獸醫(yī)實驗室酶聯(lián)免疫吸附試驗操作要點

張秀芬

（十堰市鄖陽區(qū)動物疫病預防控制中心，湖北十堰 442000）

獸醫(yī)實驗室酶聯(lián)免疫吸附試驗操作要點

張秀芬

（十堰市鄖陽區(qū)動物疫病預防控制中心，湖北十堰 442000）

酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA) 用于很多試驗中，在獸醫(yī)實驗室中，利用該方式對疫病進行檢測和診斷，具有高靈敏度、操作簡便的優(yōu)勢。本文重點分析獸醫(yī)實驗室酶聯(lián)免疫吸附試驗操作要點。

酶聯(lián)免疫吸附試驗 獸醫(yī) 要點分析

1 前言

酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）具備靈敏度高、操作簡單和良好的特異性。ELISA被廣泛應用于疫病免疫抗體檢測以及診斷中，但由于檢測過程中可能會出現(xiàn)較多的失誤，導致問題的出現(xiàn)，為進一步控制ELISA準確性，本文重點對獸醫(yī)實驗室酶聯(lián)免疫吸附試驗操作要點進行探究。

2 樣品基本知識

主要介紹樣品采集、處理以及保存的知識，ELISA測定樣品很多，如血清、尿液、唾液、排泄物等。部分樣品可直接開展ELISA檢測，比如血清；而部分則需要經(jīng)過預處理，比如糞便。獸醫(yī)實驗室一般根據(jù)常規(guī)方式采集樣品。禽類采心臟、翅靜脈采血的方式。比如豬采前臂靜脈等處血；羊取頸靜脈血；牛頸靜脈、尾靜脈血。將血清分離時，避免出現(xiàn)溶血。現(xiàn)階段，ELISA試劑盒多數(shù)使用的辣根過氧化物酶作為標記，紅細胞溶解就會釋放出較多的過氧化酶活性物質，在ELISA檢測中，溶血的會造成非特異性顯色，導致假陽性出現(xiàn)，最后很難得到精確的檢測結果。因此，采集來的血清樣品要在一定的時間內完成檢測，確保血清的有效性。血清存于冰箱時間過長，血清免疫球蛋白可能會出現(xiàn)聚合的情況，若5d內完成的檢測血清樣品，要將至放于4℃環(huán)境中的；超過7d則要將之放于-20℃環(huán)境下存放。凍結血清樣品后，蛋白質有局部濃縮不勻的現(xiàn)象出現(xiàn)，就要將之輕輕來回墊顛倒讓其充分混合，動作幅度不宜過大。血清樣品反復冰凍對抗體有效性有影響，因此檢測抗體血清樣品要做幾次檢測；同時要確保血清的純度，不得有渾濁物在其中，避免假陽性反應。

3 操作要點

3.1 加樣

加樣是試驗結果的重要因素，選擇移液器方面，盡量選取與加樣量接近的移液器；盡量使用統(tǒng)一移液器，加樣姿勢一致。另外，取樣時，移液器槍頭要與取液板保持垂直，有利于液體體積平衡；與此同時，加樣時，槍頭與ELISA板孔保持垂直的，有助于將之加到板孔底部，過程中要仔細不要液體涂到孔壁上。最后，加不同加樣，要更換槍頭，避免發(fā)生交叉感染；而加樣量小，盡量的應用倒退移液方法。

3.2 溫育

溫育是講抗原與抗體混合，在一定條件下進行的抗原抗體反應。實驗室一般在4℃、37℃以及43℃的情況下，開展ELISA反應的溫育操作。溫育過程中，除了確保反應溫度及時間，同時還要注意反應樣品在溫育溫度下要快速達到平衡，一次不能增加太多反應板疊塊在培養(yǎng)箱中。并根據(jù)ELISA規(guī)定的要求，室溫進行溫育反應，嚴格控制溫度，確保試驗結果的精確度。試驗中溫育的溫度與時間要嚴格控制，確保試驗精確性，溫育避免發(fā)生有蒸發(fā)的情況，并采用的塑料貼紙或者是保鮮膜將板孔覆蓋，并將ELISA板放于濕盒內部。

3.3 洗滌

ELISA試驗時，洗滌主要是為了將吸附在反應板上的污物，因此，洗滌效果對于ELISA試驗結果是非常關鍵的作用。而洗滌過程中，試驗操作人員要根據(jù)規(guī)定備好洗滌液，完成規(guī)定洗滌次數(shù)及，并于規(guī)定時間內完成。開展ELISA試驗，可將浸泡時間加長以及增加洗滌次數(shù)，有助于減少反應本底讀數(shù)[1]。

3.4 顯色和比色

酶催化無色底物，并生成有色產(chǎn)物的這一過程即為顯色。出現(xiàn)顯色主要是受到顯色反應溫度和時間。定性ELISA試驗中，顯色于室溫即可開展，根據(jù)陰性、陽性對比孔顯色的情況及時對反應時間進行調整。但在ELISA試驗中一定要按照的說明書進行，確保顯色反應的溫度和時間，保證得到有效的試驗結果。酶標儀器放于通風、避免陽光照射處，儀器溫度保持在15℃～30℃范圍內。比色前將酶標儀預熱15～30min，保證測度結果。比色前，將底物對照孔和空白孔相關信息詳細登記，并將本次試驗的試劑情況。每一次試驗比色前使用潔凈吸水紙將板底液體吸凈。

4 規(guī)范操作要點措施

而在檢測的過程中，質量控制極為關鍵，直接關系到檢測結果的準確性，對質量控制體系進行建立與完善，使各項檢測操作能夠按照相關規(guī)定規(guī)范進行。（2）不斷加大檢驗人員的培訓力度，提升其檢測技術與責任意識，使其能夠嚴格規(guī)范各項操作，規(guī)范應用各項檢測設備進行檢測。（3）對試劑、質量控制產(chǎn)品進行合理選擇，保證其穩(wěn)定性與可靠性，并注重管理。（4）定期對室內質量控制情況進行分析，總結其中失控的原因，如溫育時間與溫度控制不準確、血清反復凍融等，及時對改進、糾正的措施進行制訂，以對ELISA檢測室內質量進行有效控制[2]。

5 結語

在ELISA檢測中，開展監(jiān)測質量控制是重要環(huán)節(jié)，是保證檢測精確性的關鍵。ELISA檢測的操作要點分析中包括加樣、洗滌、顯色和比色等內容，開展ELISA試驗，針對以上各要點，一定更要選取品質優(yōu)良的ELISA試劑盒；并定期檢查移液器、溫箱、酶標儀器等，試驗過程中按照規(guī)定嚴格控制實驗室環(huán)境溫度、濕度；提升試驗人員的操作試驗的專業(yè)度?？傊?，要保證得到優(yōu)質的ELISA檢測結果，就要選擇優(yōu)質試劑、儀器并實施嚴格的操作，對保證和提升ELISA檢測結果準確率具有十分重要的意義。

[1]杜敏，馬耀斌.淺析實驗室常規(guī)ELISA檢測[J].獸醫(yī)導刊，2016，5（12）：214.

[2]喬麗.淺談獸醫(yī)實驗室工作幾點注意事項[J].中國畜牧獸醫(yī)文摘，2016，32（12）：148.