032基因缺失豬痘病毒載體的構(gòu)建及鑒定

藺輝星，周 紅，范紅結(jié)

(南京農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院，江蘇 南京 210095)

032基因缺失豬痘病毒載體的構(gòu)建及鑒定

藺輝星，周 紅，范紅結(jié)*

(南京農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院，江蘇 南京 210095)

目的：構(gòu)建毒力減弱的豬痘病毒載體。方法：以豬痘病毒野生毒株NT1501株為親本毒株，通過同源重組方法，構(gòu)建缺失032毒力基因的豬痘病毒SPV△032。檢測SPV△032在不同種屬來源細胞系中的培養(yǎng)滴度，并通過動物試驗來檢測其毒力。結(jié)果：豬痘病毒SPV△032株與野生NT1501株在PK15和ST等豬源細胞中的培養(yǎng)滴度差異不顯著，均可達到5.0×106TCID50左右。豬痘病毒SPV△032株在Vero、MDBK等其他物種來源的細胞系中不能進行復(fù)制，連續(xù)傳代2～3代以后，細胞培養(yǎng)物中檢測不到豬痘病毒基因，與野生NT1501株培養(yǎng)結(jié)果一致。動物試驗結(jié)果表明，用高濃度SPV△032接種實驗豬，接種部位皮膚未出現(xiàn)任何癥狀，比野生NT1501株的毒力顯著降低。接種SPV△032實驗豬的細胞免疫和體液免疫反應(yīng)水平均顯著高于野生NT1501株 (P<0.05)。接種SPV△032的實驗豬不會通過糞便等途徑向環(huán)境中排毒。結(jié)論：本研究構(gòu)建了032基因缺失豬痘病毒SPV△032，該病毒的毒力與野生NT1501株相比顯著下降，可以作為弱毒豬痘病毒載體，用于獸用疫苗研發(fā)。

豬痘病毒；032基因；載體

豬痘病毒(Swinepox virus, SPV)是脊椎動物痘病毒亞科(Chordopoxvirinae)豬痘病毒屬(Suipoxvirus)的唯一成員[1]。豬是SPV唯一的天然宿主，其他動物均不被SPV感染[2]。豬感染SPV后可出現(xiàn)豬痘癥狀，該病于1842年首次在歐洲報道，目前在全世界范圍內(nèi)流行。SPV在表皮角質(zhì)形成細胞中增殖，皮膚以外的其他組織很少受到影響，通常病變輕微[3]。由于SPV能夠同時刺激免疫動物的體液免疫反應(yīng)以及細胞免疫反應(yīng)，具有基因組容量大以及生物安全性高等優(yōu)點，故常作為載體被用于獸用疫苗研發(fā)。從臨床分離到的SPV野生毒株對豬具有一定的致病力，因此不能直接作為疫苗載體，需要對其進行致弱，降低其毒力，以保證豬痘病毒載體疫苗的安全性。豬痘病毒基因組共編碼150個基因，依次命名為001-150基因。通過與其他痘病毒(如痘苗病毒)毒力相關(guān)基因的同源性分析發(fā)現(xiàn)，009、032、135、145基因可能與SPV的毒力相關(guān)[4-6]。其中032基因全長534 bp，所編碼的蛋白與痘苗病毒編碼的雙鏈RNA依賴性蛋白激酶抑制因子同源[7]，能夠抑制干擾素的生成，降低宿主的天然免疫應(yīng)答，導(dǎo)致感染動物容易出現(xiàn)豬痘癥狀。本研究通過構(gòu)建032基因缺失豬痘病毒SPV△032，對其毒力以及生物學特性進行評價，以期構(gòu)建弱毒豬痘病毒載體，用于獸用疫苗研發(fā)。

1 材料與方法

1.1 病毒與細胞

豬痘病毒NT1501株，2015年分離自南通某豬場，保存于本實驗室。豬腎細胞(PK15)、非洲綠猴腎細胞(Vero)以及牛腎細胞(MDBK)等分別購自美國典型培養(yǎng)物保存中心(ATCC)或中科院上海細胞庫，用含5%～10%胎牛血清(FBS)的DMEM細胞培養(yǎng)液進行培養(yǎng)。

