì)菌的黏附作用，能使人工合成的新型抗菌肽hBD3-CBD較hBD3具有更強(qiáng)的抑菌作用。

2.4 J-AA（Junction-Anoplin-Anoplin）、J-RR（Junction-Arginine-and Trytophan-Rich Hexapeptide-Arginine-and Trytophan-Rich Hexapeptide）和J-AR（Anoplin-Arginine-and Trytophan-Rich Hexapeptide）

Anoplin是一種從黃蜂毒液中提取的抗菌肽，RW（Arginine-and Trytophan-Rich Hexapeptide）是通過“鏈接”化學(xué)合成的人工抗菌肽，從而合成新型抗菌肽J-AA、J-RR和J-AR。這3種抗菌肽均擁有雙親性結(jié)構(gòu)，能夠穿透細(xì)菌的細(xì)胞膜并在短時(shí)間內(nèi)破壞細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性，包括外膜透化作用和內(nèi)膜透化作用。這兩種穿透細(xì)胞膜的機(jī)制不需要受體介導(dǎo)，使得MRSA無法對抗菌肽進(jìn)行受體的改變從而產(chǎn)生耐藥性。

研究者將這3種抗菌肽與臨床常規(guī)使用的抗菌藥物卡那霉素及其親本Anoplin和RW進(jìn)行比較，實(shí)驗(yàn)動物使用MRSA肺炎模型大鼠[14]。結(jié)果顯示，卡那霉素對MRSA的MIC＞298μg/mL，Anoplin和RW的MIC分別為73.8、64.3μg/mL，而人工合成抗菌肽J-AA、J-RR和JAR的MIC分別為21.1、18.7、19.9μg/mL?？梢姡撗芯恐械男滦涂咕牡目筂RSA作用是其親本的4～6倍，同時(shí)強(qiáng)于抗菌藥物卡那霉素的抑菌能力。該研究結(jié)果還顯示，J-RR對MRSA的抑制效果較好，J-AR和J-RR的劑量達(dá)到120 mg/kg后才顯示出對MRSA肺炎模型大鼠的毒性作用，具有較大的安全治療窗。J-RR通過內(nèi)外膜透化機(jī)制破壞MRSA細(xì)胞膜的完整性，不依賴受體的結(jié)合從而具有不產(chǎn)生耐藥性的優(yōu)點(diǎn)，故而這種新型合成抗菌肽成為治療MRSA肺炎的重要選擇之一。

2.5 Melittin和Bac8c（Bactenecin-8c）

Melittin是從蜂毒中提取的多肽類抗菌物質(zhì)；Bac8c是利用合成技術(shù)生成的人工抗菌肽。細(xì)菌細(xì)胞膜的負(fù)電荷被兩者表面的正電荷團(tuán)結(jié)合，相互黏附最終形成致死的孔隙，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)菌被殺滅。

研究者比較了Melittin和Bac8c對MRSA菌株的作用，該研究分別在不同培養(yǎng)基中加入同樣濃度的不同菌株的MRSA，并且分別注入抗菌肽Melittin和Bac8c[15]。結(jié)果顯示，Melittin在不同菌株的MRSA中MIC均為5 μg/mL；而Bac8c在WBG8287菌株中MIC為7μg/mL，在W17S和Aus3菌株中MIC均達(dá)80μg/mL。結(jié)果還顯示，Melittin對不同菌株的MRSA具有更穩(wěn)定的治療作用，殺滅MRSA的能力更強(qiáng)。

2.6 其他

TempL（Temporin L）是從青蛙體內(nèi)提取的抗菌肽，由13個(gè)氨基酸組成，其對MRSA的MIC為25.5μg/mL[6]。但由于TempL的肽鏈太短，造成提取工藝復(fù)雜和操作困難。TempL的抗菌機(jī)制尚不清楚，研究者們正致力于尋找該肽鏈中決定TempL多種抗菌能力的片段，為人工合成TempL提供可能性[16]。

抗菌肽Clavanin-A對MRSA的MIC為2.4μg/mL，具有強(qiáng)大的殺菌作用，但由于表達(dá)量少且合成困難限制了其臨床研究的開展[6]。研究者通過對Clavanin-A進(jìn)行修改，得到新型抗菌肽Clavanin-MO，其殺菌作用與親本Clavanin-A相仿，且Clavanin-MO基因能在畢赤酵母中得到大量的穩(wěn)定表達(dá)，可能成為未來治療MRSA肺炎的重要抗菌藥物[17]。

