維生素A棕櫚酸酯凍干脂質體的制備及穩(wěn)定性

邱樹虹，王永軍

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維生素A棕櫚酸酯凍干脂質體的制備及穩(wěn)定性

邱樹虹，王永軍*

(沈陽藥科大學藥學院，遼寧沈陽，110016)

目的制備維生素A棕櫚酸酯（VAP）凍干脂質體，并對其穩(wěn)定性進行研究。方法用薄膜分散法制備維生素A棕櫚酸酯脂質體，用正交設計法優(yōu)化處方和制備工藝。以50 g·L-1海藻糖- 50 g·L-1蔗糖（質量比1∶1）為凍干保護劑進行凍干。采用HPLC法測定VAP脂質體中維生素A棕櫚酸酯的含量及包封率。結果VAP脂質體凍干前平均粒徑為(90.06±2.88) nm，zeta電位為-(5.08±0.18) mV，平均包封率為(90.06±1.73)%，凍干后復溶平均粒徑為(83.40±0.78) nm，zeta電位為-(3.65±0.86) mV，平均包封率為(90.84±0.80)%。VAP凍干脂質體在4℃保存3 個月穩(wěn)定。結論以最佳處方和工藝制備的VAP脂質體包封率高、重現(xiàn)性好。VAP凍干脂質體對光照和高溫不穩(wěn)定，應避光儲存在4 ℃冰箱中。

藥劑學；凍干脂質體；薄膜分散法；維生素A棕櫚酸酯；穩(wěn)定性

維生素A是最早被發(fā)現(xiàn)的維生素，能調節(jié)角膜上皮細胞增殖、分化和保存結膜杯狀細胞，可促進視覺細胞內感光色素的形成，調試眼睛適應外界光線強弱的能力，以降低夜盲癥和視力減退的發(fā)生，維持正常的視覺反應，并有助于對多種眼疾（如眼球干燥與結膜炎等）的治療[1-3]。維生素A棕櫚酸酯（vitamin A palmitate，VAP）是維生素A 的一種主要衍生物，對于維持正常的視功能及免疫系統(tǒng)具有重要作用[4]。VAP不溶于水，對熱、光、空氣和濕度敏感，穩(wěn)定性極差，將VAP制備成脂質體可以增加它由UV輻射引起的氧化過程的穩(wěn)定性，且易于與生物膜融合，促進藥物吸收[5]。由于VAP脂質體為液體，儲存過程中容易發(fā)生聚集、融合及藥物泄露，且磷脂氧化、水解等問題使脂質體不穩(wěn)定。制成凍干脂質體能夠降低磷脂和藥物的氧化速度，顯著提高穩(wěn)定性[6]。本文作者以薄膜分散法制備維生素A棕櫚酸酯脂質體，采用凍干技術提高VAP脂質體的穩(wěn)定性，并對其穩(wěn)定性進行了研究。

1 儀器與材料

Adventurer電子分析天平AR1140（奧豪斯國際貿(mào)易有限公司），AG245電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司），RE-52A旋轉蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠），JY92-2D超聲波細胞粉碎機（寧波新芝科器研究所），UV-1801紫外-分光光度計（北京瑞利分析儀器公司），H-600透射電鏡JEM-1200EX、日立高效液相色譜儀（日本Hitachi公司），LDZ5-2低速自動平衡離心機（北京醫(yī)用離心機廠），PHS-3C酸度計（上海雷磁儀器廠），F(xiàn)DE-1100冷凍干燥機（東京理化EYELA）。

維生素A棕櫚酸酯（規(guī)格為1.70×106IU·g-1，美國sigma公司，批號 1411107，BR），大豆卵磷脂（純度質量分數(shù)98.00%，規(guī)格100 g，上海太偉藥業(yè)有限公司，批號 20140202），膽固醇（純度質量分數(shù)99.6%，天津博迪華工有限公司，批號 20110712），滋養(yǎng)凝膠（規(guī)格為5 g，效價為5 000 IU，沈陽興起藥業(yè)有限公司，批號 140702），葡聚糖凝膠G-50（規(guī)格25 g，RegaL BiotechnoLogy Company），丁基羥基茴香醚（BHA，含量質量分數(shù)98.50％，美國Sigma公司，批號MKBM2264V），磷酸鹽緩沖液（PBS，pH值7.40，0.50 mmol·L-1，參照《中華人民共和國藥典》2010年版自行配制），甲醇（色譜純，天津康科德科技有限公司），異丙醇（色譜純，山東禹王實業(yè)有限公司化工分公司），其他試劑（分析純，市售）。