1.2 豬痘病毒032基因缺失載體構(gòu)建

以豬痘病毒NT1501株基因組為模板，用引物LF1/LF2和RF1/RF2分別PCR擴增032基因的左、右同源重組交換臂LF和RF。以pEGFP-N1質(zhì)粒為模板，用引物GFP1/GFP2通過PCR方法擴增出綠色熒光蛋白篩選標記基因gfp。以pUC19質(zhì)粒(Takara)為骨架，通過酶切連接方法，依次插入左、右同源重組交換臂LF和RF以及綠色熒光蛋白篩選標記基因gfp，得到豬痘病毒032基因缺失載體pUCLGR。

表1 本研究所用到的引物

斜體=限制性酶切位點。

1.3 032基因缺失豬痘病毒的構(gòu)建

將PK15細胞培養(yǎng)于6孔細胞培養(yǎng)板中，待長成單層細胞后，加入0.01感染復(fù)數(shù)(MOI)的豬痘病毒NT1501株對細胞進行感染， 37 ℃孵育2 h后，用pUCLGR質(zhì)粒進行轉(zhuǎn)染，具體操作步驟按照轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000的說明書進行，轉(zhuǎn)染后3 d將細胞培養(yǎng)物凍融兩次后收集培養(yǎng)液。將收集的培養(yǎng)液接入6孔細胞板中的PK15單層細胞，進行新一輪的感染，37 ℃孵育2 h后，棄去孔中的細胞培養(yǎng)液，加入含1.5%甲基纖維素的DMEM細胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)3～5 d。在熒光顯微鏡中觀察到的綠色熒光噬斑即為032基因缺失豬痘病毒。在熒光顯微鏡下，用200 μL微量移液器挑取含綠色熒光的細胞，凍融2次后再次接種PK15單層細胞。重復(fù)10輪篩選純化后，可得到純化的032基因缺失豬痘病毒，命名為SPV△032。用引物SPV1/SPV2對該豬痘病毒進行PCR鑒定。

1.4 體外增殖能力檢測以及遺傳穩(wěn)定性檢測

對032基因缺失豬痘病毒SPV△032進行體外增殖能力進行檢測。用0.01 MOI的病毒感染PK15、Vero和MDBK等細胞，37 ℃孵育2 h，中間搖動3次，棄去感染液，加入40 mL含2%胎牛血清的DMEM細胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)至80%細胞發(fā)生病變(約72 h)，將細胞反復(fù)凍融2次，收集細胞培養(yǎng)液，測定SPV△032的培養(yǎng)滴度。將收集的細胞培養(yǎng)液，再次接種同種細胞，進行連續(xù)傳代，每隔10代取樣，分別測定細胞培養(yǎng)液中SPV△032的培養(yǎng)滴度，并進行全基因組測序，以評價其遺傳穩(wěn)定性。

1.5 毒力評價

45頭1月齡長白豬，隨機分為3組，每組15頭。前2組分別用SPV△032株以及NT1501株進行皮膚穿刺接種，第3組只注射生理鹽水，作為陰性對照。每種病毒分別以1.0×106TCID50、1.0×105TCID50、1.0×104TCID50、1.0×103TCID50和1.0×102TCID50劑量進行接種，2 mL/頭，每個劑量分別接種3頭豬。每隔8 h觀察豬皮膚表面癥狀，每隔48 h前腔靜脈采血1 mL，提取血清中的病毒DNA，用引物SPV1/SPV2對豬痘病毒基因進行PCR檢測。每隔3 d收集豬場內(nèi)蚊蟲、水源、飼料和糞便，提取樣品中的病毒DNA，用引物SPV1/SPV2對豬痘病毒基因進行PCR檢測，評估SPV△003的毒力以及擴散能力。

1.6 細胞因子檢測

采集接種后第10 d、20 d的血清，用ELISA試劑盒(ExCell Bio)檢測SPV△032株以及NT1501株接種豬血清中的IFN-γ和IL-4水平，具體操作步驟按照試劑盒說明書進行，根據(jù)相應(yīng)的標準曲線進行計算。

1.7 統(tǒng)計學分析

所有的數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，P<0.05被認為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬痘病毒032基因缺失載體構(gòu)建及鑒定