活魚體內(nèi)有一種Piscidin家族的抗菌肽。Rbmoro（Moronecidin）隸屬于Piscidin家族，由70個(gè)氨基酸組成，可從巖鯉科魚中提取，對MRSA的MIC為6.9μg/mL[5]。研究者已獲得決定Rbmoro殺菌能力的相應(yīng)肽段，并通過人工合成在不同的細(xì)菌中將此肽段大量表達(dá)。但當(dāng)這種具有殺菌作用的肽段回輸至活魚體內(nèi)后，卻產(chǎn)生了明顯的溶血反應(yīng)，溶血的原因?yàn)榇穗亩螌铘~的紅細(xì)胞產(chǎn)生了破壞作用，而相應(yīng)的機(jī)制尚未明確[17]。

抗菌肽殺菌機(jī)制包括阻礙MRSA生物膜形成，影響基因表達(dá)而誘導(dǎo)細(xì)菌滅亡，促進(jìn)上皮組織生長覆蓋創(chuàng)口，調(diào)節(jié)樹突狀細(xì)胞表達(dá)和招募TB淋巴細(xì)胞等[3，18-19]。目前發(fā)現(xiàn)對MRSA具有殺菌作用的抗菌肽較多，其中一部分對MRSA的殺菌效果顯著，但由于其對患者同時(shí)存在的毒性作用、穩(wěn)定性差和提取難度大等原因，使得其離臨床應(yīng)用依然有一定距離。

3 結(jié)語

綜上所述，抗菌肽相對于抗菌藥物擁有較多優(yōu)勢：（1）抗菌肽是生物天然免疫系統(tǒng)的組成部分，容易獲得；抗菌肽氨基酸數(shù)較少、肽鏈較短，減小了合成抗菌肽的難度，為大量人工合成抗菌肽提供了可能性。（2）抗菌肽表面富含正電荷，YD1、Melittin和Bac8c均通過其表面的正電荷與MRSA表面的負(fù)電荷結(jié)合并黏附于細(xì)菌表面，進(jìn)一步破壞細(xì)胞膜從而殺滅細(xì)菌；LL-37能抑制MRSA生物膜的形成并破壞已經(jīng)形成的MRSA生物膜；hBD3-CBD通過在MRSA周圍聚集進(jìn)而發(fā)揮殺菌作用；J-AA、J-RR和J-AR利用其結(jié)構(gòu)特殊性，通過內(nèi)/外膜透化機(jī)制破壞MRSA細(xì)胞膜，從而殺傷細(xì)菌。上述機(jī)制皆不涉及受體與配體之間的結(jié)合，避免了MRSA對抗菌肽產(chǎn)生耐藥性。（3）大部分抗菌肽在極低的MIC下即已對MRSA展示出了強(qiáng)大的殺菌作用。

然而，抗菌肽的使用也存在一定的局限性：（1）抗菌肽的肽鏈較短，增加了提取難度，人工合成抗菌肽則提高了藥物成本。（2）抗菌肽的短肽鏈和簡單結(jié)構(gòu)，使其穩(wěn)定性較差。（3）抗菌肽是一種異種蛋白，可能誘發(fā)患者產(chǎn)生一系列的免疫反應(yīng)和毒性作用。

目前，抗菌肽還處在研究階段，其作用機(jī)制尚未完全明確，但其抗菌譜廣，具有不產(chǎn)生耐藥性的優(yōu)勢，且不同的抗菌肽具有各自的特點(diǎn)。上述特點(diǎn)使抗菌肽具有成為未來治療MRSA肺炎的重要抗菌物質(zhì)的潛力。

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R536.1；R974

A

1001-0408（2017）23-3302-04

2017-03-13

2017-04-21）

（編輯：陶婷婷）

廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No.2016A030313620）；南方醫(yī)科大學(xué)國家級、省級、校級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（No.201612121002）

＊本科生。研究方向：臨床醫(yī)學(xué)。電話：0757-27337063。E-mail：906261642@qq.com

#通信作者：副主任醫(yī)師，副教授。研究方向：慢性阻塞性肺疾病、哮喘、肺癌及肺部感染的診治。電話：020-62782296。E-mail：chen_xin1020@163.com