2 方法與結果

2.1 維生素A棕櫚酸酯凍干脂質體的制備

2.1.1 VAP脂質體的制備

稱取處方量的大豆卵磷脂、膽固醇、維生素A棕櫚酸酯、BHA和羥苯乙酯置于500 mL茄形瓶中，加入氯仿20 mL溶解。將茄形瓶置旋轉蒸發(fā)儀上，35 ℃恒溫水浴減壓蒸餾除去有機溶劑，在內壁上形成均勻的類脂薄膜。加入45 ℃的0.50 mmol·L-1pH值7.00的PBS 10 mL輕搖，洗脫類脂膜，置旋轉蒸發(fā)儀上，常壓45 ℃恒溫水化15 min，形成的脂質體為乳白色懸浮液，將所得的類脂質混懸液超聲粉碎5 min，過0.45 μm濾膜整粒，即得。

2.1.2 VAP凍干脂質體的制備

以50 g·L-1海藻糖-50 g·L-1蔗糖（質量比1∶1）為凍干保護劑，將按“2.1.1”條制備的脂質體在氮氣流下分裝1 mL至西林瓶中。冷凍干燥，凍干程序為-80 ℃預凍12 h、-40 ℃ 3 h、-20 ℃15 h、30 ℃ 9 h，避光操作。復溶液為4.5 g·L-1氯化鈉注射液。

2.2 VAP脂質體的含量測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Phenomen C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；檢測波長：326 nm；柱溫：40 ℃；流動相：甲醇-異丙醇（體積比95∶5）；流速：1.0 mL·min-1；進樣量：20 μL。在此色譜條件下，空白脂質體對測定無干擾，結果見圖１。

2.2.2 線性關系考察

精密稱取VAP對照品10 mg，置于10 mL量瓶中，加無水乙醇溶解并稀釋至全量，搖勻，即得VAP對照儲備液。分別精密吸取VAP對照儲備液，制成50 μg·L-1和1.00、4.00、20.00、30.00、40.00和50.00 mg·L-1系列質量濃度的溶液。按“2.2.1”條色譜條件，分別進樣20 μL。以VAP質量濃度（）為橫坐標，峰面積（）為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程：=7.926 2×104- 8.604 9×103P，=0.999 9。結果表明，VAP質量濃度在50 μg·L-1~50.00 mg·L-1內與峰面積呈良好的線性關系。

1—Vitamin palmitate

2.2.3 精密度試驗

精密吸取不同量的VAP對照儲備液置于5 mL量瓶中，用無水乙醇定容，配制低（1.00 mg·L-1）、中（20.00 mg·L-1）、高（40.00 mg·L-1）3種質量濃度的VAP溶液，每種質量濃度平行制備6份，第1天測定日內精密度，連續(xù)進樣3 d，測定日間精密度。結果顯示，日內精密度低、中、高3 種質量濃度的RSD分別為0.45%、0.99%和1.02%（=6），日間精密度低、中、高3種質量濃度的RSD分別為0.95%、1.68%和1.19%（=18）。

2.2.4 回收率試驗

按“2.1”條方法制備空白脂質體10 mL，精密吸取0.1 mL置于5 mL量瓶中，按處方藥量的80%、100%和120%分別加入維生素A棕櫚酸酯對照儲備液80、100和120 μL，用無水乙醇定容，搖勻，每種質量濃度平行制備3份。過0.45 μm濾膜后，進行HPLC分析，進樣量20 μL。根據(jù)峰面積計算測得藥物含量，與加入藥物含量比較，得回收率。低、中、高3種質量濃度的平均回收率分別為（101.18±1.11）%、（100.00±0.36）%和（101.27±0.14）%，RSD分別為0.14%、1.09%和0.36%。

2.3 脂質體包封率的測定

2.3.1 葡聚糖凝膠柱的制備

將葡聚糖凝膠顆粒（Sephadex G-50）浸泡在蒸餾水中，過夜，充分溶脹，裝入底部墊有濾紙片的2.50 mL注射器中。待水分自然流下，將注射器置于離心機中，2 000 r·min-1離心3 min，使凝膠柱失水皺縮，凝膠部分高約2.30 cm，待用。

2.3.2 脂質體包封率的測定

采用微柱離心法測定VAP脂質體的包封率?？偹幬锖康臏y定：精密量取VAP脂質體0.10 mL置于5 mL量瓶中，加入無水乙醇破乳并稀釋至全量，搖勻，過0.45 μm濾膜，采用HPLC法測定VAP含量。脂質體包封藥物含量測定：精密量取VAP脂質體0.10 mL置于“2.3.1”條制備的葡聚糖凝膠柱上，2 000 r·min-1離心2 min；精密移取娃哈哈純凈水100 μL加至葡聚糖凝膠柱中，2 000 r·min-1離心3 min，重復3次。合并4次收集的洗脫液移至5 mL量瓶中，用無水乙醇定容，搖勻，過0.45 μm濾膜，待用。按“2.2”條方法測定藥物含量。分別計算總藥物含量（z）和脂質體包封藥物的含量（b），按公式EE=b/z×100%計算脂質體的包封率。