用EcoR I/Hind III對豬痘病毒032基因缺失載體pUCLGR(圖1A)進行雙酶切鑒定，1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測可見3824 bp和2158 bp 兩個條帶，酶切片段大小與預(yù)期結(jié)果一致(圖1B)。測序結(jié)果表明，本試驗所構(gòu)建的豬痘病毒轉(zhuǎn)移載體pUCLGR與目的基因序列完全一致。

圖1 豬痘病毒032基因缺失載體pUCLGR雙酶切鑒定

2.2 032基因缺失豬痘病毒的純化

重組豬痘病毒在含有甲基纖維素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)約3～4 d，即可在熒光顯微鏡下觀察到明顯的綠色熒光噬斑(圖2)，挑取單個綠色熒光痘斑置于0.5 mL DMEM維持液中，反復(fù)凍融3次后用于下一輪純化。純化一直進行到出現(xiàn)在細胞板內(nèi)的所有病毒噬斑均為綠色熒光噬斑，得到的032基因缺失豬痘病毒稱作SPV△032株。結(jié)果表明，SPV△032株中檢測不到032基因，032基因缺失豬痘病毒構(gòu)建成功。

圖2 032基因缺失豬痘病毒SPV△032的純化

2.3 體外增殖能力檢測以及遺傳穩(wěn)定性檢測

在PK15和ST兩種豬源細胞和十種非豬源細胞系中對032基因缺失豬痘病毒SPV△032進行遺傳穩(wěn)定性的評估。結(jié)果表明(表2)，在PK15和ST豬源細胞系中，SPV△032株前4代的培養(yǎng)滴度有所下降，隨傳代次數(shù)增多，培養(yǎng)滴度逐漸提高，第6代以后接近野生毒株NT1501株的培養(yǎng)滴度(5.0×106TCID50)。而在非豬源細胞系中不能進行復(fù)制，傳代2～3代以后就檢測不到豬痘病毒基因。連續(xù)傳代60代以上，SPV△032株的培養(yǎng)滴度始終維持在5.0×106TCID50左右。測序結(jié)果表明，各代次的SPV△032株未發(fā)生基因突變，遺傳穩(wěn)定性良好。

表2 基因缺失豬痘病毒SPV△032在不同細胞中的培養(yǎng)滴度(TCID50/log10)

a未檢測到豬痘病毒基因。

2.4 毒力評價結(jié)果

動物試驗結(jié)果表明，1.0×104TCID50以上劑量的SPV野生毒株NT1501株接種組試驗豬注射部位皮膚出現(xiàn)直徑約2～3 mm的痘疹，數(shù)量不多，第5 d明顯可以觀察到，16 d以內(nèi)全部結(jié)痂脫落，除此之外未出現(xiàn)其他癥狀。SPV△032各濃度試驗組均未出現(xiàn)皮膚癥狀，所有豬體溫、飲食以及精神狀態(tài)與陰性對照組豬相比，無顯著差異。對接種豬血清中的病毒DNA進行檢測，結(jié)果均為陰性，表明SPV△032只會感染皮膚組織，不會進入到血液中。對豬場內(nèi)蚊蟲、水源、飼料和糞便樣品中的病毒DNA進行檢測，結(jié)果均為陰性，表明SPV△032不會隨糞便等釋放到環(huán)境中，具有較高的生物安全性。

2.5 細胞因子檢測結(jié)果

機體的免疫反應(yīng)主要是由Th1和Th2 類T細胞亞群誘導(dǎo)。Th1細胞主要產(chǎn)生IFN-γ，IL-2和TNF-β等，主要誘導(dǎo)細胞免疫反應(yīng)以及炎癥反應(yīng)；而Th2細胞主要產(chǎn)生IL-4、IL-6和IL-10等，主要誘導(dǎo)體液免疫反應(yīng)和嗜酸性粒細胞積聚。SPV△032所誘導(dǎo)的機體免疫反應(yīng)的類型可以通過測定血清中IFN-γ和IL-4的水平來進行間接評估。分別用ELISA檢測試劑盒(ExCell Bio)對采集的試驗豬血清中的IFN-γ和IL-4進行測定，結(jié)果表明(圖3)，SPV△032接種豬血清中IFN-γ和IL-4含量顯著高于其他兩組(P<0.05)，表明SPV△032能夠同時增強細胞免疫反應(yīng)和體液免疫反應(yīng)。

圖3 細胞因子IFN-γ和IL-4水平檢測

3 結(jié)論與討論

SPV是脊椎動物痘病毒亞科豬痘病毒屬的唯一成員，在自然條件下僅感染豬，通常病變輕微[8-9]。當前對SPV的研究主要集中在將其作為獸用疫苗載體方面[10-13]。Van der Leek等構(gòu)建了表達偽狂犬病毒糖蛋白gp50-gp63的重組豬痘病毒，經(jīng)皮膚穿刺或肌肉注射途徑接種實驗豬，21 d后分別有90%、100%的實驗豬產(chǎn)生了偽狂犬病毒血清中和抗體[14]。本課題組構(gòu)建了表達豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)Cap蛋白的重組豬痘病毒，該重組豬痘病毒可誘導(dǎo)免疫仔豬產(chǎn)生高水平的PCV2中和抗體，可有效防制PCV2強毒株的攻擊[15]。上述研究結(jié)果表明，重組豬痘病毒載體可高效表達外源蛋白，能誘導(dǎo)免疫動物產(chǎn)生高效的細胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答，是一種具有巨大應(yīng)用前景的疫苗載體。

SPV載體疫苗的安全性問題一直是人們關(guān)注的焦點。SPV 032基因是其重要的毒力基因之一，能夠降低宿主的天然免疫應(yīng)答，導(dǎo)致感染動物容易出現(xiàn)豬痘癥狀。本研究構(gòu)建了缺失032基因的豬痘病毒SPV△032、SPV△032株與野生NT1501株在PK15和ST等豬源細胞中的培養(yǎng)滴度差異不顯著，均可達到5.0×106TCID50左右。豬痘病毒SPV△032株在Vero、MDBK等其他物種來源的細胞系中不能進行復(fù)制，連續(xù)傳代2～3代以后，細胞培養(yǎng)物中檢測不到豬痘病毒基因，與野生NT1501株培養(yǎng)結(jié)果一致。動物試驗結(jié)果表明，1.0×104TCID50以上劑量的SPV野生毒株NT1501株會引起接種豬的皮膚出現(xiàn)局部痘斑，但不會導(dǎo)致其他癥狀。而1.0×106TCID50以上劑量的SPV△032株接種豬的皮膚未出現(xiàn)任何病理癥狀，SPV△032株比野生NT1501株的毒力顯著降低。接種SPV△032實驗豬的細胞免疫和體液免疫反應(yīng)水平均顯著高于野生NT1501株。接種SPV△032的實驗豬不會通過糞便等途徑向環(huán)境中排毒。上述研究結(jié)果表明，032基因缺失豬痘病毒SPV△032與野生NT1501株相比毒力顯著下降，可以作為弱毒豬痘病毒載體，用于獸用疫苗研發(fā)。

[1]AITKEN W A. Swine pox[J]. The North American Veterinarian, 1948, 29(6): 353.

[2]Kasza L, Griesemer R A. Experimental swine pox.[J]. American Journal of Veterinary Research, 1962, 23(4):443-451.

[3]CHEVILLE N F. The cytopathology of swine pox in the skin of swine[J]. American Journal of Pathology, 1966, 49(2): 339-352.

[4]AFONSO C L, TULMAN E R, LU Z, et al. The genome of swinepox virus.[J]. Journal of Virology, 2002, 76(2):783-790.

[5]ISHIDO S, CHOI J K, LEE B S, et al. Inhibition of natural killer cell-mediated cytotoxicity by kaposi's sarcoma-associated herpesvirus K5 protein[J]. Immunity, 2000, 13(3): 365-374.

[6]STEVENSON P G, EFSTATHIOU S, DOHERTY P C, et al. Inhibition of MHC class I-restricted antigen presentation by gamma 2-herpesviruses[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2000, 97(15): 8455-8460.