2.4 脂質體粒徑和zeta電位的測定

采用馬爾文激光粒度分析儀分別對脂質體凍干前后樣品溶液的粒徑和zeta電位進行測定。

2.5 正交設計實驗

2.5.1 影響因素及其水平的確定

以包封率為指標，對脂質體的制備進行單因素考察。分別考察藥脂質量比、磷脂與膽固醇質量比、有機溶劑用量、成膜溫度、水化溫度、水化時間、水化介質(pH值7.4的PBS)濃度等因素對脂質體包封率的影響，結果見表1。由表1可知，藥脂質量比、水化溫度和水化介質的濃度對脂質體的包封率有較大影響。

Table 1 The results of single factor experiments of affecting VAP liposome encapsulation efficiency

2.5.2 正交設計試驗優(yōu)化處方

根據(jù)查閱文獻資料和單因素試驗結果，以藥物和磷脂質量比()、磷脂和膽固醇質量比()、水化溫度()以及pH值7.00 PBS水化介質的濃度()為影響因素，每個因素設定3個水平安排正交試驗，正交表見表2。

Table 2 Orthogonal test factors and levelsof influencing VAP liposome envelopment rate

2.5.3 正交設計試驗結果

由表3可知，4個因素中對脂質體形成影響順序為>>>，最佳處方和工藝條件為2322，即藥脂質量比為1∶30，磷脂與膽固醇質量比為15∶1，水化溫度為45 ℃，水化介質濃度為0.5 mmol·L-1。在脂質體放置過程中，磷脂與膽固醇質量比15∶1時不穩(wěn)定，10 d即析出沉淀；而質量比10∶1時，25 d析出少量絮狀沉淀。所以最終選擇磷脂膽固醇質量比10∶1。

Table 3 Orthogonal design experiments and results of influencing VAP liposome encapsulation efficiency

Note:—Range

2.6 凍干脂質體復溶前后的穩(wěn)定性考察

2.6.1 影響因素試驗

將凍干脂質體和復溶脂質體分別于40 ℃、60 ℃、光照、室溫[(15±2) ℃]和4 ℃放置，于第0、1、3、5、10天取樣，測定粒徑、電位、含量和包封率。

2.6.2 留樣試驗

另將3批凍干脂質體和復溶脂質體分別在室溫和4 ℃條件下放樣，于第30、60、180天取樣，測定粒徑、電位、含量和包封率。

2.7 VAP脂質體的質量評價

2.7.1 脂質體形態(tài)觀察

取1滴凍干前VAP脂質體，滴加到專用銅網(wǎng)上，用質量分數(shù)為1%的磷鎢酸染色，最后樣品在100 kV下以透射電鏡觀察并照相，結果見圖2。

Fig. 2 TEM of VAP liposomes

2.7.2 脂質體粒徑和zeta電位的測定

采用馬爾文激光粒度分析儀分別測定脂質體凍干前后的粒徑和zeta電位，HPLC法測定凍干前后的含量和包封率，結果見表4。

Table 4 Particle size, zeta-potential, drug content and encapsulation efficiency of VAP liposomes before and after freeze-drying (n = 3)

2.8 穩(wěn)定性試驗

2.8.1 凍干脂質體復溶前后的影響因素試驗結果

凍干脂質體復溶前后的影響因素試驗結果見表5。結果表明：在光照條件下放置1 d，凍干脂質體復溶前后均不穩(wěn)定；在60 ℃條件下放置5 d，凍干脂質體復溶前后均不穩(wěn)定，凍干脂質體皺縮且復溶后略顯黏稠，復溶液為黏稠溶液；在40 ℃條件下，放置10 d凍干脂質體復溶前后均不穩(wěn)定；室溫條件下，復溶脂質體放置10 d，含量下降約3.00%，凍干脂質體放置10 d，含量和包封率均無明顯變化。

Table 5 Stability results of freeze-dried VAP liposome before and after redissolving

Notes: rt—Room temperature; Concrete evaluation index for freeze-dried liposomes: +++—White, smooth surface, without shrinkage, no collapse, easy to dissolve with light waving, dissolution solution as a semi-transparent mixed suspension; ++—A little shrinkage, light yellow suspension, dissolved difficult, needs strong vibration wave, dissolution solution as a semi-transparent mixed suspension; +—Shrinking and collapse seriously, become a deep yellow suspention, can not completely dissolved even with strong vibration wave, was viscous liquid. Liposomes solution after dissolution: +++—Precipitate out, as the semi-transparent mixed suspension; ++—Precipitate a small amount of floc; +—A large amount of precipitation, as viscous solution. ——The solution was so sticky that without determination

2.8.2 凍干脂質體復溶前后的留樣試驗結果

凍干脂質體復溶前后的留樣試驗結果見表6。結果表明：室溫[（15±2）℃]條件下放置1個月，復溶液含量下降約10%，凍干脂質體含量下降約4%，包封率均無明顯變化；4 ℃條件下，復溶后溶液放置1個月含量下降約5%，包封率無明顯變化，凍干脂質體放置3個月，含量和包封率均無明顯變化，依然穩(wěn)定，繼續(xù)留樣觀察。

Table 6 The properties of freeze-dried VAP liposome before and after redissolving after stability test at room temperature

Notes: Concrete evaluation index for freeze-dried liposomes: +++—White, smooth surface, without shrinkage, no collapse, easy to dissolve with light waving, dissolution solution as a semi-transparent mixed suspension; ++—A little shrinkage, light yellow suspention, dissolved difficult, needs strong vibration wave, dissolution solution as a semi-transparent mixed suspension; +—Shrinking and collapse seriously, become a deep yellow suspention, can not completely dissolved even with strong vibration wave, was viscous liquid. Liposomes solution after dissolution: +++—After long time placement, no precipitate out, as the semi-transparent mixed suspension; ++—After long time placement, precipitate a small amount of floc; +—After long time placement, precipitated a large amount of precipitation. ——The solution was so sticky that without determination

3 討論

a. 維生素 A 棕櫚酸酯結構中含有較多的不飽和雙鍵，易氧化，穩(wěn)定性較差。在脂質體的制備過程中，以磷脂作為成膜材料，本身存在磷脂氧化降解的問題，從而使脂質體在儲存過程中不穩(wěn)定。VAP原料藥本身對光、熱、氧不穩(wěn)定，增加了制備過程中的難度，因此在脂質體制備過程中，應避光、充N2并加入適當抗氧劑和抑菌劑，提高VAP脂質體的穩(wěn)定性。

b. VAP脂質體水溶液在4 ℃條件下能穩(wěn)定1個月，之后會有絮狀沉淀析出，不穩(wěn)定。采用凍干技術提高了VAP脂質體的穩(wěn)定性，凍干脂質體復溶前后測得各項指標均無明顯變化。通過影響因素試驗可看出凍干脂質體對光和熱敏感；留樣試驗表明，凍干脂質體在室溫條件下放置1個月不穩(wěn)定，含量下降，在4 ℃冰箱中避光儲存3個月依然穩(wěn)定。

[1] 朱志偉. 最早被發(fā)現(xiàn)的維生素—維生素A[J]. 大學化學, 2010, 4: 54-56.

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(本篇責任編輯：趙桂芝)

Preparation of vitamin A palmitate (VAP) freeze-dried liposomes and study of its stability

QIU Shuhong, WANG Yongjun*

（,,110016,）

ObjectiveTo prepare vitamin A palmitate (VAP) freeze-dried liposomes and study its stability. Methods The thin film dispersion method was used to prepare VAP liposomes and the orthogonal design method was employed to optimize the prescription and preparation technology. 50g·L-1trehalose and 50g·L-1sucrose (1∶1) was used as protective agent of freeze-drying. High performance liquid chromatography (HPLC) method was employed to evaluate the content and coating rate of vitamin A palmitate in VAP liposomes. Results Prior to lyophilization, average particle size was (90.06±2.88) nm, zeta potential was –(5.08±0.18) mV, average coating rate at (90.06±1.73)%, after lyophilization, the average particle size was (83.40±0.78) nm, zeta potential was –(3.65±0.86) mV, average coating rate was (90.84±0.80)% of the dissolving liposomes. VAP freeze-dried liposomes was stable at 4 ℃ for 3 months. Conclusion The results showed that encapsulation efficiency of VAP liposomes is high and has a good reproducibility, which was prepared by the optimized formulation and technology. VAP freeze-dried liposome is not stable when exposure to light or at high temperature. It stores at 4oC in the fridge.

pharmaceutics; freeze-dried liposomes; film dispersion method; vitamin A palmitate; stability

（2016）02–0043–10

10.14146/j.cnki.cjp.2016.02.002

R 94

A

2015-05-11

邱樹虹(1988-), 女(漢族), 河北衡水人, 碩士研究生,E-mail qiushuhong.1988@163.com;

王永軍(1977-), 男(漢族), 山東榮成人, 副教授, 博士, 碩士生導師, 主要從事新型抗癌藥物納米給藥系統(tǒng)及藥物制劑新劑型新技術等的研究, Tel. 024-23986325, E-mail i_maple@163.com。