[7]LANGLAND J O, JACOBS B L. The role of the PKR-inhibitory genes,E3L and K3L,in determining vaccinia virus host range[J]. Virology, 2002, 299(1): 133-141.

[8]RIYESH T, BARUA S, KUMAR N, et al. Isolation and genetic characterization of swinepox virus from pigs in India[J]. Comparative Immunology Microbiology and Infectious Diseases, 2016, 46: 60-65.

[9]MEDAGLIA M L, PEREIRA A D, FREITAS T R, et al. Swinepox virus outbreak, Brazil, 2011[J]. Emerging Infectious Diseases, 2011, 17(10): 1976-1978.

[10]FANG Yi-zhen, LIN Hui-xing, MA Zhe, et al. Construction and immunogenicity of recombinant swinepox virus expressing outer membrane protein L of salmonella[J]. Journal of Microbiology and Biotechnology, 2016, 26(7): 1173-1181.

[11]FAN H J, LIN H X. Recombinant Swinepox Virus for Veterinary Vaccine Development[J]. Methods Mol Biol, 2016,1349:163-175.

[12]YUAN Xiao-min, LIN Hui-xing, FAN Hong-jie. Efficacy and immunogenicity of recombinant swinepox virus expressing the A epitope of the TGEV S protein[J]. Vaccine, 2015, 33(32): 3900-3906.

[13]XU Jia-rong, YANG De-ji, HUANG Dong-yan, et al. Protection of Guinea pigs by vaccination with a recombinant swinepox virus co-expressing HA1 genes of swine H1N1 and H3N2 influenza viruses[J]. Archives of Virology, 2013, 158(3): 629-637.

[14]VAN DER LEEK M L, FELLER J A, SORENSEN G, et al. Evaluation of swinepox virus as a vaccine vector in pigs using an Aujeszky's disease(pseudorabies)virus gene insert coding for glycoproteins gp50 and gp63[J]. The Veterinary Record, 1994, 134(1): 13-18.

[15]LIN Hui-xing, MA Zhe, FAN Hong-jie, et al. Construction and immunogenicity of recombinant swinepox virus expressing capsid protein of PCV2[J]. Vaccine, 2012, 30(44): 6307-6313.

(責任編輯：馬世堂)

Construction and Identification of the 032 Gene Deletion in Swinepox Virus

LIN Hui-xing, ZHOU Hong, FAN Hong-jie*

(College of Veterinary Medicine, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095,China)

Objective: To construct an attenuated swinepox virus (SPV) vector. Methods: The 032 gene deletion SPV△032 was constructed by homologous recombination with SPV NT1501 wild strain. The titers of the SPV△032 culture in different species-derived cell lines were measured, and the virulence of the SPV△032 was detected by animal experiment. Results: There was no significant difference in the culture titers between the SPV△032 strain and the wild NT1501 strain in PK15 and ST cell lines, and the culture titer of the SPV△032 was about 5.0×106TCID50. The SPV△032 could not be replicated in Vero, MDBK and other species-derived cell lines. After 2-3 passages, the swinepox virus gene could not be detected in the cell culture of the SPV△032, which was consistent with the culture of wild NT1501 strain . The results of animal experiments showed that the inoculation site of the SPV△032 inoculated pigs with high concentration did not show any symptoms, and the vi-rulence of the SPV△032 was significantly lower than that of the wild NT1501 strain. The cellular immune response and humoral immune response of the SPV△032 inoculated pigs were significantly higher than those of wild NT1501 strain inoculated pigs (P<0.05). The SPV△032 virus will not give emission to the environment through the feces of the SPV△032 inoculated pigs. Conclusion: The 032 gene deletion SPV△032 was constructed in this study. The virulence of the SPV△032 was significantly lower than that of the wild NT1501 strain, and could be used as attenuated vector in veterinary vaccine development.

Swinepox virus; 032 gene; Vector

2016-09-15

江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項目(CX(15)1056，CX(16)1028)。

藺輝星(1985-)，男，河北省石家莊市人，博士，講師,主要從事獸醫(yī)微生物學及免疫學、獸醫(yī)生物技術(shù)研究。*通訊作者：范紅結(jié)，教授，E-mail: fhj@njau.edu.cn。

S828.9

A

1673-8772(2016)06-0001-06